3. METODE 1 Waktu dan Tempat
3.4 Prosedur Penelitian dan Parameter serta Variabel Pengamatan Prosedur penelitian Prosedur penelitian
Penentuan titer virus HPAI
Titer virus AI yang akan digunakan adalah berkisar antara 107-109 EID50, didasarkan referensi bahwa jumlah virus AI yang dapat terkandung dalam 1 gram
feses adalah 108,7 EID50/gram feses (Kamps et al. 2006) . Metode titrasi mengacu pada Hitchner et al. (1975) dengan rumus perhitungan menggunakan metode Spearman-Karber.
Penentuan sediaan kaporit, dosis klorin dan residu klorin
Metode pengukuran klorin yang digunakan adalah Titrasi Iodometrik atau metode kanji (Sawyer et al. 1994). Pada metode ini, sejumlah kaporit yang akan dilarutkan ditambah dengan 100 ml akuabides steril. Larutan dimasukkan kedalam tabung Erlenmeyer Asa kemudian ditambahkan 5 ml H2SO4 dan 0,05 gram Natrium bikarbonat serta 5 ml Kalium iodat secara berurutan lalu dikocok sehingga warna berubah menjadi coklat. Selanjutnya dilakukan titrasi dengan menggunakan sodium thiosulfat sampai warna berubah menjadi kuning pucat. Kanji 3% ditambahkan sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh warna biru dan dititrasi lagi dengan sodium thiosulfat 1-2 tetes sampai warna larutan menjadi jernih. Volume penitar yang telah digunakan kemudian dicatat.
Penghitungan klorin dilakukan dengan rumus sebagai berikut :
Klorin (ppm)
= Vol. penitar X N 2NaVolume Larutan (Kaporit) 2S2O3 X Bobot setara Cl2 X 1000
Selanjutnya, dosis klorin yang digunakan adalah ± 150 ppm (Srikaeo dan Hourigan 2002). Dengan demikian diperlukan beberapa sampel dosis kaporit dengan berat yang berbeda untuk memperoleh nilai dosis klorin yang diinginkan. Beberapa sediaan kaporit dengan berat yang berbeda dilarutkan dalam akuabides sampai diperoleh dosis klorin ± 150 ppm. Berat sediaan yang ditemukan selanjutnya diulang pengukurannya sebanyak 3 kali untuk memperoleh nilai rata-rata dosis kaporit.
Penentuan demand klorin telur, cairan alantois dan feses
Demand Telur. Sebanyak 30 butir telur masing-masing dicelup dalam tabung yang mengandung 100 ml akuabides dengan dosis klorin ± 150 ppm dan kemudian dipilih 3 butir secara acak dengan cara diundi. Setelah pencelupan selama 60 detik, air dari masing-masing tabung diukur kandungan residual klorinnya dan ditentukan rata-ratanya.
31
Demand Cairan Alantois. Sebanyak 100 µl cairan alantois dimasukkan dalam tabung yang berisi 100 ml akuabides dengan dosis klorin ± 150 ppm. Setelah perlakuan selama 60 detik, air dari tabung diukur residual klorinnya. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali untuk memperoleh nilai rata-rata.
Demand feses. Sebanyak 1 gram feses yang dibuat dari 0,9 ml cairan alantois murni dengan 0,12 gram feses dimasukkan dalam tabung yang berisi 100 ml akuabides dengan dosis klorin ± 150 ppm. Setelah perlakuan selama 60 detik, air dari tabung diukur residual klorinnya. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali untuk memperoleh nilai rata-rata.
Pada ketiga perlakuan tersebut, Demand klorin diperoleh dengan mengurangi dosis klorin dengan jumlah residual klorin yang telah diukur.
Uji Viabilitas virus pada permukaan kerabang
Persiapan bahan. Feses yang digunakan adalah ± 5,25 gram. Telur dibagi dalam 2 kelompok yaitu kelompok telur bersih yang dicemari virus (Kelompok A, 21 butir) dan kelompok telur yang dicemari dengan feses bervirus (Kelompok B, 21 butir).
Kelompok A (21 butir). Telur dicemari dengan 100 µl isolat virus AI Subtipe H5 dengan cara dioles. Selanjutnya, telur disimpan selama 21 jam pada suhu ruang (± 250C) dalam ruangan perlakuan. Setiap 3 jam, diambil 3 butir telur secara acak untuk dideteksi dan diamati viabilitas virus AI-nya.
Kelompok B (21 butir). Telur dicemari dengan feses bervirus dengan cara dioles. Perbandingan feses dengan virus adalah 0,12 gram dan 0,9 ml isolat (total berat 1 gram) secara berurutan. Campuran tersebut digunakan untuk mencemari 4 butir telur. Setelah dicemari dan didiamkan sampai feses mengering pada permukaan kerabang, telur disimpan selama 21 jam pada suhu ruang (± 250C). Setiap 3 jam, diambil 3 butir telur secara acak untuk dideteksi dan diamati viabilitas virus AI-nya.
Gambar 5 Uji Viabilitas virus HPAI Subtipe H5 pada permukaan kerabang telur konsumsi.
