SECARA IN VITRO
Teknik pengujian pengaruh ekstrak terhadap proliferasi sel limfosit manusia secara in vitro membutuhkan kondisi kultur sel yang sama seperti lingkungan dalam tubuh manusia. Hal ini bertujuan agar proses biologis yang terjadi di dalam kultur sel berlangsung mendekati keadaan sebenarnya di dalam tubuh (in vivo). Malole (1990) menyatakan bahwa pendekatan terhadap kondisi lingkungan tubuh tersebut diperoleh dengan mengaplikasikan faktor-faktor media pertumbuhan, pH, dan fase gas yang sesuai untuk pertumbuhan sel. Menurut Harrison (1997), pengamatan proses pertumbuhan sel secara in vitro memiliki keuntungan bila dibandingkan secara in vivo. Keuntungan metode ini adalah keadaan lingkungan pertumbuhan dapat stabil karena dapat diamati secara langsung.
Sel limfosit diperoleh dari darah donor pria dewasa sehat. Darah dimasukkan dalam tabung vacutainer steril kemudian dilakukan pemisahan limfosit yang merupakan komponen agranulosit dari komponen granulosit. Pemisahan tersebut dilakukan dengan menggunakan larutan ficoll hystopaque yang memiliki densitas 1.77 ± 0.001 g/ml, sehingga mampu menahan sel-sel agranulosit yang memiliki densitas rendah seperti limfosit, sedangkan sel-sel granulosit yang memiliki densitas lebih tinggi akan menembus ficoll. Metode pemisahan dengan menggunakan larutan ficoll dapat memisahkan lebih dari 90% limfosit hidup yang terkandung dalam darah (Freshney, 1994).
Setelah proses isolasi sel limfosit telah selesai, maka selanjutnya jumlah awal sel limfosit yang akan dikulturkan perlu diketahui viabilitasnya. Jumlah sel limfosit awal sebelum dikulturkan pada kegiatan pengujian ekstrak tepung pearl millet hasil ekstraksi bertingkat terhadap proliferasi sel limfosit adalah 1.03 x 106 sel/ml, sedangkan pada pengujian ekstrak β-glukan adalah 1.10 x 106 sel/ml. Kedua jumlah sel ini masih berada dalam kisaran jumlah sel yang baik untuk dikultur menurut Bellanti (1993), yakni sekitar 1-4 x 106 sel/ml. Perbedaan data tersebut disebabkan pelaksanaan pengujian ekstrak terhadap proliferasi sel limfosit manusia secara in vitro dilakukan pada waktu yang berbeda. Contoh perhitungan konsentrasi sel limfosit awal sebelum dikulturkan ditunjukkan pada Lampiran 21.
Kegiatan perhitungan jumlah sel limfosit awal ini diperlukan untuk mengetahui viabilitas sel limfosit yang akan dikulturkan dengan batasan 95% sel adalah hidup. Viabilitas sel limfosit yang didapatkan dalam kegiatan pengujian ekstrak hasil ekstraksi bertingkat adalah 98.10% dan
dalam kegiatan pengujian ekstrak β-glukan adalah 98.21%. Hasil perhitungan ini telah memenuhi
persyaratan sehingga selanjutnya dapat dikerjakan kegiatan pengkulturan sel limfosit dengan larutan RPMI, mitogen, dan kelima ekstrak.
Limfosit merupakan salah satu sel imun dari kelompok sel darah putih yang bertanggung jawab terhadap pertahanan tubuh manusia untuk melawan mikroorganisme patogen, virus, dan benda asing lainnya yang tidak sesuai dengan kondisi fisiologis tubuh. Kemampuan limfosit tersebut juga berfungsi penjaga kesehatan tubuh manusia (Kresno, 2001).
Proliferasi merupakan salah satu bentuk aktivitas sel hidup. Pada sel limfosit, proliferasi merupakan fungsi dasar biologis limfosit dan respon proliferatif secara in vitro yang dapat menggambarkan fungsi limfosit serta status imun tubuh suatu individu manusia. Kemampuan limfosit untuk berproliferasi atau membentuk klon menunjukkan secara tidak langsung kemampuan respon imunologik atau tingkat kekebalan. Jika sel limfosit dikultur dengan penambahan mitogen ataupun sengaja diberi antigen yang mengandung beberapa komponen bioaktif yang dapat menstimulir proliferasinya, maka limfosit akan memberikan respon dengan cara berproliferasi atau memperbanyak diri. Proliferasi sel limfosit itu ditunjukkan melalui indeks stimulasi. Nilai indeks stimulasi yang diperoleh merupakan rataan dari beberapa ulangan (Kresno, 2001; Baratawidjaja, 2006).
