GARUT SECARA IN VITRO
1. Pertumbuhan BAL dalam Ekstrak Cookies Ubi Garut.
Tujuan dari tahap ini adalah menguji potensi ekstrak cookies ubi garut dalam mendukung pertumbuhan BAL. Sebagai pembanding digunakan ekstrak ubi garut segar. Jenis BAL yang digunakan adalah Bifidobacterium bifidum, B. longum, L.casei Shirota, L.casei Rhamnosus, Lactobacillus F1 dan G3. Media yang digunakan sebagai media pertumbuhan adalah media cair MRS basis tetapi glukosa media diganti dengan ekstrak tepung ubi garut atau ekstrak cookies ubi garut. Sebagai pembanding digunakan standar gula yaitu glukosa. Sebagai kontrol digunakan MRS basis tanpa komponen gula.
Media MRS basis ditempatkan pada tabung reaksi sebanyak 9 ml kemudian ditambahkan 1 ml ekstrak tepung ubi garut atau cookies ubi garut steril dengan TPT sebesar 5% sehingga konsentrasi ekstrak dalam media adalah 0.5%.
Ekstrak gula dan oligosakarida
Ekstraksi dengan pelarut etanol 70%, menggunakan magnetic stirrer, t = 15 jam
Penyaringan dengan kertas saring dan pencucian dengan etanol 70%
Sentrifuse 2000 x g selama 10 menit
Filtrat dipekatkan dengan evaporator vakum T = 40oC Tepung (ubi garut
Kultur dari masing-masing BAL ditambahkan ke dalam media yang mengandung ekstrak gula atau glukosa sebanyak 0.1 ml (1%). Untuk menghindari kontaminasi maka masing-masing dibuat dua tabung dalam setiap hari pengamatan yang akan diamati pada 0 jam dan 24 jam perlakuan. Inkubasi secara aerob untuk
Lactobacillus dan secara anaerob (dalam anaerobik jar) untuk Bifidobacterium
dalam inkubator 37oC. Untuk membuat kondisi anaerob, digunakan alat
ANOXOMAT (Gambar 6). Perhitungan jumlah BAL dihitung setelah diinkubasi selama 48 jam.
Kontrol dikerjakan melalui tahapan yang sama dengan pengerjaan perlakuan ekstrak tepung ubi garut atau cookies ubi garut (ditambahkan 0.1 ml kultur) tetapi pada media tidak ditambahkan sumber gula (standar gula maupun ekstrak ubi garut atau cookies ubi garut). Bakteri asam laktat dengan pertumbuhan terbaik pada ekstrak tepung ubi garut dan cookies ubi garut dipilih untuk digunakan pada pengujian selanjutnya.
2. Kompetisi Patogen dengan BAL dalam Media yang Mengandung Ekstrak Ubi Garut.
Pengujian kompetisi pertumbuhan BAL dengan bakteri patogen dilakukan dengan menginokulasikan secara bersama-sama BAL dan bakteri patogen ke dalam satu media. Dalam pengujian ini menggunakan MRS basis tetapi glukosa diganti dengan ekstrak tepung ubi garut atau cookies ubi garut TPT 5 %. Sebanyak 8.1 ml MRS basis steril ditambahkan 0.9 ml ekstrak sehingga kandungan ekstrak dalam media menjadi 0.5% TPT. Bakteri asam laktat yang digunakan adalah L. casei Rhamnosus. Bakteri patogen yang digunakan adalah E.coli, Salmonella sp dan B. cereus.
Jumlah BAL (L. casei Rhamnosus) yang diinokulasi ke dalam media kompetisi sejumlah 108 cfu/ml, sedangkan jumlah patogen yang diinokulasi ke dalam media kompetisi sejumlah 104 cfu /ml. Untuk mendapatkan L. casei
Rhamnosus sejumlah 108 cfu /ml maka kultur segar yang telah diinkubasi selama 24 jam diencerkan 10 kali. Patogen segar yang telah diinkubasi selama 24 jam dilakukan pengenceran. Untuk mendapatkan jumlah awal patogen 104 cfu /ml
maka E. coli dan Salmonella diencerkan 1000 kali sedangkan B. cereus
diencerkan 100 kali.
Sebanyak 1 ml BAL dan 0.1 ml patogen (setelah pengenceran) diinokulasikan ke dalam media kompetisi. Untuk menghindari kontaminasi dalam setiap hari pengamatan maka media kompetisi dibuat dalam 3 tabung terpisah yang akan diamati pada 0 jam, 24 jam dan 48 jam perlakuan. Perhitungan BAL dan patogen dilakukan secara kuantitatif dengan metode agar tuang (AOAC 1990). Untuk menghitung jumlah BAL maka digunakan media MRS Agar, sedang untuk menghitung jumlah E. coli digunakan media EMBA, dan untuk menghitung jumlah Salmonella sp dan B. cereus digunakan media NA.
