1. Penyiapan kultur
Pengawetan Kultur (Dewanti et al. 2003). Kultur L. casei Rhamnosus,
L.casei Shirota, Lactobacillus F1, dan Lactobacillus G3, maupun patogen diawetkan dengan diimobilisasi dalam manik-manik sedangkan kultur
Bifidobacterium diawetkan dengan agar semisolid. Pengawetan dalam manik- manik dengan cara sebagai berikut: kultur BAL yang telah diinokulasikan dalam MRS Broth diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Kultur patogen yang telah diinokulasikan dalam Nutrient Broth diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian terhadap kultur segar ditambahkan gliserol steril dengan perbandingan 4:1 (kultur : gliserol) dan dikocok rata. Suspensi bakteri yang telah berisi gliserol dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi manik-manik steril sampai manik- manik tersebut terendam. Campuran tersebut kemudian dikocok dan sisa cairan dibuang. Kultur yang telah terimobilisasi disimpan pada suhu -20oC. Pengawetan
Bifidobacteria bifidum dan Bifidobacteria longum dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 ose kultur murni ke dalam agar semisolid yang dibuat dengan cara mencampurkan MRS Broth dengan Bacto agar sebanyak 0.5%, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Untuk membuat kondisi anaerob, digunakan alat ANOXOMAT (Gambar 6). Kultur yang telah terimobilisasi disimpan pada suhu -20oC.
Gambar 6 Alat ANOXOMAT (a) dan anaerobik jar (b). (a)
Penyegaran Kultur Bakteri Asam Laktat (BAL). Media yang digunakan untuk penyegaran kultur BAL adalah MRS Broth (MRSB). Kultur BAL disegarkan dengan menginokulasikan sebanyak ± 3 buah manik-manik ke dalam 10 ml MRS Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Inkubasi Lactobacillus secara aerob sedangkan Bidobacterium secara anaerob. BAL yang telah disegarkan dapat langsung dipakai. Penyegaran hanya dilakukan pada saat pengujian akan dilakukan.
Penyegaran Kultur Bakteri Patogen. Media yang digunakan untuk
penyegaran kultur E. coli, Salmonella dan B. cereus adalah media Nutrient Broth. Kultur patogen disegarkan dengan menginokulasikan ± 3 buah manik-manik kultur ke dalam 10 ml media Nutrient Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur patogen yang telah disegarkan dapat langsung dipakai.
2. Penyiapan Media Pengujian
Media pengujian yang digunakan adalah media berbasis MRS Broth tetapi glukosa pada media diganti dengan jenis gula yang digunakan. Media pengujian dibuat dengan mencampurkan 10 g proteose peptone, 5 g yeast exract, 1 g Tween 80.5 g Na-asetat, 0.2 g MgSO4.7H2O, dan 0.05 g MnSO4.4H2O. Selanjutnya
bahan tersebut diatur pH-nya hingga 6.4-6.6 dengan cara menambahkan HCl 1% atau NaOH 1%. Kemudian ditempatkan dalam tabung reaksi @ 9 ml dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Mineral K2HPO4.3H2O dibuat terpisah, dengan tujuan untuk menghindari terbentuknya
endapan dan kekeruhan. K2HPO4.3H2O dibuat dengan konsentrasi 100x
konsentrasi awal media, kemudian disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Sebanyak 0.1 ml larutan mineral K2HPO4.3H2O ditambahkan
secara aseptis ke dalam tabung yang berisi 8.9 ml MRS basis. Penambahan mineral K2HPO4.3H2O dilakukan pada saat akan melakukan uji pertumbuhan
BAL dan uji kompetisi antara BAL dengan patogen secara in vitro.
Ekstrak ubi garut dan cookies ubi garut yang digunakan disterilisasi dengan membran filter steril 0.45 µm kemudian disaring dengan membran steril 0.2 µm. Ekstrak tepung ubi garut maupun ekstrak cookies ubi garut yang sudah disterilisasi kemudian diukur total padatan terlarutnya. Standar glukosa dengan
konsentrasi 5% disterilisasi dengan metode yang sama. Sebanyak 1 ml ekstrak tepung ubi garut atau cookies ubi garut steril atau standar glukosa steril ditambahkan ke dalam 9 ml MRS basis steril secara aseptis. Sehingga diperoleh kandungan ekstrak tepung ubi garut 0.5% TPT, kandungan ekstrak cookies ubi garut 0.5% TPT dan konsentrasi standar glukosa 0.5% dalam media pengujian.