Mitogen PKW berasal dari tanaman pokeweed (Phytolacca americana) dengan struktur
molekul polimerik dengan ligan di N-asetilkitobiose dan baik untuk menstimulir proliferasi sel B maupun sel T (Kuby, 1997), sedangkan mitogen LPS berasal dari komponen dinding sel bakteri gram negatif seperti Salmonella typhii ataupun E. coli yang baik untuk menstimulir proliferasi sel
B (Baratawidjaja, 2006). Mitogen Con A merupakan mitogen yang berupa protein dari bibit jack
bean (Canavalia ensiformis) yang berikatan dengan gula yang mengandung α-D-mannose atau α- D-glucose (Kuby, 1992). Mitogen ini memiliki peran dalam memicu proliferasi sel T (Baratawidjaja, 2006).
1. Pengaruh Ekstrak Tepung Pearl Millet Tersosoh 100 Detik Hasil Ekstraksi Bertingkat Sampel kultur sel limfosit diperlakukan dengan kontrol standar, kontrol positif, dan larutan kerja ekstrak hasil kegiatan ekstraksi bertingkat. Volume total kultur sel adalah 110 µl yang merupakan campuran dari 80 µl suspensi sel limfosit, 10 µl serum darah AB, dan 20 µl larutan RPMI/ larutan mitogen/ larutan kerja ekstrak. Kontrol standar adalah sampel kultur sel yang berisikan suspensi sel limfosit dan larutan RPMI. Kontrol positif yang digunakan adalah larutan mitogen PKW dan LPS dengan konsentrasi masing-masing pada kultur sel adalah 9.09 µg/ml. Perlakuan dengan larutan kerja ekstrak memiliki perbedaan konsentrasi di masing- masing sumur kultur selnya bergantung pada jenis ekstrak dan tingkatan konsentrasinya. Konsentrasi masing-masing ekstrak pada kultur sel disajikan pada Tabel 15.
Hasil dari proliferasi sel limfoist yang dikultur dengan mitogen, baik PKW ataupun LPS, menunjukkan rata-rata indeks stimulasi yang lebih rendah jika dibandingkan dengan kontrol standar. Hal ini menunjukkan mitogen yang digunakan tidak berfungsi dengan baik karena kemungkinan kualitas mitogen yang sudah tidak bagus. Rata-rata indeks stimulasi mitogen PKW adalah 0.70 dan mitogen LPS adalah 0.89. Ilustrasi yang menunjukkan nilai tersebut disajikan pada Gambar 8.
Gambar 8. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar dan kontrol positif yang diberi PKW dan LPS
Keterangan:
Rata-rata I.S : Rata-rata nilai indeks stimulasi Kontrol STD : Kontrol standar
PKW : Pokeweed dengan konsentrasi 9.09 µg/ml
LPS : Lipopolisakarida dengan konsentrasi 9.09 µg/ml
Peran kontrol positif yang berupa larutan mitogen seharusnya dapat memicu proliferasi sel limfosit pada kultur sel lebih baik dibandingkan kontrol standar. Hal ini dikarenakan mitogen dapat mengaktivasi hormon tirosin kinase yang merupakan faktor pertumbuhan. Hormon ini akan mengirimkan sinyal-sinyal yang berpengaruh terhadap faktor transkripsi dan aktivasi gen sehingga terjadi proliferasi sel (Decker, 2001).
a. Pengaruh ekstrak heksana terhadap proliferasi sel limfosit secara in vitro
Ekstrak heksana pada ketiga konsentrasi memberikan hasil rata-rata indeks stimulasi yang fluktuatif, yakni nilai tertinggi ditunjukkan oleh ekstrak heksana pada konsentrasi
40.88 µg/ml dengan 0.97, kemudian menurun pada konsentrasi 163.54 µg/ml dengan 0.84, dan proliferasi terendah ditunjukkan pada konsentrasi 81.77 µg/ml dengan 0.74. Ilustrasi proliferasi sel limfosit ini dapat dilihat dengan jelas pada Gambar 9.
