JJ. KOMPONEN BIOAKTIF DALAM BUMBU RENDANG
B. PENGARUH EKSTRAK SAMPEL TERHADAP PROLIFERASI LIMFOSIT MANUSIA
Pengujian dengan menggunakan sel limfosit secara in vitro membutuhkan keadaan yang sama seperti lingkungan dalam tubuh. Tujuannya adalah agar proses biologis yang terjadi di dalam kultur sel berlangsung mendekati keadaan sebenarnya di dalam tubuh. Kondisi yang perlu diatur tersebut diantaranya adalah pH, nutrisi, dan fase gas yang sesuai untuk pertumbuhan sel (Freshney, 1994).
Darah yang akan diisolasi sel limfositnya diambil secara aseptis di klinik Farfa Dramaga oleh seorang suster dari donor pria sehat. Darah ini dimasukkan dalam tabung vacutainer steril. Darah ini kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi 1500 rpm selama 5 menit, kemudian didapatkan darah yang terpisah seperti terlihat pada gambar 7.
70
Gambar 7. Pemisahan darah manusia setelah disentrifugasi
Pemisahan sel limfosit dari sel-sel darah lain dilakukan dengan menggunakan larutan ficoll (Histopaque). Larutan ini memiliki densitas 1.077 + 0.0001 g/ml sehingga mampu menahan sel-sel agranulosit yang berdensitas rendah seperti limfosit untuk berada tetap dibagian atas, sedangkan sel-sel granulosit yang berdensitas lebih tinggi akan menembus ficoll. Hasil pemisahan darah menggunakan ficoll dapat dilihat pada gambar 8.
Gambar 8. Pemisahan limfosit dengan ficoll (Histopaque)
Volume total kultur sel pada penelitian ini adalah 100 l untuk setiap sumur. Jumlah sel limfosit hidup yang dikultur pada penelitian ini adalah 2 x 106 sel/ml. Jumlah limfosit yang hidup ini disesuaikan dengan penelitian yang dilakukan oleh Meiriana (2006). Dengan jumlah sel tersebut, diharapkan sel limfosit akan
Plasma
Buffycoat
Eritrosit
71
mampu bertahan hidup dan melewati siklus hidupnya dalam waktu inkubasi selama 72 jam. Pemilihan waktu inkubasi 72 jam ini disesuaikan dengan perkiraan berkurangnya zat-zat gizi dari medium untuk mendukung proses pertumbuhan sel. Menurut Freshney (1994), medium pertumbuhan sel limfosit berfungsi maksimal selama tiga hari. Volume sel limfosit yang ditambahkan ke dalam sumur adalah 80 l. Jumlah sel limfosit hidup setelah ditambahkan ekstrak akan dibandingkan dengan jumlah sel limfosit yang hidup tanpa penambahan ekstrak dengan melihat peningkatan ataupun penurunan jumlahnya selama 72 jam.
Prinsip metode MTT didasarkan pada penyerapan warna biru dari kristal formazan blue yang dihasilkan dari reaksi antara enzim suksinat dehidrogenase dengan garam tetrazolium (MTT). Sebelum perhitungan, dilakukan penambahan HCL-isopropanol pada kultur sel. Tujuan penambahan ini untuk melarutkan kristal biru formazan yang terbentuk dan untuk melisiskan sel limfosit (Kasugai et al., 1990).
Hasil absorbansi yang didapatkan dari pembacaan oleh
Spectrophotometer Microplate Reader kemudian diolah sehingga
menghasilkan data Indeks Stimulasi (I.S). Dari pengujian yang telah dilakukan, didapatkan hasil seperti dapat dilihat pada gambar 9.
72
Gambar 9. Grafik perbandingan Indeks Stimulasi proliferasi limfosit
Dari gambar 9 dapat dilihat bahwa pada pengenceran 1x (ekstrak sampel tanpa pengenceran), sampel yang memiliki indeks stimulasi paling tinggi adalah sampel No Label 14 Juni 2007 (2,078). Sementara itu, sampel DIPA 14 Juni 2007 (1,742) memiliki indeks stimulasi terbesar kedua setelah sampel No Label 14 Juni 2007. Setelah itu, diikuti oleh sampel 11 Nov 2006 (1,452), kontrol rendang (1,255), kontrol positif PWM (1,205) dan kontrol positif LPS (1,053).
