Teknik yang sangat luas digunakan melibatkan penggunaan garam tetrazolium (MTT atau [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] yang dimetabolisme menjadi garam formazan berwarna oleh
aktivitas enzim mitokondria pada sel hidup. Metode ini pertama kali digunakan pada tahun 1983 sebagai metode kolorimetri yang cepat untuk penelitian bidang imunologi dan modifikasi penggunaan metode ini telah banyak diaplikasikan. Teknik ini sangat berguna khususnya untuk menguji suspensi sel karena spesifisitasnya terhadap sel hidup. Pertimbangan ini tidak begitu penting pada kultur monolayer karena sel mati kehilangan sifat menyerapnya. Salah satu kelemahan teknik ini adalah keharusan untuk menggunakan sel tidak tetap (unfixed cells) yang mungkin menyebabkan keterbatasan waktu. Teknik ini memiliki potensi untuk digunakan dalam pengujian sensitivitas obat pada tumor manusia, dan laporan-laporan awal mengenai penelitian tersebut menunjukkan hasil yang memuaskan. Beberapa publikasi terbaru menyebutkan beberapa masalah teknis yang memengaruhi
50
interpretasi hasil pengujian yang harus dipertimbangkan ketika merencanakan protokol pengujian. Hal ini termasuk kemungkinan aktivitas enzim mitokondria pada sel yang diberi perlakuan obat dan efek pengkondisian medium oleh sel pada saat produksi formazan. Spektrum absorpsi MTT-formazan juga diketahui tergantung pada pH dan kerapatan sel, namun sebuah metode telah diperjelas dan mampu menjawab permasalahan dan meningkatkan linearitas hubungan antara MTT-formazan dan kerapatan sel khususnya pada jumlah sel yang besar (Freshney, 1992).
Uji MTT tetrazolium merupakan salah satu metode analisis kolorimetrik untuk mengukur viabilitas sel yang paling banyak digunakan, karena MTT dapat diubah menjadi kristal biru formazan yang tidak larut air oleh aktivitas enzim dehidrogenase di dalam sel hidup, kemudian OD formazan secara tidak langsung akan menunjukkan jumlah sel yang hidup. Bagaimanapun, telah diketahui juga bahwa reliabilitas dan sensitivitas metode ini dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya volume sel, antioksidan dan senyawa berwarna lainnya (Wang et al., 2006) .
Enzim suksinat dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan aktif selama proses respirasi seluler secara aerobik. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan flavoprotein yang mengandung protein dengan ikatan Fe (besi) dan S (belerang). Enzim ini terikat pada bagian membran mitokondria yang berfungsi sebagai reduktor selama tahapan siklus Krebs dan transport elektron. Pada siklus Krebs, enzim ini menerima hidrogen dari suksinat dan bertugas menghidrogenasi suksinat menjadi fumarat serta menghasilkan FADH2. FADH2 yang dibentuk akan mengalami reoksidasi pada rantai transport elektron yang berkaitan erat dengan pembentukan energi (ATP) dalam proses fosforilasi oksidatif (Lehninger, 1982).
Suksinat dehidrogenase merupakan satu-satunya enzim terikat membran dalam siklus asam sitrat, lainnya adalah komponen matriks mitokondria, sehingga enzim ini ditempatkan untuk menyalurkan elektron secara langsung ke mekanisme transpor elektron pada membrane mitokondria (Voet et al., 2006).
51
Menurut Freimoser et al. (1999), MTT assay merupakan metode uji viabilitas sel kuantitatif yang lebih praktis, cepat dan efisien dengan hasil yang cukup akurat dibandingkan dengan menggunakan metode pewarnaan tripan biru yang dilakukan secara manual pada pengujian sel fungi. Reduksi garam tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi proliferasi sel limfosit. Garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning berkurang sebagai akibat proses metabolisme sel, terutama karena aktivitas kerja enzim suksinat dehidrogenase. Kristal formazan tidak larut air berwarna biru tua yang terbentuk dapat dilarutkan dengan pelarut organik seperti isopropanol, etil asetat, dietil eter atau n-butanol dan kemudian diukur dengan
spectrophotometer microplate reader.
Sel yang berproliferasi aktif secara metabolik daripada sel yang tidak berproliferasi (ada pada tahap istirahat), maka uji ini sesuai tidak hanya untuk penentuan aktivasi sel dan proliferasi. Uji kolorimetrik merupakan uji yang cepat dan mudah. Karena teknik ini tidak membutuhkan pencucian maupun pemanenan sel, uji lengkap dari awal mikrokultur sampai analisis data dalam sebuah ELISA plate reader dapat dilakukan pada lempeng mikrokultur yang sama (Rode et al., 2009).
Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan sel hidup dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase (The University of Queensland, 2009)
Kandungan enzim suksinat dehidrogenase relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik sehingga jumlah formazan yang dihasilkan
52
dapat dipercaya berbanding lurus terhadap jumlah sel. Pengujian jumlah proliferasi sel limfosit manusia menggunakan uji MTT dengan mengukur nilai absorbansi yang akan digunakan untuk mendapatkan nilai indeks stimulasi (I.S.). Metode ini sering digunakan untuk mengukur proliferasi sel dan toksisitas sel. Semakin tinggi absorbansi maka semakin tinggi pula nilai indeks stimulasi yang menandakan semakin banyak jumlah sel limfosit yang hidup. Sebaliknya, semakin rendah absorbansi maka semakin rendah indeks stimulasi yang berarti semakin banyak sel limfosit yang mati.
