OF FEMALE MICE INDUCED BY BENZO(α)PIREN
METODE PENELITIAN
3.10 Uji Efek Antikarsinogenesis
3.10.2 Penyiapan sediaan uji
Penyiapan sediaan uji meliputi penyiapan CMC 1%, penyiapan suspensi ekstrak daun bangun-bangun, penyiapan larutan penginduksi
benzo(α)piren, dan penyiapan larutan buffer netral formalin 10%. 3.10.2.1Penyiapan CMC 1%
sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.10.2.2Penyiapan larutan benzo(α)piren 15 mg/kg bb
Penyiapan larutan penginduksi benzo(α)piren 15 mg/kg bb dilakukan
dengan cara sebagai berikut: Sebanyak 100 mg benzo(α)piren dilarutkan dalam 100 ml minyak zaitun dan dipastikan semua benzo(α)piren sudah larut.
3.10.2.3Penyiapan suspensi ekstrak etanol daun bangun-bangun (SEEDBB)
Suspensi ekstrak etanol daun bangun bangun dibuat menjadi 3 dosis yaitu, 250 mg/kg bb, 500 mg/kg bb dan 750 mg/kg bb. Pembuatan suspensi ekstrak daun bangun-bangun dosis 250 mg/kg bb dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 625 mg ekstrak etanol daun bangun-bangun ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling hingga batas tanda. Dengan cara yang sama dilakukan untuk dosis 500 mg/kg bb dan 750 mg/kg bb.
3.10.2.4Penyiapan larutan formalin 10%
Sebanyak 4 gram Natrium dihidrogen phospat dilarutkan dalam air suling kemusian ditambahkan 6,5 gram dinatrium dihidrogen phospat diaduk
hingga larut. Ditambahkan 100 ml formalin 37% dan ditambahkan air suling hingga 1000 ml.Cek pH menggunakan pH meter (pH 6-7).
3.10.2.5Uji Antikarsinogenesis
Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 5 kelompok, masing-masing terdiri dari 5 ekor hewan percobaan. Kelompok tersebut adalah:
- Kelompok I: Kontrol normal, hewan percobaan diberikan makanan standar selama 7 hari berturut-turut dan tidak diinduksi dengan
benzo(α)piren dan tidak diberikan ekstrak uji. Selama 28 hari berat badan mencit ditimbang satu per satu.
- Kelompok II: Kontrol negatif, hewan percobaan diberikan makanan standar selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 8 diberikan
benzo(α)piren dosis 15 mg/kg bb secara sub kutan selama 14 hari tanpa diberikan ekstrak uji. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
- Kelompok III: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standar dan diinduksi dengan benzo(α)piren dosis 15 mg/kg secara sub kutan selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan EEDBB dosis 250 mg/Kg bb secara per oral, selama 14 hari berturut-turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
- Kelompok IV: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standar dan diinduksi dengan benzo(α)piren dosis 15 mg/kg secara sub kutan selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan EEDBB dosis 500 mg/Kg bb secara per oral, selama 14 hari berturut-turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
- Kelompok V: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standar dan diinduksi dengan benzo(α)piren dosis 15 mg/kg secara sub kutan, selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan EEDBB dosis 750 mg/Kg bb secara per oral, selama 14 hari berturut-turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
3.10.2.6Pengambilan jaringan
Mencit dibunuh dengan cara cervical dislocation (dislokasi leher) lalu mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins. Bulu mencit dicukur mulai dari daerah perut kemudian sisa bulu dibersihkan dengan menggunakan kapas yang dibasahi air. Bedah dimulai dari bagian perut menggunakan gunting bengkok, kemudian diambil dan dipisahkan masing-masing organ menggunakan gunting lurus (bagian yang diambil ± 5-10 mm sekitar tumor mammae). Organ yang diambil dibersihkan dari lemak-lemak yang menempel,
kemudian dicuci dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% setelah itu diamati secara makroskopik nodul yang tampak. Organ ditiriskan diatas kertas saring, setelah air berkurang masing-masing organ dimasukkan ke dalam pot berisi larutan buffer netral formalin 10%.
3.10.2.7Pemeriksaan gambaran jaringan kelenjar payudara dengan pewarnaan hematoxylin dan eosin
Pemeriksaan histopatologi organ mencit dengan pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin. Proses pembuatan preparat histopatologi dan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin :
1. Penyiapan jaringan tumor payudara untuk dipotong
Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan Buffer Netral Formalin (BNF) 10% minimal 48 jam hingga mengeras (matang). Sampel organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ± 0,5 cm. Potongan kemudian dimasukkan dalam tissue cassette untuk dimasukkan dalam automatic tissue processor.
2. Dehidrasi
Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan mencegah terjadinya pengerutan sampel yang akan diuji. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut). Proses perendaman masing-masing konsentrasi alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan mesin otomatis yaitu automatic tissue processor.
3. Clearing
Proses clearing atau penjernihan dilakukan dengan 2 tahap dengan menggunakan xylol I dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk melarutkan alkohol.
4. Infiltrasi
Infiltrasi dan impregnasi adalah proses pengisian parafin kedalam pori-pori jaringan. Pengisian pori-pori-pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah parafin histoplast®.
5. Embedding dan Blocking
Embedding atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam
blok parafin. Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan dengan menggunakan alat tissue embedding console.
6. Sectioning
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan
mikrotom dengan ketebalan 2-3 µm. Pemotongan dilakukan dengan alat rotary
microtom. Dimasukkan ke dalam waterbath, agar parafin mencair dari dalam
organ yang telah dipotong, kemudian organ diambil menggunakan object glass
dan disimpan dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam. 7. Pewarnaan Haematoxyllin-Eosin
Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi dengan larutan xylol (I dan II) selama 2 menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat (alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%). Perendaman dalam
alkohol 95% dan 80% dilakukan selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air yang mengalir (air kran) selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Mayer’s Haematoxyllin dengan tahapan sebagai berikut:
a. Preparat direndam dalam larutan Mayer’s Haematoxyllin selama 8 menit.
b. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 detik.
c. dicelupkan ke dalam larutan Lithium Carbonat selama 15-30 detik. d. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 2 menit.
e. direndam dalam larutan Eosin selama 2-3 menit.
f. dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30-60 detik.
g. dilakukan proses rehidrasi dan clearing dengan cara preparat dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95% dan alkohol absolut sebanyak 10 kali celupan, absolut I selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit.
8. Setelah pewarnaan, sediaan ditetesi perekat Canada balsem (Entellan®) dan ditutup dengan cover glass.
9. Diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya.