Cara penyiapan media pengujian untuk ekstrak ubi jalar dan hasil olahannya (cookies ubi jalar dan SPF) sama dengan cara penyiapan media pengujian untuk ekstrak ubi garut, tetapi ekstrak ubi garut diganti dengan ekstrak ubi jalar atau cookies ubi jalar atau SPF.
3. Penyiapan Bahan
Pembuatan Tepung Ubi Garut. Ubi garut yang sudah dipanen,
dibersihkan dari tanah dengan melakukan pencucian menggunakan air mengalir.
Gambar 7 Tahapan pembuatan tepung ubi garut
Ubi garut var Creole
Penghilangan akar dan pengupasan kulit ari
Pengirisan
Pengeringan pada T = 55oC, t = 15 jam
Penggilingan dengan willey mill
Tepung ubi garut Pengayakan 60 mesh
Kemudian akar halus dan kulit ari yang menempel pada ubi garut dibuang secara manual menggunakan tangan. Ubi garut diiris dengan ketebalan ± 2-3 mm menggunakan electric slicer, dikeringkan dengan pengering (cabinet drier) pada suhu ± 55 0C selama ± 15 jam. Selama belum digunakan, irisan ubi garut kering
dikemas secara vakum menggunakan vacuum packer dan disimpan dalam
pendingin (refrigerator). Irisan ubi garut kering selanjutnya digiling menggunakan willey mill hingga 60 mesh. Tahapan pembuatan tepung ubi garut dapat dilihat pada Gambar 7.
Pembuatan Tepung Ubi Jalar. Ubi jalar putih varietas Sukuh,
dibersihkan dari tanah dengan melakukan pencucian menggunakan air mengalir selanjutnya dikupas dan diiris dengan ketebalan ±1 mm, lalu dikeringkan dengan oven pengering pada suhu 55oC selama 20 jam dan digiling dengan willey mill
hingga 60 mesh. Tahapan dalam pembuatan tepung ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Tahapan pembuatan tepung ubi jalar Ubi jalar var Sukuh
Pengupasan
Pengirisan
Pengeringan pada T = 55oC, t =20 jam
Penggilingan dengan willey mill
Pengayakan 60 mesh
Pembuatan Tepung SPF. SPF yang diperoleh dari Seafast Center selanjutnya dibuat tepung dengan cara digiling menggunakan waring blender
kering, kemudian diayak dengan ayakan 60 mesh.
Pembuatan Cookies Ubi Garut. Tepung ubi garut yang diperoleh
kemudian dibuat cookies. Formulasi yang digunakan: 180 g mentega (Blue BandTM), 80 g gula halus, 2 butir kuning telur, 280 g tepung ubi garut. Cara pembuatannya: mentega dan gula halus dikocok hingga berwarna putih dan mengembang, kuning telur dimasukkan satu persatu sambil dikocok, terakhir tepung ubi garut dimasukkan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan spatula. Adonan cookies dicetak dan diletakkan di atas loyang yang sudah diolesi dengan mentega. Selanjutnya adonan dipanggang dalam oven pada suhu 1500C selama 17 menit.
Pembuatan Cookies Ubi Jalar. Formulasi dan cara pembuatan cookies
ubi jalar yang digunakan sama dengan pembuatan cookies ubi garut, hanya tepung ubi garut diganti dengan tepung ubi jalar.
Pembuatan Ekstrak Gula dan Oligosakarida (Muchtadi 1989). Ekstraksi gula dan oligosakarida tepung ubi garut, cookies ubi garut, tepung ubi jalar, cookies ubi jalar maupun tepung SPF memakai etanol 70% dengan pengadukan selama 15 jam menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang. Untuk 100 gram tepung ubi garut atau cookies ubi garut atau tepung ubi jalar atau
cookies ubi jalar atau tepung SPF memerlukan 1000 ml etanol 70%. Setelah proses ekstraksi selesai kemudian dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring Whatman no.1 dan dibilas dengan etanol 70%. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan eveporator vakum pada suhu 40oC. Ekstrak pekat kemudian disentrifus pada 2000 x g selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran dan padatan sehingga memudahkan dalam sterilisasi. Sterilisasi ekstrak tepung ubi garut, cookies ubi garut, tepung ubi jalar, cookies ubi jalar maupun tepung SPF dilakukan secara bertahap, setelah disentrifus kemudian ekstrak disaring dengan membran filter steril 0.45 µm kemudian disaring dengan membran steril 0.2 µm. Ekstrak tepung ubi garut, cookies ubi garut, tepung ubi jalar, cookies ubi jalar maupun tepung SPF yang sudah disterilisasi kemudian
diukur total padatan terlarutnya. Diagram ekstraksi gula dan oligosakarida dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Diagram ekstraksi gula dan oligosakarida.