BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat
1. Penelitian tahap
1.1. Penyiapan antigen VNN
Virus VNN diperoleh dari ikan kerapu yang terinfeksi VNN, ikan-ikan kerapu tersebut diperoleh dari perairan Situbondo. Keberadaan virus VNN pada ikan kerapu diperiksa dengan metode PCR. Otak dan retina mata ikan kerapu yang terinfeksi VNN diambil menggunakan pinset steril. Sekitar 1 g organ otak/retina mata ikan dimasukkan ke dalam tube dan digerus menggunakan pellet pestle sampai halus dan ditambahkan bufer fosfat salin (PBS) sampai volume 1
mL (pengenceran 1:1). Suspensi dihomogenasi menggunakan vorteks dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 g selama 10-15 menit. Supernatan dipindahkan pada tube baru dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 27000 g selama 20-30 menit. Supernatan yang dihasilkan disaring menggunakan filter ukuran 0,22 µm. Filtrat yang dihasilkan dapat digunakan untuk reinfeksi atau disimpan pada -20oC hingga akan digunakan (OIE 2003). Absorbsi Filtrat ikan sehat RT PCR Antigen VNN rekombinan ELISA Produksi antibodi anti VNN Western Blotting SDS PAGE AGPT Antibodi poliklonal anti VNN (kelinci) Ekspresi protein antigen VNN Telur ikan Antigen virus utuh
Virus VNN Benih kerapu Antibodi poliklonal anti VNN (kelinci) telah diabsorbsi Ikan kerapu mRNA U ji t a n ta n g
1.2. Penyiapan plasmid rekombinan 1.2.1. Pembiakan bakteri rekombinan
Pembiakan bakteri yang memproduksi plasmid konstruksi vaksin DNA dilakukan dengan menginokulasikan 1 ose bakteri Escherichia coli DH5α pada
media 2xYT steril (16 g trypton, 10 g yeast extract, 5 g NaCl, 1000 mL akuades)
(Nuryati et al. 2010). Bakteri diinkubasi dan dikocok menggunakan shaker
dengan kecepatan 250 rpm selama 17-18 jam pada suhu 37ºC. 1.2.2. Isolasi Plasmid
Isolasi plasmid dilakukan sesuai protokol illustra plasmidPrep Mini Spin
Kit ,dari GE Healthcare. Bakteri diendapkan menggunakan sentifugasi dengan
kecepatan 16000 g selama 30 detik. Pelet bakteri diresuspensi dengan menambahkan lysis buffer tipe 7 sebanyak 175 µL, kemudian ke dalam suspensi
tersebut ditambahkan 175 µL lysis buffer tipe 8, dan 175 µL lysis buffer tipe 9,
serta dilakukan pencampuran secara perlahan. Suspensi tersebut selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 16000 g selama 4 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam plasmid mini column dan disentrifugasi pada 16000 g selama 30 detik,
dan cairan yang diperoleh dalam collection tube dibuang. Selanjutnya, ke dalam plasmid mini column ditambahkan 400 µL lysis buffer tipe 9, kemudian dikocok
dengan perlahan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 16000 g selama 30 detik, dan cairan yang tertampung pada collection tube dibuang. Bufer pencuci
tipe 1 selanjutnya ditambahkan sebanyak 400 µL dan disentrifugasi kembali pada 16000 g selama 1 menit. Cairan dalam collection tube dibuang beserta
tabungnya. Plasmid mini column dipindahkan ke tabung yang baru dan
ditambahkan 100 µL elution buffer tipe 4, kemudian didiamkan selama 30 detik
pada suhu ruang. Plasmid mini column kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
16000 g selama 30 detik. Supernatan hasil sentrifugasi merupakan plasmid DNA murni yang siap digunakan. Plasmid tersebut disimpan pada suhu -20oC sampai saat akan digunakan.
22
1.2.3. Produksi antibodi poliklonal
Produksi antibodi poliklonal anti VNN dilakukan menggunakan 1 ekor kelinci New Zealand bobot 3 kg. Hewan coba diimunisasi dengan suspensi virus VNN. Pada imunisasi pertama dilakukan dengan dosis 33,5 µg/ kg bobot badan pada rute subcutan (SC) menggunakan suspensi virus yang diemulsi dalam Freund’s adjuvant complete. Pada minggu ke-4 dilakukan imunisasi kedua
mengunakan suspensi virus dan dosis yang sama, tetapi filtrat virus diemulsi dengan Freund’s adjuvant incomplete, selanjutnya pada minggu ke-7 kelinci
diimunisasi kembali. Dua minggu setelah imunisasi ketiga hewan coba diambil darahnya dari vena auricularis (telinga). Darah diinkubasi pada suhu ruang
selama 1 jam kemudian diinkubasi dalam suhu 4ºC selama semalam hingga tampak adanya serum dalam syringe. Serum dipisahkan dari bekuan darah dan diuji keberadaan antibodinya terhadap VNN dengan uji agar gel presipitasi (agar gel presipitation test/AGPT). Hasil uji AGPT dinyatakan positif terbentuk
antibodi bila ditemukan garis presipitasi antara sumuran antigen dengan serum yang diuji. Kelinci yang telah membentuk antibodi terhadap VNN selanjutnya akan diambil darahnya untuk dipanen serum sebanyak-banyaknya. Serum yang diperoleh selanjutnya akan diabsorbsi dengan supernatan dari suspensi mata dan otak ikan kerapu sehat (diuji dengan PCR tidak terinfeksi VNN) untuk menetralkan antibodi anti protein ikan yang mungkin terbentuk, karena suspensi antigen suspensi virus awalnya diperoleh dari suspensi ikan sakit.
