METODE PENELITIAN
2) Uji Kemurnian Mikroskopis Bakteri Uji
Uji kemurnian secara mikroskopis dilakukan pengamatan dengan metode pewarnaan Gram, yaitu menyiapkan preparat uji dengan mengoleskan bakteri setipis mungkin di atas kaca objek yang kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas nyala api sebentar untuk melekatkan bakteri. Preparat tersebut diwarnai dengan larutan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir selama 5 detik, diteteskan larutan lugol di atas preparat dan dibiarkan selama selama 1 menit, dicuci kembali dengan air mengalir kemudian dicuci dengan alkohol 96% selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol lalu dicuci kembali dengan air mengalir. Diteteskan larutan safranin selama 10-30 detik kemudian dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan cara diletakkan di atas kertas saring dan diperiksa preparat di bawah mikroskop (Handayani, 2007).
3.4.6 Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium diinokulasi sebanyak satu ose ke media agar miring NA dan diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35ºC (Radji, 2006).
3.4.7 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji
Hasil peremajaan bakteri uji pada agar miring NA ditambahkan dengan 5 mL NaCl 0,9% steril. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri masing-masing diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL yang berisi media NB 200 mL,
dikocok dan NB steril tanpa suspensi bakteri sebagai kontrol. Spektrofotometer visibel diatur dengan panjang gelombang 600 nm, kuvet dibersihkan kemudian diukur absorban awal NB steril sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri pada menit ke-0 (t0). Setelah absorban awal ditentukan, media NB diinkubasi pada pengocokan 120 rpm pada temperatur 35°C. Setiap interval 30 menit dilakukan pengukuran absorban untuk mendapatkan kurva pertumbuhan. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah melewati fase stasioner (Khotimah, 2010).
3.4.8 Skrining Mikroba Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri 3.4.8.1Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri
Skrining kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium. Masing-masing suspensi bakteri uji pada media NB yang telah berumur fase mid log diambil 0,1 mL dan dipipetkan ke dalam media agar NA padat dan disebarkan secara merata dengan menggunakan batang drigalski (Spread Plate Method). Kemudian, isolat kapang endofit yang telah dimurnikan ke dalam media PDA diambil dengan sedotan steril berdiameter 6 mm dan ditempelkan di atas permukaan media NA yang berisi bakteri uji. Satu cawan petri media NA yang telah berisi bakteri uji dapat ditanami potongan isolat murni kapang endofit ±6 isolat. Kultur di inkubasi pada suhu 35°C selama 3 hari. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona hambat di sekitar kapang endofit. (Melliawati & Harni, 2009). Isolat yang menunjukkan zona hambat dipilih sebagai isolat untuk pengujian selanjutnya yaitu fermentasi dan uji aktivitas antibakteri.
3.4.8.2Skrining Bakteri Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri
Skrining bakteri endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram (disc diffusion methods). Bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium. Masing-masing suspensi bakteri uji pada media NB yang telah berumur fase mid log diambil 0,1 mL dan dipipetkan
ke dalam media agar NA padat dan disebarkan secara merata dengan menggunakan batang drigalski. Isolat bakteri endofit yang telah berumur 24 jam di media agar miring NA, kemudian ditambahkan 5 mL NaCl 0,9% steril. Sebanyak 10 µL suspensi bakteri endofit diserapkan pada cakram steril berdiameter 5 mm dan dikeringkan. Setelah itu, cakram diletakkan di atas media NA yang telah diinokulasi dengan bakteri uji, kemudian dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC, dan diamati ada tidaknya zona bening yang terbentuk (Simarmata et al., 2007 dengan modifikasi).
3.4.9 Fermentasi Mikroba Endofit 3.4.9.1Fermentasi Kapang Endofit
Kapang endofit yang terseleksi positif menghasilkan zona hambat dilakukan fermentasi. Proses fermentasi dimulai dengan menumbuhkan kultur murni pada media PDA selama ±7 hari. Miselia dan media agar dari fungi endofit diambil sebanyak 3 bulatan berdiameter 6 mm kemudian dimasukkan ke dalam media PDY 200 mL dan dilakukan inkubasi selama 21 hari pada suhu ruang dalam kondisi stasioner (Phongpaichit et al., 2006 dengan modifikasi). Hasil fermentasi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatan yang diperoleh dijadikan sebagai larutan uji aktivitas antibakteri (Rosana et al., 2001 dalam Kumala dan Endro, 2007).
3.4.9.2Fermentasi Bakteri Endofit
Dilakukan fermentasi cair dengan menggunakan media NB sebanyak 10 mL dalam tabung bersumbat kapas. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 2 hari dengan kecepatan shaker 170 rpm. Biomassa sel dipanen dengan menggunakan sentrifus berpendingin 3000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan dari hasil sentrifus digunakan untuk uji aktivitas antibakteri (Kumala et al., 2006).
3.4.10 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Mikroba Endofit
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram (disc diffusion methods). Sebanyak 20 µL larutan uji (supernatan dari hasil fermentasi mikroba endofit) diserapkan pada kertas cakram steril berdiameter 6 mm. Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan media MHA padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium) dengan metode pour plate yaitu dengan cara mengambil 1 mL suspensi bakteri uji pada fase mid log menggunakan pipet, kemudian diteteskan ke dalam cawan petri steril dan selanjutnya ditambahkan media MHA cair suhu ±55°C sebanyak 10 mL lalu digoyangkan sampai suspensi bakteri uji merata di seluruh media, didiamkan sampai membeku dan media siap digunakan. Sebagai kontrol positif digunakan cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg dan kontrol negatif yaitu aquades steril yang diserapkan pada cakram dan dikeringkan. Setelah semua cakram diletakkan di atas permukaan media MHA tersebut, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC. Aktivitas antibakteri dinyatakan sebagai diameter zona hambat (mm) yang dihasilkan oleh supernatan hasil fermentasi mikroba endofit. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong (Radji et al., 2011 dengan modifikasi).
BAB IV