Nilai indeks stimulasi sampel No Label 14 Juni 2007 dan DIPA 14 Juni 2007 tidak jauh berbeda. Demikian pula dengan pola indeks stimulasi yang diakibatkan oleh pengenceran sampel. Hal ini dikarenakan kedua sampel tersebut memiliki tanggal penyinaran yang sama, yang artinya diiradiasi pada hari yang sama. Perbedaan
73
dari kedua sampel tersebut hanyalah adanya label pada kemasan atau tidak.
Secara umum, dapat dikatakan bahwa pola indeks stimulasi terhadap pengenceran umumnya dapat dikatakan menurun, kecuali pada sampel 11 Nov 06. Sampel 11 Nov 06 memiliki pola respon indeks stimulasi terhadap pengenceran yang berbeda di antara sampel yang lain, termasuk sampel kontrol rendang. Pola indeks stimulasi sampel ini meningkat dengan menurunnya konsentrasi ekstrak sampel. Hal ini berarti dengan menurunnya konsentrasi ekstrak sampel pada kultur, maka limfosit berproliferasi semakin tinggi. Tetapi, jika dibandingkan dengan indeks stimulasi sampel kontrol rendang, indeks stimulasi sampel 11 Nov 06 ini masih memiliki indeks stimulasi yang lebih besar, sehingga masih dapat dikatakan lebih baik daripada sampel kontrol rendang dalam hal memicu proliferasi limfosit. Akan tetapi, menurut analisis statistik menggunakan ANOVA dengan selang kepercayaan 95%, perbedaan antara kedua sampel tersebut tidak dapat dikatakan signifikan.
Jika dibandingkan dengan kontrol positif yaitu LPS dan PWM, sampel rendang iradiasi dengan berbagai tanggal iradiasi mampu meningkatkan proliferasi sel limfosit manusia lebih dari peningkatan yang dilakukan oleh LPS dan PWM. Kontrol positif merupakan sel limfosit yang ditambahkan mitogen agar proliferasi sel meningkat.
Pada gambar 7 dapat dilihat bahwa kontrol positif PWM memiliki indeks stimulasi yang lebih besar daripada LPS. Hal ini sesuai dengan pernyataan Ganong (1979) yaitu PWM memiliki kemampuan memicu proliferasi sel B dan T, sedangkan LPS hanya mampu memicu proliferasi sel B saja, sehingga jika ditambahkan ke jumlah sel yang sama, diperkirakan PWM akan memiliki indeks stimulasi yang lebih besar daripada LPS.
74
Proses iradiasi dapat menghasilkan radikal bebas. Elektron yang berenergi tinggi menjadikan molekul air sebagai target. Sinar gamma dapat memecah molekul air menjadi radikal bebas dan ion. Energi aktivasi dibutuhkan untuk menghasilkan radikal bebas. Ikatan jamak karbon-karbon yang kekurangan elektron pada asam lemak tidak jenuh dan gugus karbonil (asam lemak dan asam amino) sangat rentan terhadap serangan radikal bebas. Selain merupakan agen pengoksidasi kuat yang sangat reaktif terhadap sistem terkonjugasi, elektron bebas aqueous juga dihasilkan dari radiolisis air. Elektron aqueous sangat reaktif dengan senyawa aromatik, asam karboksilat, keton, aldehida, tiol dan hidrogen bebas, yang dapat menempel pada system terkonjugasi atau melepaskan hidrogen dari ikatan C-H dan S-H (Thakur dan Singh, 1994). Interaksi dengan radikal bebas yang dihasilkan oleh radiolisis air dapat meningkatkan pembentukan hidrogen peroksida. Atom hidrogen yang terbentuk secara radiolitik dari air dapat bereaksi dengan oksigen terlarut untuk membentuk radikal hidroperoksi yang akan berekuilibrasi dengan radikal superoksida. Radikal hidroperoksi dapat meningkatkan hidrogen peroksida (Thakur dan Singh, 1994).
