3 POTENSI KHASIAT DAN MEKANISME
3.2.4 Penentuan aktivitas antioksidan kandidat ekstrak bahan aktif
3.2.4.2 Penentuan aktivitas antioksidan intraseluler
Aktivitas antioksidan intraseluler dinyatakan sebagai aktivitas penghambatan pembentukan radikal bebas dalam sel uji (sel HDFs). Uji ini didasarkan pada penghambatan pembentukan ROS yang terjadi selama paparan UV dalam sel HDFs. Senyawa antioksidan dalam bahan uji akan menghambat laju pembentukan ROS dalam sel HDFs akibat paparan UV tersebut. Penghambatan pembentukan ROS ini ditandai dengan penghambatan pembentukan DCF yang teridentifikasi sebagai rataan intensitas relatif fluorocence DCF bahan uji yang lebih rendah dibandingkan kontrol negatif. Uji ini mengadaptasi metode yang dikemukan oleh Shin et al. (2005b), Ho et al.(2005), dan Jeonget al. (2007).
Disiapkan 50 mL suspensi sel HDFs passage 14 dengan konsentrasi 105sel/mL dalam media DMEM. Disiapkan 2 buah 12-wel lmult well culture. Sebanyak 1 mL suspensi sel HDFs ditanam pada setiap sumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC dan kadar CO2 5%. Setelah 24 jam
media dibuang, lalu kultur sel dicuci dengan PBS dan diberikan 1 mL media DMEM tanpa serum, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam
kultur media dibuang dan diganti dengan media sesuai dengan perlakuan yang akan diberikan.
Kultur sel dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kontrol, kontrol negatif, perlakuan ekstrak Temu Ireng, dan perlakuan ekstrak Ki Urat yang masing- masing terdiri atas 4 kali pengulangan. Kontrol merupakan kultur sel HDFs yang hanya mendapat media DMEM. Kontrol negatif merupakan kultur sel HDFs hanya mendapat media DMEM dan paparan radiasi UV 100 mJ/cm2. Perlakuan ekstrak Temu Ireng merupakan kultur sel HDFs yang mendapat ekstrak Temu Ireng 100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV 100 mJ/cm2. Perlakuan ekstrak Ki Urat merupakan kultur sel HDFs yang mendapat esktrak Ki Urat 100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV 100 mJ/cm2. Kontrol ditempatkan pada 12-well multiwell culture pertama. Perlakuan ekstrak Temu Ireng, perlakuan ekstrak Ki Urat dan kontrol negatif ditempatkan pada12-well multiwell culturekedua.
Perlakuan ekstrak, kontrol negatif, dan kontrol diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam media dibuang dan kultur sel dicuci dengan PBS. Pada kultur sel ditambahkan 40 µM 2,7-dichlororofluorescein diacetate (DCFH- DA) dan diinkubasi selama 20 menit dalam ruang gelap pada temperatur 37°C. Setelah inkubasi, sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali. 12-well multiwell culture kedua diberikan paparan radiasi UV 100 mJ/cm2, untuk memacu terbentuknya radikal bebas, sedangkan 12-well multiwell culture pertama tidak diberikan paparan UV. Paparan UV dilakukan pada temperatur ruang. Tiga puluh menit setelah paparan UV, kultur sel HDFs dibilas dengan PBS sebanyak 3 kali. Hasil pewarnaan DCF diukur pada 485/530 DCF.Parameter yang diukur adalah intensitas relatif fluorocence DCF bahan uji terhadap kontrol.
Perbedaan rataan persentase intensitas relatif fluorocence DCF ekstrak dan kontrol negatif diuji dengan uji Duncan menggunakan perangkat lunak SPSS 17.0. Suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas antioksidan intraseluler bila memiliki rataan persentase intensitas relatif fluorocence DCF lebih kecil dan berbeda nyata dibandingkan kontrol negatif.
3.3 Hasil
3.3.1 Potensi kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging dalam
menghambat pembentukan MMP-1 dan menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipe I
Pengamatan kualitatif berdasarkan surfaceplot dan interactive 3D surface plot pita ekspresi MMP-1 menunjukkan bahwa aplikasi ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat berpotensi menghambat peningkatan ekspresi MMP-1 akibat paparan UV 60 mJ/cm2. Ekspresi MMP-1 perlakuan ekstrak Ki Urat pada paparan UV 60 mJ/cm2 lebih lemah dibandingkan ekstrak Temu Ireng. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Ki Urat memiliki kemampuan lebih baik dibandingkan ekstrak Temu Ireng dalam menghambat ekspresi MMP-1 pada kultur HaCaT akibat paparan UV. Hasil analisis kualitatif terhadap
ekspresi MMP-1 tersebut secara rinci dapat dilihat pada Lampiran 8.