Pada kedua perlakuan di atas, swab dan kerokan kerabang diinokulasikan pada telur SPF, 96 jam kemudian virus dipanen dan dilakukan uji HA cepat menggunakan RBC 10% dengan perbandingan 1:1. Pengamatan viabilitas dilakukan sampai dengan jam ke-21.
Klorinasi telur tercemar virus HPAI
Kelompok Kontrol Positif I (6 butir). Telur dicemari dengan isolat virus dengan cara dioles dan dibiarkan mengering (pengamatan visual) pada suhu ruang.
Kelompok Kontrol Positif II (6 butir). Telur dicemari dengan feses bervirus dengan cara dioles dan dibiarkan mengering (pengamatan visual) pada suhu ruang.
Kelompok Perlakuan I Telur Bersih (12 butir). Telur dicemari isolat virus dengan cara dioles. Telur dibiarkan mengering (pengamatan visual) pada suhu ruang. Segera setelah kering, 6 butir telur masing-masing dicelup dalam 100 ml akuabides yang mengandung ± 150 ppm klorin selama 30 detik dan 6 butir lainnya dicelup dengan volume akuabides dan dosis klorin yang sama selama 60 detik secara berurutan.
Kelompok Perlakuan II Telur Kotor (12 butir). Telur dicemari feses bervirus dengan cara dioles. Telur dibiarkan mengering (pengamatan visual) pada suhu ruang. Segera setelah kering, 6 butir telur masing-masing dicelup dalam 100 ml akuabides yang mengandung ± 150 ppm klorin selama 30 detik dan 6 butir lainnya dicelup dengan volume akuabides dan dosis klorin yang sama selama 60 detik secara berurutan.
33
(a) (b)
Gambar 6 Klorinasi pada telur bersih (a) dan klorinasi pada telur kotor (b).
Seluruh telur pada kelompok kontrol dan perlakuan selanjutnya di-swab dan dikerok untuk selanjutnya diinokulasikan pada telur SPF, 96 jam kemudian virus dipanen dan dilakukan uji HA cepat menggunakan RBC 10% dengan perbandingan 1:1. Pengamatan viabilitas dilakukan sampai dengan jam ke-21. Pengujian Kualitas Telur
Sebanyak 40 butir telur dipilih secara acak (diundi) dan dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Pada kelompok kontrol, telur tidak diberi perlakuan sama sekali sedangkan pada kelompok perlakuan, telur diklorinasi dengan cara dicelup menggunakan dosis klorin ± 150 ppm. Telur perlakuan selanjutnya dibiarkan mengering dan kedua kelompok dibiarkan tersimpan pada suhu ruang (± 250C) selama 10 hari. Setelah masa perlakuan selesai, indeks putih dan kuning telur kelompok kontrol dan kelompok perlakuan diukur dengan menggunakan Electronic Digital Caliper 0-150 mm. Pengujian Residu Klorin
Pengujian residu klorin dilakukan dengan tahapan kualitatif dari metode Titrasi Iodometrik. Sebanyak 3 butir telur dipilih secara acak dengan diundi dari 30 butir telur. Telur yang terpilih selanjutnya dicelup dalam 100 ml akuabides yang mengandung klorin ± 150 ppm. Telur dibiarkan kering visual, kemudian dengan hati-hati dipecah. Putih dan kuning telur ditampung dalam cawan petri. Sejumlah 10 ml putih telur diambil dan dicampur dengan 90 ml akuabides untuk selanjutnya dideteksi kandungan klorinnya.
Campuran akuabides dan putih telur selanjutnya dimasukkan dalam Erlenmeyer Asa kemudian ditambahkan 5 ml H2SO4 dan 0,05 gram Natrium
Karbonat serta 5 ml Kalium Iodat. Selanjutnya dilakukan pengamatan apakah terjadi perubahan warna menjadi coklat ataukah tidak.
Parameter serta Variabel Pengamatan Parameter pengamatan
Klasifikasi parameter penelitian ini sesuai dengan ruang lingkup penelitian. Pada uji viabilitas, parameter yang menjadi perhatian adalah jenis isolat virus yang digunakan, titer isolat virus HPAI Subtipe H5, hasil uji HA post inokulasi, daya hidup virus HPAI Subtipe H5 pada permukaan telur bersih dan telur kotor selama 21 jam, suhu dan kelembapan ruangan yang digunakan untuk perlakuan uji viabilitas.
Pada perlakuan klorinasi, parameter yang menjadi perhatian adalah jenis bahan pelepas klorin (chlorine generator) yang digunakan, media cair yang digunakan untuk imersi, berat kaporit, dosis klorin, lama waktu pencelupan, pH dan suhu media pencelupan serta residu klorin.
Pada uji kualitas telur, parameter yang diamati adalah indeks putih telur dan indeks kuning telur.
Variabel pengamatan
Variabel yang diamati pengaruhnya pada penelitian ini adalah permukaan kerabang bersih, permukaan kerabang kotor, dosis klorin, lama waktu pencelupan dan waktu perlakuan untuk uji viabilitas.