c Terpenoid/Steroid
B. Metode Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan terdiri atas tahap pemberian perlakuan terhadap sampel segar dan tahap pengekstraksian sampel bubuk buah takokak. Tahap pemberian perlakuan sampel segar bertujuan untuk mengidentifikasi dan memperoleh komponen bioaktif buah takokak dengan memberikan pengaruh penghancuran pada sebagian sampelnya, sehingga dapat diketahui dampaknya dan perbedaannya terhadap kandungan komponen bioaktif dengan buah yang tidak mengalami proses penghancuran. Tahap ini dilakukan dengan membagi sampel menjadi dua perlakuan, yaitu sebagian sampel dalam kondisi buah takokak segar yang tidak dihancurkan dan sebagian lagi dalam kondisi buah takokak segar yang dihancurkan. Lalu, kedua sampel tersebut dianalisis kadar air segarnya. Selanjutnya, sampel buah takokak segar dan hancuran buah takokak segar mengalami proses pengeringan beku menjadi sampel bubuk dan dilakukannya beberapa analisis, seperti analisis kadar air sampel bubuk, total antosianin, total asam askorbat, protein Lowry, dan aktivitas PAL. Hasil analisis yang diperoleh ini untuk selanjutnya dianalisis secara statistik dengan uji t-test, sehingga diketahui perbedaan antara buah dan hancuran buah terhadap total antosianin, total asam askorbat, dan aktivitas PAL-nya.
Tahap berikutnya adalah tahap pengekstraksian sampel bubuk dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol, etil asetat, dan heksan, sehingga diperoleh sampel ekstrak dari masing- masing pelarut. Tujuan tahap ekstraksi sampel untuk memperoleh zat atau senyawa kimia (fitokimia) yang berperan sebagai metabolit sekunder dari ekstrak, sehingga dapat diketahui pula perubahan senyawa tersebut dan kadar serta aktivitas antioksidan pada hancuran buah. Sampel ekstrak dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui kandungan fitokimianya dan secara kuantitatif dengan mengetahui nilai total fenol ekstrak. Hasil ekstraksi yang diperoleh akan diketahui yield tertingginya untuk kemudian sampelnya digunakan dalam analisis aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak. Yield ekstrak tertinggi diperoleh dari sampel ekstrak metanol untuk buah dan hancuran buah takokak. Hasil analisis dilanjutkan dengan uji statistik berupa ANOVA untuk total fenol ekstrak dan yield ekstrak. Hasil analisis menunjukkan adanya variasi dan perbedaan total senyawa fenolik dan yield akibat pengaruh perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis ekstrak. Total fenol dan yield ekstrak digunakan untuk perhitungan total fenol buah dan hancuran buah takokak. Hasil perhitungan tersebut lalu dianalisis secara statistik dengan uji t-test. Begitu pula dengan nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak yang juga dianalisis secara statistik dengan uji t-test. Dengan demikian, dapat diketahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak akibat proses penghancuran. Tahap-tahap penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 7.
12
1.
Pemberian Perlakuan Sampel Segar
Kondisi awal sampel buah takokak yang digunakan adalah sampel segar. Kemudian, sampel segar ini dibuat menjadi dua perlakuan berupa buah utuh atau tanpa proses penghancuran dan hancuran buah. Tujuannya untuk mengidentifikasi dan memperoleh komponen bioaktif buah takokak dengan memberikan pengaruh penghancuran pada sebagian sampelnya, sehingga dapat diketahui dampaknya dan perbedaannya terhadap kandungan komponen bioaktif dengan buah yang tidak mengalami proses penghancuran.
Tahap ini diawali dengan penimbangan sampel segar buah takokak yang telah dipisahkan dari tangkainya sebanyak 1-2 kg, lalu sampel dicuci bersih dan ditiriskan. Selanjutnya, buah takokak dibagi menjadi dua perlakuan, yaitu sebagian dalam keadaan buah utuh dan sebagian lagi dihancurkan dengan blender basah menjadi hancuran buah. Proses penghancuran buah takokak dengan menghancurkan sampel secara bertahap atau sedikit demi sedikit, yaitu sekitar 500 gram sampel
Gambar 7. Tahap-tahap penelitian aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak Buah takokak segar Pemberian perlakuan sampel segar Hancuran buah takokak segar
Kadar air sampel segar
Metode pengeringan beku sampel segar
Bubuk buah takokak Bubuk hancuran buah takokak Metode maserasi Pengekstraksian sampel bubuk Total fenol Kualitatif fitokimia Aktivitas antioksidan Total fenol Kualitatif fitokimia Total fenol Kualitatif fitokimia Bubuk buah takokak Bubuk hancuran buah takokak
Total asam askorbat Kadar air bubuk Total antosianin Protein Lowry Aktivitas PAL t-test t-test t-test ANOVA Ekstrak metanol Ekstrak etil asetat Ekstrak heksan ANOVA ANOVA t-test
13 dihancurkan selama ± 10-15 menit tanpa penambahan air hingga keseluruhan bentuk hancuran sampel yang diperoleh relatif sama (homogen) untuk setiap kali proses penghancurannya.