Gambar 9. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar dan ekstrak heksana
Ketiga variasi konsentrasi ekstrak heksana dalam penelitian ini tidak mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit manusia secara baik diakibatkan nilai rata-rata indeks stimulasinya yang lebih rendah dibandingkan kontrol standar. Ketidakmampuan ekstrak heksana untuk menstimulasi sel limfosit dikarenakan rendahnya konsentrasi ekstrak pada kultur sel.
Konsentrasi ekstrak heksana pada kultur sel yang tidak sesuai dengan konsentrasi ekstrak heksana secara teoritis mengindikasikan fakta baru bahwa banyaknya tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik yang diasumsikan terkonsumsi hanyalah sebesar 18.18 g/hari dari asumsi konsumsi awal yang adalah 100 g/hari. Contoh perhitungan untuk mendapatkan besar konsumsi tepung ini disajikan pada Lampiran 22.
b. Pengaruh ekstrak etil asetat terhadap proliferasi sel limfosit secara in vitro
Ekstrak etil asetat yang memberikan pengaruh tertinggi terhadap proliferasi sel limfosit
manusia ditunjukkan pada konsentrasi 11.43 µg/ml dengan 1.00, kemudian menurun pada
konsentrasi dua kalinya yakni 22.87 µg/ml dengan 0.95, dan hasil terendah ditunjukkan pada konsentrasi setengahnya yakni 5.72 µg/ml dengan 0.92. Pengaruh ekstrak etil asetat terhadap proliferasi sel limfosit diilustrasikan secara jelas pada Gambar 10.
Gambar 10. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar dan ekstrak etil asetat
Ekstrak etil asetat dalam penelitian ini yang mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit manusia secara baik hanya pada konsentrasi 11.43 µg/ml dengan nilai rata-rata indeks stimulasi sama dengan kontrol standar. Hasil ini menunjukkan kemungkinan ekstrak etil asetat dari tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik dengan kandungan senyawa semipolar terlarutnya memiliki kemampuan sebagai senyawa imunomodulator.
Konsentrasi ekstrak etil asetat pada kultur sel yang tidak sesuai dengan konsentrasi ekstrak etil asetat secara teoritis mengindikasikan fakta baru bahwa banyaknya tepung biji pearl millet yang diasumsikan terkonsumsi hanyalah sebesar 18.18 g/hari dari asumsi konsumsi awal yang adalah 100 g/hari.
c. Pengaruh ekstrak etanol terhadap proliferasi sel limfosit secara in vitro
Pengaruh ekstrak etanol berfluktuatif terhadap proliferasi sel limfosit pada ketiga tingkatan konsentrasi. Ekstrak etanol pada konsentrasi tertinggi yakni 117.59 µg/ml memberikan nilai rata-rata indeks stimulasi tertinggi pula yakni 1.10, lalu menurun pada konsentrasi 29.40 µg/ml dengan 0.93, dan pengaruh stimulasinya semakin menurun pada konsentrasi 58.80 µg/ml dengan 0.91. Pengaruh ekstrak etanol terhadap proliferasi sel limfosit diilustrasikan secara jelas pada Gambar 11.
Gambar 11. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar dan ekstrak etanol
Ekstrak etanol dalam penelitian ini yang mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit manusia secara baik hanya pada konsentrasi 117.59 µg/ml dengan nilai rata-rata indeks stimulasi lebih besar dari kontrol standar, yakni 1.10. Hasil ini menunjukkan kemungkinan
ekstrak etanol dari tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik dengan kandungan senyawa
polar terlarutnya memiliki kemampuan sebagai senyawa imunomodulator.
Konsentrasi ekstrak etanol pada kultur sel yang tidak sesuai dengan konsentrasi ekstrak etanol secara teoritis mengindikasikan fakta baru bahwa banyaknya tepung biji pearl millet yang diasumsikan terkonsumsi hanyalah sebesar 18.18 g/hari dari asumsi konsumsi awal yang adalah 100 g/hari.
d. Pengaruh ekstrak akuades terhadap proliferasi sel limfosit secara in vitro
Ekstrak akuades yang dijadikan sebagai pembanding ketiga ekstrak tersebut memiliki kenaikan nilai rata-rata indeks stimulasi seiring dengan kenaikan konsentrasi ekstrak pada kultur sel, yakni pada konsentrasi terendah 223.88 µg/ml memberikan hasil rata-rata indeks stimulasi terendah pula yakni 1.04, lalu pada konsentrasi dua kali dari konsentrasi terendah 447.76 µg/ml memiliki nilai 1.12, dan pada konsentrasi tertinggi 895.53 µg/ml adalah 1.35. Pengaruh ekstrak akuades terhadap proliferasi sel limfosit diilustrasikan secara jelas pada Gambar 12.
