METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba 3.4.1.1 Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar)
Media Potato Dextrose Agar (PDA) plate dibuat untuk isolasi kapang endofit dan pemurnian kapang endofit. Media ini dibuat dengan cara PDA ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian ditambahkan aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media dituang ke dalam cawan petri secara aseptis masing-masing ±10 mL, lalu dibiarkan di suhu ruang hingga media memadat (Ramadhan, 2011).
3.4.1.2Pembuatan Media Agar Miring PDA(Potato Dextrose Agar)
Media agar miring Potato Dextrose Agar (PDA) dibuat untuk pemurnian (pembuatan stock culture) kapang endofit. Media ini dibuat dengan cara Potato Dextrose Agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian ditambahkan aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Kemudian media dituang ke dalam tabung slant masing-masing ±5 mL. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media yang telah steril diletakkan dalam posisi miring ±45º dan media dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).
3.4.1.3Pembuatan Media NA (Nutrient Agar)
Media Nutrient Agar (NA) plate dibuat untuk isolasi dan pemurnian bakteri endofit, skrining antibakteri mikroba endofit serta peremajaan bakteri uji. Media ini dibuat dengan cara Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 20 gram dan dilarutkan dalam aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121ºC. Kemudian media dituang ke dalam cawan petri masing-masing ±10 mL, media dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).
3.4.1.4Pembuatan Media Agar Miring NA (Nutrient Agar)
Media agar miring Nutrient Agar (NA) dibuat untuk pemurnian (pembuatan stock and working culture) bakteri endofit. Media ini dibuat dengan cara Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 20 gram dan dilarutkan dalam aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Kemudian media dituang ke dalam tabung slant masing-masing 5 mL. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media yang telah steril diletakkan dalam posisi miring ±45º dan media dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).
3.4.1.5Pembuatan Media MHA (Mueller Hinton Agar)
Media Mueller Hinton Agar (MHA) plate dibuat untuk uji antibakteri dari supernatan hasil fermentasi mikroba endofit. Media ini dibuat dengan cara 38 gram media Mueller Hinton Agar (MHA) disuspensikan dengan 1 liter aquades. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Kemudian media dituang ke dalam cawan petri masing-masing ±10 mL, media dibiarkan memadat (Adawiyah, 2013).
3.4.1.6Pembuatan Media PDY Broth (Potato Dextrose Yeast Broth)
Media PDY Broth dibuat untuk media fermentasi kapang endofit. Media ini dibuat dengan cara ditimbang 24 gram Potato Dextrose Broth, 2 gram Yeast extract, 5 gram Kalsium karbonat (CaCO3). Semua bahan kecuali Kalsium karbonat dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, ditambahkan aquades hingga 1 liter, dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot plate. Kalsium karbonat ditambahkan sedikit demi sedikit ke larutan media tersebut hingga dicapai pH 6-7. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121ºC (Ramadhan, 2011).
3.4.1.7Pembuatan Media NB (Nutrient Broth)
Pembuatan media NB (Nutrient Broth) berdasarkan instruksi pada kemasan. Media NB (Nutrient Broth) dibuat untuk media fermentasi bakteri endofit. Media ini dibuat dengan cara ditimbang sebanyak 8 gram Nutrient Broth, kemudian ditambahkan aquades hingga 1 liter dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot plate. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121ºC.
3.4.2 Isolasi Mikroba Endofit 3.4.2.1 Sampling Tanaman
Daun dari tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 4 helai beserta pucuk daun yang masih segar diperoleh dari koleksi Kebun Raya Bogor, lalu dideterminasi di Lembaga Penelitian Biologi atau Herbarium Bogoriense, Bogor.
3.4.2.2Sterilisasi Permukaan
Sampel daun sebanyak 4 helai beserta pucuk daun yang masih segar dicuci di bawah air mengalir selama 10 menit. Sterilisasi permukaan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Daun direndam di dalam alkohol 70% selama 1 menit, sambil di kocok pelan. Lalu dipindahkan ke dalam larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25% selama 5 menit. Selanjutnya daun tersebut direndam kembali di dalam alkohol 70% selama 30 detik (Radji et al., 2011). Setelah itu dibilas dengan aquades steril selama 1 menit dan diulang dua kali. Daun tersebut dikeringkan di atas kertas saring steril (Ariyono et al., 2014). Kemudian daun dipotong-potong menjadi beberapa bagian kecil dengan ukuran ± 1 x 1 cm2 pada daun yang berada didekat pucuk, ditengah ranting, dipangkal ranting dengan gunting bedah steril dan pada bagian pucuk daun dibelah menjadi 2 bagian dengan pisau bedah steril. Selanjutnya secara hati-hati diletakkan pada media isolasi PDA dan NA. Setiap cawan petri berisi satu atau dua potongan. Selanjutnya pada media PDA diinkubasi pada suhu ruang selama 14 hari dan pada media NA diinkubasi pada suhu 35ºC selama 3 hari. Semua proses sterilisasi hingga proses pengeringan dilakukan secara aseptis di dalam LAFC (Ramadhan, 2011).
Kemudian pada aquades steril bilasan terakhir diambil dengan menggunakan batang L dan diisolasi ke PDA dan NA lainnya, perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol. Perlakuan kontrol berfungsi untuk mengetahui dan menentukan apakah mikroba yang tumbuh merupakan mikroba endofit atau bukan. Apabila pada media PDA dan NA kontrol tumbuh mikroba, maka mikroba yang tumbuh bukanlah mikroba endofit. Sedangkan apabila pada media PDA dan NA kontrol tidak tumbuh mikroba, maka mikroba yang tumbuh adalah mikroba endofit (Ariyono et al., 2014).
3.4.3 Pemurnian Mikroba Endofit 3.4.3.1Pemurnian Kapang Endofit
Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi kemudian dimurnikan ke dalam media PDA plate lain. Koloni yang mempunyai bentuk yang berbeda dengan koloni lainnya dapat dianggap sebagai isolat yang berbeda. Kemudian dilakukan pemurnian sampai diperoleh isolat murni (tunggal).
Pemurnian dilakukan dengan cara menginokulasikan sedikit hifa dengan ose atau pinset dari setiap koloni endofit yang berbeda ke media PDA dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (Kumala et al., 2006). Selanjutnya isolat kapang yang telah murni dipindahkan ke dalam media PDA lain untuk digunakan sebagai working culture dan media agar miring PDA yang digunakan sebagai stock culture. Kultur kapang endofit diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (Kumala dan Endro, 2007).
3.4.3.2Pemurnian Bakteri Endofit
Bakteri yang tumbuh pada media isolasi NA, disubkultur pada plate media NA pada suhu 35ºC selama 24-48 jam, sampai diperoleh koloni murni. Koloni murni kemudian dipindahkan ke agar miring NA dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35ºC. Setiap isolat bakteri endofit dibuat dua pada agar miring NA, masing-masing dipergunakan sebagai stock culture dan working culture (Rosana, 2001).
3.4.4 Karakterisasi Mikroba Endofit 3.4.4.1Karakterisasi Kapang Endofit