Sampel buah utuh dan hancuran buah yang telah diperoleh dimasukkan ke dalam plastik HDPE (bening) ukuran 1 kg, dimana hingga ¾ bagian plastik diisi oleh sampel. Khusus sampel hancuran buah dibuat rata atau pipih sesaat setelah dimasukkan ke dalam plastik agar pembekuan sampel nantinya lebih merata. Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam masing-masing plastik, secara bersamaan sampel lalu dimasukkan ke dalam freezer dan posisi sampel diletakkan dalam keadaan horizontal (mendatar). Selanjutnya, setiap sampel diukur pula kadar air segarnya, sehingga dapat diketahui kadar air buah segar dan hancuran buah segar takokak.
Sampel buah segar dan hancuran buah segar takokak dibekukan terlebih dahulu selama satu malam dalam freezer dan keesokan harinya dikeringkan dengan alat freeze dryer selama ± 48 jam. Sampel kering hasil pengeringan beku ini dihancurkan dengan blender kering untuk mendapatkan sampel bubuk takokak dan dimasukkan ke dalam kemasan alumunium foil. Lalu, sampel ini disimpan dalam freezer hingga diperoleh jumlah sampel yang relatif dapat mencukupi proses analisis sampel selanjutnya. Dengan kata lain, sampel diperoleh secara kumulatif dari hasil beberapa kali proses pengeringan beku. Sampel kering diayak dengan ayakan berukuran 20 mesh, sehingga diperoleh bubuk takokak berukuran homogen. Kemudian, sampel bubuk takokak dimasukkan kembali dalam kemasan alumunium foil dan disimpan dalam freezer, sehingga sampel lebih awet selama penyimpanan.
Sampel bubuk buah dan hancuran buah takokak ditentukan kadar airnya. Selain itu, beberapa analisis lainnya yang dilakukan dengan menggunakan sampel bubuk buah dan hancuran buah, antara lain analisis total antosianin, total asam askorbat, protein Lowry, dan aktivitas Phenylalanine
Ammonia Lyase (PAL).
2.
Pengekstraksian Sampel Bubuk
Tahap berikutnya adalah tahap pengekstraksian sampel bubuk takokak dengan beberapa pelarut organik. Hal ini bertujuan untuk memperoleh zat atau senyawa kimia (fitokimia) yang berperan sebagai metabolit sekunder dari ekstrak, sehingga dapat diketahui pula perubahan senyawa tersebut dan kadar serta aktivitas antioksidan pada hancuran buah. Tahap ekstraksi sampel dilakukan dengan melarutkan bubuk buah dan hancuran buah takokak dalam pelarut organik dengan perbandingan sampel dan pelarutnya 1:10 (Batubara et al. 2009 yang dimodifikasi).
Sampel bubuk ditimbang sebanyak ± 10 gram, lalu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan pelarut yang berbeda, yaitu metanol PA, etil asetat, dan heksan, sebanyak 100 ml sehingga sampel terendam sempurna dan ditutup dengan aluminium foil dan disimpan di dalam
shaker selama 24 jam pada suhu ruang kemudian disaring vakum. Ampas masing-masing sampel dimaserasi kembali selama 24 jam di dalam shaker pada suhu ruang dan diulangi hingga tiga kali, dimana larutan sampel menjadi berwarna pudar. Hasil filtrat masing-masing sampel diakumulasi dan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40°C untuk mendapatkan ekstrak pekatnya. Kemudian, sampel ekstrak buah dan hancuran buah takokak dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui komponen bioaktif (fitokimia) ekstrak dan secara kuantitatif berupa analisis total fenol ekstrak dan analisis aktivitas antioksidan ekstrak buah dan hancuran buah takokak.
14