Gambar 12. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar dan ekstrak akuades
Larutan ekstrak akuades memberikan rata-rata indeks stimulasi yang bernilai lebih dari 1.00 pada semua tingkatan konsentrasi pada kultur sel. Data ini dapat berarti sebagai berikut:
beberapa komponen fitokimia dan komponen lainnya yang dapat terlarut lebih baik dengan penggunaan pelarut akuades dibandingkan pelarut heksana, etil asetat, dan etanol,
komponen terlarut dalam ekstrak tersebut lebih baik dalam menstimulasi proliferasi sel limfosit,
ekstrak akuades dapat mengandung komponen lain seperti protein larut air, serat larut air, mineral dan vitamin larut air, serta komponen lainnya yang dapat meningkatkan proliferasi limfosit karena dapat berfungsi sebagai antigen non-toksik yang terdeteksi oleh sel limfosit, dan
walaupun terdapat residu pada suspensi sampel ekstrak, tetapi residu ini tidak bersifat toksik bagi sel pada konsentrasi yang masih dapat ditolerir oleh sel itu sendiri. Hal ini dikarenakan komponen utama penysusun pelarut akuades adalah H20.
Konsentrasi ekstrak akuades pada kultur sel yang tidak sesuai dengan konsentrasi ekstrak akuades secara teoritis mengindikasikan fakta baru bahwa banyaknya tepung biji pearl millet yang diasumsikan terkonsumsi hanyalah sebesar 18.18 g/hari dari asumsi konsumsi awal yang adalah 100 g/hari.
e. Pengaruh ekstrak tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik secara keseluruhan
terhadap proliferasi sel limfosit manusia
Secara keseluruhan, tidak semua ekstrak di setiap tingkatan konsentrasinya pada kultur sel memberikan respon positif terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit. Jenis ekstrak yang tidak memberikan respon positif adalah ekstrak heksana pada setiap tingkatan konsentrasi (40.88 µg/ml, 81.77 µg/ml, dan 163.54 µg/ml), ekstrak etil asetat pada konsentrasi 5.72 µg/ml dan 22.87 µg/ml, dan ekstrak etanol pada konsentrasi 29.40 µg/ml
dan 58.80 µg/ml. Sedangkan, jenis ekstrak yang memberikan respon positif pada
peningkatan proliferasi sel limfosit adalah ekstrak etil asetat pada konsentrasi 11.43 µg/ml, ekstrak etanol pada konsentrasi 117.59 µg/ml, dan ekstrak akuades pada setiap tingkatan konsentrasi (223.88 µg/ml, 447.76 µg/ml, dan 895.53 µg/ml). Ilustrasi peningkatan proliferasi sel limfosit oleh kontrol standar, kontrol positif (mitogen PKW dan LPS), dan semua ekstrak digambarkan secara jelas pada Gambar 13. Perolehan absorbansi hasil pembacaan dengan ELISA reader dan nilai rata-rata indeks stimulasi ekstrak tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik hasil ekstraksi bertingkat terhadap proliferasi sel limfosit manusia disajikan pada Lampiran 23 dan salah satu contoh perhitungan indeks stimulasi dari pengaruh ekstrak akuades disajikan pada Lampiran 24.
Adanya respon positif yang ditunjukkan dari pengaruh ekstrak etil asetat pada konsentrasi 11.43 µg/ml, ekstrak etanol pada konsentrasi 117.59 µg/ml, dan ekstrak akuades pada setiap konsentrasinya, memberikan hasil bahwa kemungkinan ekstrak-ekstrak tersebut dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit. Hal ini menampilkan indikasi awal bahwa kemungkinan tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik memiliki manfaat bagi kesehatan manusia dalam meningkatkan sistem imun jika terkonsumsi pada kehidupan sehari-hari.