Pengamatan kualitatif berdasarkanplotdan interactive 3D surface plot pita ekspresi prokolagen tipe I menunjukkan bahwa aplikasi ekstrak Temu
Ireng dan ekstrak Ki Urat dapat menghambat penurunan metabolisme prokolagen tipe I kultur sel HDFs pada paparan UV 100 mJ/Cm2. Ekspresi
prokolagen tipe I perlakuan ekstrak Ki Urat lebih kuat dibandingkan esktrak Temu Ireng. Hal ini menunjukkan bahwa aplikasi ekstrak Ki Urat lebih dapat mempertahankan ekspresi prokolagen tipe I dibandingkan ekstrak Temu Ireng. Hasil analisis kualitatif terhadap ekspresi prokolagen tipe I tersebut secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 10.
Hasil pengukuran kuantitaf terhadap pita ekspresi MMP-1 dan ekspresi prokolagen tipe I perlakuan ditampilkan pada Tabel 2 berikut.
Tabel 2 Rataan ekspresi MMP-1 dan ekspresi prokolagen tipe I pada penentuan potensi kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging
dalam penghambatan pembentukan MMP-1 dan penghambatan penurunan pembentukan prokolagen tipe I
Perlakuan Ekspresi MMP-1
(103pixel)
Ekspresi prokolagen tipe I (103pixel)
Kontrol 19.26±6.58ab 32.81±9.42a
Kontrol negatif 27.75±4.09a 7.84±7.11b
Ekstrak Temu Ireng 18.41±7.68ab 19.81±3.08b
Ekstrak Ki Urat 12.07±5.31b 36.70±5.05a
Ket: Kontrol adalah kultur sel uji yang hanya mendapat media DMEM; Kontrol negatif adalah kultur sel uji yang mendapat media DMEM dan paparan UV 100 mJ/cm2; Ekstrak Temu Ireng adalah kultur sel uji yang mendapat ekstrak Temu Ireng 100 ppm dan paparan UV 100 mJ/cm2; ekstrak Ki Urat adalah kultur sel uji yang mendapat ekstrak Ki Urat 100 ppm dan paparan UV 100 mJ/cm2. Data dinyatakan sebagai rataan ± simpangan baku. Huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan hasil uji Duncan pada taraf keberartian 0.05
Berdasarkan data Tabel 2 di atas terlihat bahwa rataan ekspresi MMP-1 perlakuan ekstrak Ki Urat (12.07 x 103pixel) lebih rendah dan berbeda nyata dibandingkan rataan ekspresi MMP-1 kontrol negatif (27.75 x 103pixel). Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan ekstrak Ki Urat dapat menghambat pembentukan MMP-1 akibat paparan UV pada sel HaCaT. Rataan ekspresi MMP-1 pada perlakuan ekstrak Temu Ireng (18.41 x 103pixel) tidak berbeda nyata dibandingkan rataan ekspresi MMP-1 kontrol (19.26 x 103 pixel) dan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Temu Ireng tidak memiliki potensi menghambat pembentukan MMP-1. Data lengkap perhitungan tersebut dapat dilihat pada Lampiran 9.
Berdasarkan data Tabel 2 di atas, diketahui bahwa rataan ekspresi prokolagen tipe I pada perlakuan ekstrak Ki Urat (36.70 x 103 pixel) lebih tinggi dan berbeda nyata dibandingkan kontrol negatif (7.84 x 103 pixel). Rataan ekspresi prokolagen tipe I pada perlakuan ekstrak Ki Urat tidak berbeda nyata dibandingkan kontrol (32.81 x 103pixel). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Ki Urat memiliki aktivitas menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipe I pada kultur sel HDFs akibat paparan UV 100 mJ/cm2.
Ekspresi prokolagen tipe I pada perlakuan ekstrak Temu Ireng (19.81 x 103 pixel) tidak berbeda nyata dibandingkan kontrol negatif. Ekspresi prokolagen tipe I pada perlakuan ekstrak Temu Ireng lebih rendah dan berbeda nyata dibandingkan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan ekstrak
konsentrasi 100 ppm, persentase aktivitas antioksidan ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat masing-masing adalah 50.53% dan 61.44%. Hal ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi 100 ppm aktivitas antioksidan kedua ekstrak di atas 50%. Fakta menunjukkan bahwa kedua kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging ini memiliki potensi antioksidan yang tinggi.