GG. ERITROSIT
Eritrosit adalah sel yang berukuran kecil dan berdiameter kira-kira 7,5 µm. Sel ini berbentuk lempeng bikonkaf yang artinya tipis di bagian tengah dan tebal di bagian pinggir. Bentuknya yang khusus ini merupakan adaptasi fungsi sel darah merah yaitu dalam mentranspor gas. Bentuknya menyebabkan luas permukaan menjadi lebih besar di mana gas-gas dapat berdifusi. Selain itu, membran selnya menjadi lebih dekat dengan molekul pembawa oksigen – hemoglobin – dalam sel. Akibatnya, sel darah merah dapat dengan mudah berubah bentuk ketika melewati kapiler. Pada pria normal, jumlah rata-rata sel darah merah per milliliter kubik adalah 4.600.000-6.200.000 dan pada wanita normal 4.200.000-5.400.000. Jumlah sel darah merah biasanya naik setelah beberapa hari melakukan latihan berat atau jika sedang berada di tempat yang lebih tinggi karena kenaikan jumlah oksigen yang dibutuhkan (Shier et al., 2002). Pembentukan eritrosit merupakan subyek dari kontrol umpan balik. Pembentukannya dihambat oleh kenaikan level sirkulasi sel darah merah terhadap nilai supernormal dan distimulasi oleh anemia, juga distimulasi oleh hipoksia dan kenaikan pada jumlah sel darah merah yang bersirkulasi merupakan ciri umum karena aklimatisasi ketinggian (Ganong, 1990).
Karena fungsinya yang sangat penting di dalam tubuh dan kerentanannya terhadap oksidasi, banyak sekali penelitian yang menggunakan eritrosit sebagai model untuk mempelajari kerusakan oksidatif biomembran dan pengaruh berbagai senyawa yang terdapat pada makanan, dalam
53
menghambat terjadinya kerusakan pada membran. Pada umumnya parameter yang digunakan untuk mengetahui terjadinya kerusakan pada membran adalah persentase hemolisis yang terjadi pada eritrosit. Semakin tinggi persentase hemolisis yang terjadi menandakan semakin parahnya kerusakan yang terjadi pada membran eritrosit, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persentase hemolisis yang terjadi menandakan semakin tahan membran sel terhadap kerusakan (Amri, 2007).
Eritrosit dipilih sebagai model in vitro untuk mempelajari interaksi oksidan/antioksidan karena membrannya kaya akan asam lemak tidak jenuh yang sangat rentan terhadap peroksidasi yang diperantarai oleh radikal bebas, dan dianggap dapat mewakili membran plasma secara umum (Shiva Shankar Reddy et al., 2007).
HH. HEMOLISIS ERITROSIT
Hemolisis adalah pecahnya sel darah merah dan keluarnya hemoglobin ke dalam plasma. Hemolisis eritrosit kemungkinan merupakan hasil akhir dari kerusakan minor pada membran eritrosit. Integritas struktur membran merupakan ciri penting resistansi eritrosit terhadap serangan peroksidatif (Gratzer, 1981). Eritrosit juga rentan terhadap stres oksidatif karena adanya fosfolipida membran yang tidak jenuh (Gain dan Shohet, 1981), paparan yang terus menerus terhadap tensi oksigen tinggi dan adanya logam transisi dalam jumlah berlebih yang dapat bertindak sebagai agen redoks (Pryor, 1976). Adanya hemoglobin dan senyawa hematin lainnya mungkin juga meningkatkan proses peroksidasi lipida (Tappel, 1953). Kerusakan sel darah merah diperkirakan terjadi baik karena oksidasi membran atau denaturasi hemoglobin (Hatherill et al., 1991).
Pada dasarnya ketika sel darah merah telah mencapai batas akhir masa hidupnya, sekitar 120 hari, akan terjadi hemolisis secara alami. Proses ini diawali dengan menurunnya volume sel hingga 13%, meningkatnya sensitivitas membran sel karena faktor stress, menurunnya deformabilitas, dan
54
beberapa perubahan pada daya adhesi dan transpor membran (Bartosz, 1990). Keadaan tersebut nantinya akan menuju kepada hemolisis sel darah merah.
Pengujian aktivitas antihemolisis pada sel darah merah dapat dilakukan dengan penambahan larutan pengoksidasi seperti H2O2, senyawa-senyawa aldehida seperti formaldehida, asetaldehida, atau glutaraldehida dan juga aloksan (Rose dan Gyorgy, 1950)
II. ANTIOKSIDAN
Antioksidan adalah senyawa yang ketika berada dalam jumlah kecil, dibandingkan dengan substrat yang dioksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi substrat. Antioksidan dapat beraksi pada beberapa tahap berbeda dalam sebuah sekuensi oksidatif, sebagaimana diilustrasikan dengan melihat oksidasi lipida yang terjadi di membran sel atau produk kaya lipida. Antioksidan dapat bekerja dengan cara: a) membuang oksigen atau menurunkan konsentrasi oksigen lokal; b) membuang ion logam katalitik; c) membuang spesien kunci oksigen reaktif; d) mengikat radikal bebas yang menginisiasi seperti spesies hidroksil, alkoksil dan peroksil; e) memutus rantai sekuens yang telah diinisiasi; f) memecah atau mengikat oksigen singlet (Gutteridge, 1995).