G. PENGUJIAN POTENSI PREBIOTIK EKSTRAK UBI GARUT SECARA
IN VIVO.
Uji ini bertujuan untuk melihat potensi ekstrak ubi garut sebagai prebiotik,
L. casei Rhamnosus sebagai probiotik, dan campuran L. casei Rhamnosus dengan ekstrak ubi garut sebagai sinbiotik terhadap pertumbuhan total mikroba, BAL,
E.coli, dan Samonellasp dalam saluran pencernaan makhluk hidup.
1. Penyiapan ransum.
Ransum standar yang diberikan untuk tikus pada pengujian prebiotik secara
in vivo terdiri dari kasein, minyak jagung, campuran vitamin, campuran mineral, serat, air (AMDK) dan pati (maizena) (AOAC 1984). Komposisi ransum standar yang diberikan pada pengujian potensi prebiotik ekstrak ubi garut secara in vivo
dapat dilihat pada Lampiran 1.
2. Pemeliharaan Hewan Percobaan.
Hewan percobaan yang digunakan sebanyak 24 ekor tikus putih jantan galur
Sprague-Dawley berumur dua bulan. Tikus-tikus tersebut dibagi dalam 4 kelompok masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus. Kelompok A = kontrol,
kelompok B = perlakuan prebiotik (ekstrak ubi garut), kelompok C = perlakuan probiotik (L. casei Rhamnosus), dan kelompok D = perlakuan sinbiotik (ekstrak ubi garut dengan L. casei Rhamnosus). Pemberian ransum serta air minum diberikan kepada setiap tikus selama 31 hari. Setiap ekor tikus ditempatkan dalam kandang yang terpisah (Gambar 10). Frekuensi pemberian ransum standar atau
ransum perlakuan serta air minum dilakukan satu kali per hari secara ad libitum. Sisa ransum ditimbang pada keesokan harinya. Berat badan tikus ditimbang setiap 2 hari sekali.
Setiap hari kandang tikus, wadah pakan dan botol minum diganti dengan yang telah dicuci dan diklorinasi. Sekam yang digunakan juga diganti setiap hari dengan yang baru dan telah disterilkan dengan cara diotoklaf (121oC, 15 menit). Kandang tikus, wadah ransum bekas pakai dicuci dengan sabun dan dicelupkan dalam larutan klorin 200 ppm kemudian dijemur. Sedangkan botol dan corong gelas wadah minum bekas didesinfeksi dengan cara direndam dalam air mendidih.
Gambar 10 Tikus putih jantan galur Sprague Dawley
Periode adaptasi selama 10 hari dilakukan dengan memberikan ransum standar sebanyak 20 g/ekor/hari dan air minum pada semua kelompok perlakuan. Pada periode perlakuan selama 10 hari, suspensi sel L.casei Rhamnosus sebanyak 1ml diberikan pada kelompok probiotik dan sinbiotik dengan cara disonde, sedangkan kelompok prebiotik disonde dengan 1ml ekstrak ubi garut. Untuk perlakuan kontrol disonde dengan larutan garam fisiologis NaCl 0.85% steril. Pada periode pasca perlakuan setiap tikus dari semua kelompok kembali diberikan ransum standar dan air minum AMDK (AquaTM). Pemberian perlakuan pada pengujian potensi prebiotik ekstrak ubi garut secara in vivo dengan L.casei Rhamnosus dilakukan dengan bantuan syringe volume 1ml, tikus yang berbeda pada kelompok yang sama menggunakan syringe yang berbeda. Setiap kali akan memberikan perlakuan, digunakan syringe baru yang masih steril. Sebelum dipergunakan untuk tikus lainnya, ujung alat sonde dilap dengan kapas yang telah
dibasahi alkohol 70%. Ransum dan pemberian perlakuan yang diberikan pada setiap kelompok selama pemeliharaan dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Jenis ransum dan pemberian perlakuan pada kelompok tikus selama pengujian potensi ekstrak ubi garut secara in vivo
Kelompok
Periode
Adaptasi (11 hari)
Masa Perlakuan (10 hari) Pasca
Perlakuan (10 hari)
Jenis ransum Disonde
Kontrol
Ransum standar
Ransum
standar 1 ml larutan fisiologis NaCl 0.85% steril
Ransum standar Prebiotik garut Ransum standar
1 ml larutan ekstrak ubi garut (0.3g TPT/kg BB tikusrata-rataH11/hari) steril dalam larutan fisiologis NaCl 0.85% steril
Probiotik Ransum
standar
1 ml suspensi sel BAL (1010 cfu/ml) dalam aquades steril
Sinbiotik garut
Ransum standar
1 ml campuran suspensi sel BAL (1010 cfu/ml) dengan ekstrak ubi garut (0.3g TPT/kgBB tikus rata-rataH11/hari) steril dalam larutan fisiologis NaCl 0.85% steril