Gambar 13. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit kontrol standar, kontrol positif, dan semua ekstrak hasil kegiatan ekstraksi bertingkat dengan metode maserasi Keterangan: Kontrol standar Pokeweed 9.09 g/ml Lipopolisakarida 9.09 g/ml Ekstrak heksana ( g/ml) Ekstrak etil asetat ( g/ml) Ekstrak etanol ( g/ml) Ekstrak akuades ( g/ml)
2. Pengaruh Ekstrak Senyawa ββββ-Glukan
Sampel kultur sel limfosit dalam pengujian pengaruh ekstrak senyawa β-Glukan
diperlakukan dengan kontrol standar, kontrol positif (mitogen PKW, LPS, dan Con A), standar senyawa β-glukan murni, dan ekstrak senyawa β-Glukan yang diperoleh dari kegiatan ekstraksi dan purifikasi senyawa β-Glukan yang berasal dari tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik.
Hasil rata-rata indeks stimulasi yang diberikan oleh pengaruh larutan mitogen PKW, LPS, dan Con A terhadap proliferasi sel limfosit menunjukkan hasil yang lebih rendah dibandingkan kontrol standar. Hal ini menunjukkan mitogen yang digunakan tidak berfungsi dengan baik karena kemungkinan kualitas mitogen yang sudah tidak bagus. Konsentrasi kontrol positif berupa mitogen PKW, LPS, dan Con A yang masing-masing adalah 9.09 µg/ml memberikan nilai rata-rata indeks stimulasi secara berurutan adalah 0.86, 0.70, dan 0.82.
Pengaruh β-glukan ekstrak pada konsentrasi 6666.67 µg/ml memberikan nilai rata-rata indeks stimulasi tertinggi dibandingkan kontrol standar, kontrol positif, dan β-glukan STD, yakni dengan nilai 1.21. Sampel β-glukan STD dengan konsentrasi yang sama dengan β- glukan ekstrak memberikan daya yang lebih rendah dalam menstimulasi proliferasi sel limfosit, yakni dengan rata-rata indeks stimulasi 0.92, jika dibandingkan dengan sampel β-
glukan ekstrak. Namun, nilai tersebut masih lebih tinggi dibandingkan rata-rata indeks
stimulasi ketiga mitogen. Rendahnya senyawa β-glukan STD tersebut menunjukkan
kemungkinan bahwa ekstrak senyawa β-glukan dari tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik lebih baik dalam menstimulasi proliferasi sel limfosit. Hal ini menunjukkan kemampuan ekstrak β-glukan tersebut sebagai senyawa imunomodulator. Ilustrasi dari proliferasi sel limfosit ini ditunjukkan pada Gambar 14. Perolehan absorbansi hasil pembacaan dengan ELISA reader dan nilai rata-rata indeks stimulasi ekstrak β-glukan terhadap proliferasi sel limfosit manusia disajikan pada Lampiran 25.
Gambar 14. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi sel limfosit yang dikultur dengan kontrol standar, mitogen, β-glukan standar, dan ekstrak β-glukan pearl millet
Keterangan: Kontrol standar Pokeweed 9.09 g/ml Lipopolisakarida 9.09 g/ml Convavalin A 9.09 g/ml β-glukan standar ( g/ml) Ekstrak β-glukan ( g/ml)
Ekstrak senyawa β-glukan dengan konsentrasi tersebut di dalam kultur sel ternyata memberikan asumsi konsumsi tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik sebanyak 909.09 g/hari. Bobot tepung ini lebih besar jika dibandingkan bobot asumsi konsumsi awal yang hanya 100 g/hari.
Mekanisme kerja senyawa β-glukan yang paling sering dipublikasikan terdiri dari kegiatan augmentasi dari fagosit dan aktivitas proliferasi dari sel fagosit mononuklear yang terdiri dari sel monosit, sel makrofag, dan sel dendritik (Novak dan Vetvicka, 2008). Aktivitas proliferasi sel makrofag dan sel dendritik akan mengaktifkan proliferasi sel limfosit karena menjadi semacam pengkode hadirnya antigen dalam tubuh. Hal ini menunjukkan
bahwa senyawa β-glukan mampu berfungsi dalam meningkatkan kerja sistem imun nonspesifik dan spesifik.
Namun, mengingat β-glukan termasuk dalam jenis serat tidak larut, maka peran imunomodulator yang dilakukannya adalah secara tidak langsung. Dalam tubuh, senyawa ini akan diubah menjadi SCFA (Short Chain Fatty Acid) terlebih dahulu sebelum dapat mengaktifkan sel reseptor limfosit. SCFA tersebut dapat dimanfaatkan oleh bakteri probiotik sebagai makanannya sehingga selanjutnya bakteri probiotik tersebut mampu menstimulir proliferasi sel limfosit (Fitrial, 2008).
V. KESIMPULAN DAN SARAN