Kemungkinannya adalah, dengan penambahan air dengan peningkatan pengenceran, jika masih terdapat radikal bebas dalam matriks pangan iradiasi, maka air merupakan substrat yang dapat diserang sehingga menghasilkan hidrogen peroksida yang dapat menghambat proliferasi limfosit. Studi yang dilakukan oleh Nelson
et al. (1984) menunjukkan efek penghambatan oleh mannan khamir
terhadap respon proliferatif limfosit akibat adanya produksi hidrogen peroksida yang ditingkatkan oleh kompleks mannan-tembaga.
Uji statistik dilakukan pada pengujian pengaruh ekstrak rendang iradiasi terhadap proliferasi sel limfosit. Uji ini dilakukan untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang signifikan antara
75
sampel pada pengenceran yang sama. Kemudian, juga dilakukan uji statistik untuk melihat apakah pengenceran berpengaruh signifikan terhadap indeks stimulasi proliferasi limfosit manusia. Dari uji statistik yang dilakukan dengan metode Tukey, ketiga sampel rendang iradiasi tidak berbeda nyata terhadap sampel rendang non-iradiasi pada selang kepercayaan 95%. Akan tetapi, sampel No Label 14 Juni 2007 jika dibandingkan dengan LPS dan kontrol standar, yaitu limfosit tanpa penambahan ekstrak sampel maupun mitogen, berbeda secara nyata pada selang kepercayaan 95%. Hal ini berarti ekstrak sampel No Label 14 Juni 2007 berpengaruh nyata terhadap proliferasi sel limfosit, dalam hal ini yaitu meningkatkan proliferasi sel limfosit. Perbedaan ini ketika diuji pada selang kepercayaan 99% tidak signifikan yang artinya pada selang kepercayaan 99%, semua sampel pada pengenceran 1x tidak berpengaruh nyata terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit manusia.
Pengamatan pada pengenceran 2x dan 4x memperlihatkan bahwa ekstrak sampel 11 Nov 2006, DIPA 14 Juni 2007 dan Kontrol Rendang tidak berbeda nyata dengan ekstrak pada pengenceran 1x. Akan tetapi ekstrak sampel No Label menunjukkan hasil yang berbeda nyata dibandingkan dengan sampel pada pengenceran 1x pada selang kepercayaan 95%, tetapi tidak signifikan pada selang kepercayaan 99%. Hasil uji statistik ini dapat dilihat pada lampiran.
Dengan demikian, dari pengujian ekstrak rendang terhadap limfosit dapat disimpulkan bahwa sampel iradiasi tidak menghambat proliferasi sel limfosit manusia, dan tidak meningkatkan proliferasi limfosit secara signifikan dibandingkan dengan kontrol rendang non-iradiasi pada ekstrak sampel tanpa pengenceran (pengenceran 1x) dengan selang kepercayaan 99%.
Penelitian mengenai pengaruh ekstrak pangan iradiasi secara
76
terhadap produk hasil radiolysis seperti 2-ACB, atau pengujian pangan iradiasi dilakukan secara in vivo. Akan tetapi, penelitian mengenai pengaruh bahan terhadap proliferasi sel biasa digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan memiliki sifat sitotoksik. Penelitian yang dilakukan oleh Meiriana (2006) menguji ekstrak buah merah terhadap proliferasi limfosit yang memberikan hasil ekstrak buah merah tidak menyebabkan toksik bagi sel limfosit karena sel mampu berproliferasi terlebih dahulu sebelum mengalami kematian. Sementara penelitian Krismawati (2007) menggunakan limfosit untuk menguji toksisitas dari ekstrak bunga kecombrang, kemuning, daun jati belanda, delima putih dan ceremai. Penelitian mengenai sifat sitotoksik suatu ekstrak dapat juga menggunakan sel lain selain limfosit, misalnya dalam penelitian Kasugai et al. (1990) menggunakan metode proliferasi sel fibroblas gigi tikus untuk menguji toksisitas eugenol.
C. PENGARUH EKSTRAK SAMPEL TERHADAP HEMOLISIS