3. Penyiapan Suspensi BAL dan Ekstrak Ubi Garut.
Kultur L.casei Rhamnosus disegarkan dengan menginokulasikan sebanyak ± 3 buah manik-manik ke dalam 10 ml MRS Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Sebanyak 0.1 ml kultur BAL hasil penyegaran ditambahkan ke dalam 9 ml MRS Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 hari (24 ± 2 jam). Kultur BAL yang telah disegarkan sel bakterinya diendapkan dengan cara disentrifus menggunakan sentrifus berpendingin. Kultur BAL masing-masing sebanyak 2 ml ditempatkan (secara aseptis) ke dalam tabung sentrifus steril volume 2ml (untuk satu perlakuan dibuat sebanyak 4 tabung), kemudian disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm, selama 10 menit pada suhu 5 0C. Media MRS Broth dipisahkan (diambil) secara aseptis, kemudian diganti dengan 8 ml larutan fisiologis NaCl 0.85% steril. Persiapan suspensi BAL (L. casei
Rhamnosus) dapat dilihat pada Gambar 11. Untuk perlakuan probiotik, maka tikus disonde dengan 1ml sel BAL dalam larutan fisiologis NaCl 0.85% steril. Untuk perlakuan prebiotik, tikus disonde dengan 1 ml ekstrak ubi garut (berasal dari 2.6 ml ekstrak ubi garut TPT 20.34% steril dalam 7.4 ml larutan fisiologis NaCl 0.85% steril). Untuk perlakuan sinbiotik, tikus disonde dengan 1 ml campuran sel BAL (berasal dari 8ml kultur BAL umur 24 jam) dalam 5.92 ml larutan fisiologis
NaCl 0.85% steril dan 2.08 ml ekstrak ubi garut TPT 20.34% steril. Jumlah sel BAL L. casei Rhamnosus yang digunakan 1.3x1010 CFU/ml, hasil perhitungan
Gambar 11 Persiapan suspensi BAL (L.casei Rhamnosus).
jumlah L. casei Rhamnosus dapat dilihat pada Lampiran 2. Perhitungan jumlah ekstrak ubi garut yang digunakan untuk sonde dapat dilihat pada Lampiran 3.
9 ml BAL hasil penyegaran
Disentrifus 3000xg, T=50C, t= 10 menit
Supernatan diambil
+ larutan fisiologis NaCl 0.85% + larutan fisiologis NaCl 0.85% + 1 ml ekstrak ubi garut
divorteks
divorteks
Suspensi BAL (probiotik) Suspensi BAL & ekstrak
Menurut WHO (1992) diacu dalam Suryadjaja (2005), konsumsi mikroorganisme hidup yang berperan sebagai probiotik sebesar 106-108 CFU/ml atau gram dapat memberikan efek positif bagi kesehatan manusia. Untuk mengetahui banyaknya sel BAL yang diberikan, maka dilakukan perhitungan jumlah BAL di dalam kultur dengan cara menghitung kultur yang telah disegarkan. Kultur BAL yang telah disegarkan, selanjutnya dilakukan pengenceran yang sesuai dan pemupukan dengan metode tuang menggunakan media MRS Agar (MRSA) sehingga didapatkan koloni yang tumbuh pada cawan berkisar antara 25-250 koloni (Harrigan 2000).
4. Pengambilan Sampel Feses.
Sampel feses dari setiap tikus untuk semua kelompok diambil secara aseptis pada hari ke 0, 3, 5, 10 perlakuan dan hari ke 1, 5, dan 10 pasca perlakuan dengan cara memijat bagian anus tikus, selanjutnya feses ditampung langsung dalam kantung plastik tahan panas yang disterilkan (diotoklaf pada suhu 121 0C, selama 15 menit). Feses dari dua ekor tikus pada kelompok yang sama disatukan (ada tiga feses untuk setiap kelompok), jadi jumlah feses untuk pengujian mikrobiologi ada 12 sampel. Pengambilan feces dilakukan mulai pukul 04.30 sampai selesai. Pengumpulan feses dihentikan bila seluruh tikus sudah diperoleh fesesnya. Feses disimpan dalam thermos es yang diberi es batu dan pada hari yang sama dilakukan pengujian mikrobiologi. Terhadap sampel feses dilakukan analisa jumlah total bakteri, BAL, E. coli dan analisa secara kualitatif terhadap keberadaan Salmonella.