Suspensi protein ikan sehat diperoleh dengan cara mengambil mata dan otak ikan kerapu sehat, digerus selanjutnya disuspensikan dalam PBS 1:1 serta disentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan selanjutnya digunakan untuk mengabsorbsi serum tersebut. Absorbsi dilakukan dengan mencampurkan serum yang positif terhadap VNN dan suspensi protein ikan dengan perbandingan 1:1, diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit, selanjutnya disentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit. Campuran serum yang telah disentrifugasi diuji kembali keberadaan Ab anti VNN dengan uji AGPT. Serum yang menunjukan positif terdapat Ab dialiquot dan disimpan pada suhu -20ºC sampai saat akan digunakan.
1.2.4. Deteksi ekspresi protein CP dari virus VNN
a. Mikroinjeksi embrio ikan lele
Deteksi ekspresi protein CP dilakukan menggunakan embrio ikan lele dengan pertimbangan kemudahan dalam memperoleh induk ikan matang kelamin dan induksi ovulasi. Embrio ikan lele diperoleh melalui pemijahan buatan di BBPBAT Sukabumi. Plasmid konstruksi vaksin DNA diinjeksi menggunakan mikromanipulator ke telur ikan lele untuk memproduksi protein CP VNN. Mikroinjeksi dilakukan mengikuti metode Gusrina et al. (2009), Larutan plasmid
DNA murni yang akan diinjeksikan ke telur ikan lele masing-masing mengandung konstruksi plasmid pJfKer-PCV dan pmBA-PCV konsentrasi 50 ng/µL dengan pelarut 1 M KCl, dan selanjutnya larutan DNA sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam jarum mikroinjeksi dan kemudian dipasang pada mikromanipulator. Embrio ikan diatur dalam plate agarose (konsentrasi 2%) yang dibuat cekungan
pada bagian tengahnya, berfungsi sebagai tempat meletakkan telur dan memudahkan proses injeksi. Proses mikroinjeksi dilakukan di bawah mikroskop. Larutan DNA diinjeksikan ke dalam blastodisk embrio, fase pembelahan 1 sampai 2 sel.
b. Analisis ekspresi protein CP VNN
Ekspresi protein CP VNN dideteksi mengunakan metode SDS-PAGE dilanjutkan dengan Western Blotting.
b.1. Isolasi protein CP VNN
Embrio ikan lele yang telah diinjeksi dengan plasmid pJfKer-PCV dan pmBA-PCV dikoleksi pada jam ke-6, 8, 10, 12, 14, dan 16 setelah mikroinjeksi. Embrio-embrio tersebut digerus dan dibuat suspensi 10% dengan PBS (pH 7,4). Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 5000 g selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tube baru dan selanjutnya diukur konsentrasi proteinnya menggunakan metode Bradford.
24
b.2. Deteksi protein CP VNN dengan metode SDS-PAGE
Protein CP VNN berdasarkan penelitian Lee et al. (2002), Huang et al.
(2007), Lin et al. (2007) berukuran sekitar 42 kDa. Keberadaan protein CP VNN
dideteksi menggunakan metode SDS-PAGE sesuai Laemmli (1970).
Sebanyak 20 µl sampel dengan konsentrasi 10 µg/mL dari masing-masing waktu pengambilan ditambahkan dengan 5 µL bufer sampel ditangas 95ºC selama 2 menit. Sampel yang telah ditangas dimasukkan ke dalam sumuran gel elektroforesis yang terdiri dari gel pengumpul (konsentrasi 4%) dan gel pemisah (konsentrasi 7,5%-17,5%). Gel dilarikan dalam alat elektoforesis pada arus tegangan 160 Volt selama 60 menit. Setelah elektroforesis berakhir, gel direndam dalam pewarna coomassie brilian blue R-250 selama 3 jam pada suhu ruang
sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat metanol 25% dan asam asetat 12% sampai gel berwarna bening dan pita-pita protein yang terbentuk terlihat jelas. Mobilitas relatif protein pada telur dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, yaitu dihitung dari garis awal gel pemisah sampai dengan ujung protein dan dibandingkan dengan jarak migrasi protein penanda (marker). Tertranslasinya
protein CP VNN dilihat dari munculnya pita protein sebesar 42 kDa. b.3. Analisis Western blotting
Protein telur yang telah dielektroforesis dengan teknik SDS-PAGE selanjutnya dipindahkan ke membran nitroselulosa menggunakan Transblot
(Biorad). Membran nitroselulose diinkubasi dalam 5% larutan blocking selama 60
menit kemudian direndam dalam larutan serum kelinci anti VNN (pengenceran 1:50 (800 µL antibodi primer : 20 mL larutan blocking) serta diinkubasikan
selama semalam dan diagitasi perlahan. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan 0,1% PBS Tween. Membran nitroselulose diinkubasi dengan antibodi sekunder anti rabbit peroksidase pada pengenceran 1:5000 selama 1 jam. Membran dicuci kembali dengan 0,1% PBS Tween dan diinkubasi dengan substrat yang mengandung AP Buffer 20 mL, NBT 66 uL, BCIP 132 uL selama 20 menit. Deteksi dilakukan secara visual. Reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil pewarnaan yang selanjutnya didokumentasikan.
2. Penelitian tahap II