BAB I. PENDAHULUAN
D. Prosedur Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode Lowry untuk menentukan konsentrasi protein dan penentuan aktivitas enzim tripsin dengan metode Anson. Prosedur kerja dilakukan dengan langkah sebagai berikut:
1. Penentuan Kadar Protein Baku (Kasein) dengan Metode Lowry
Kadar protein baku (kasein) diukur dengan metode Lowry (Lowry, O. H., et al., 1951). Prosedur pengukuran kadar protein sebagai berikut:
Gambar 11. Bagan Prosedur Penentuan Kadar Protein 0,2 mL Larutan sampel protein 5-100 µg Ditambah 1 mL Reagen C Dikocok Diamkan 10 menit pada suhu kamar Ditambah 0,1 mL Reagen E Dikocok Diamkan 30 menit pada suhu kamar Ukur absorbansi pada panjang gelombang tertentu
24
a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Pengukuran panjang gelombang maksimum menggunakan larutan kasein 1 mg/mL yang dilarutkan dalam buffer fosfat pH 8. Pengamatan panjang gelom- bang maksimum dilakukan dengan pengukuran absorbansi pada λ 650-750 nm. Penelitian dilakukan dengan mengacu pada prosedur Lowry dengan sedikit perubahan. Pada penelitian digunakan 1 mL larutan sampel kasein 1 mg/mL, 5 mL reagen C, dan 0,5 mL reagen E. Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 1.
b. Penentuan Kurva Standar Protein Kasein
Penentuan kurva standar protein kasein dilakukan dengan prosedur yang sama seperti lampiran 1. Hasil panjang gelombang maksimum digunakan untuk mengukur absorbansi dari variasi konsentrasi sampel, yaitu kasein: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; dan 1 mg/mL. Prosedur ini dilakukan sebanyak tiga kali (triplo). Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 2.
2. Penentuan Kadar Protein Tripsin
Tripsin sebanyak 8 mg dilarutkan ke dalam 20 mL larutan buffer fosfat (pH = 8) untuk menentukan kadar protein perlakuannya sama seperti Lampiran 1, tetapi larutan kasein diganti dengan larutan tripsin sebanyak 1 mL. Prosedur ini dilakukan sebanyak tiga kali (triplo). Bagan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 3.
25 5 mL substrat Ditambah 1 mL enzim Diaduk Setelah 10 menit, ditambah 10 mL 0,3 N TCA Dikocok Suspensi disaring Setelah 30 menit 5 mL Filtrat TCA Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 2 - 10 menit
3. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin dengan Metode Anson
Penentuan aktivitas enzim tripsin dilakukan dengan metode Anson. Menurut M. L. Anson (1938), prosedur penentuan aktivitas enzim tripsin dari metode Anson sebagai berikut:
Standar Sampel Blanko
Gambar 12. Bagan Prosedur Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin dengan Metode Anson 1 mL enzim Ditambah 10 mL 0,3N TCA Diaduk Ditambah 5 mL substrat, 1 mL air, 1 mL tirosin Dikocok Suspensi disaring Setelah 30 menit 5 mL Filtrat TCA Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 5 menit 5 mL tirosin Ditambah 10 mL 0,5 N NaOH Ditambah 3 mL reagen fenol Baca serapan Setelah 5 menit
26
Prosedur tersebut dilakukan untuk menghitung unit aktivitas enzim tripsin dari nilai warna filtrat pencernaan pada miliekivalen tirosin. Substrat yang diguna- kan adalah campuran hemoglobin dan buffer fosfat pH 7,5 serta reagen yang lain. Pada standar dan blanko menggunakan 0,0008 miliekuivalen tirosin (dalam 5 mL 0,2 N asam klorida dan 0,5% formaldehid sebagai pengawet).
Pada penelitian ini prosedur metode Anson tersebut digunakan untuk menentukan aktivitas dari enzim tripsin dengan melakukan beberapa modifikasi. Prosedur metode Anson termodifikasi yang digunakan mengacu pada prosedur modifikasi dari Togu Gultom dan Eddy Sulistyowati (2012: 42 - 43) dengan digunakan TCA 10% yang dapat dilihat pada bagan di Lampiran 4.
a. Penentuan pH Optimum
Menyiapkan beberapa tabung reaksi masing – masing untuk tabung sam- pel, kontrol, dan blanko. Pada penentuan pH optimum digunakan buffer fosfat 0,1 M dengan variasi pH 7; 8; dan 9. Prosedur kerja dilakukan sama seperti Lampiran 4, tetapi pada tabung sampel dan tabung kontrol digunakan substrat kasein 1% dengan variasi pH 7; 8; dan 9.
b. Penentuan Suhu Optimum
Menyiapkan beberapa tabung reaksi masing – masing untuk tabung sampel, kontrol dan blanko. Prosedur kerja dilakukan sama seperti Lampiran 4. Penentuan suhu optimum dilakukan pada berbagai suhu inkubasi, yaitu 31°C; 33°C; 35°C; 37°C; dan 39°C. Waktu inkubasi yang digunakan selama 20 menit dan pH optimum yang diperoleh dari prosedur sebelumnya.
27
c. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Menentukan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan menentukan aktivitas enzim pada berbagai waktu inkubasi, yaitu 10 menit; 15 menit; 20 menit; 25 menit; dan 30 menit. Penentuan ini dilakukan pada pH dan suhu optimum dari prosedur sebelumnya. Prosedur yang dilakukan sama seperti Lampiran 4 dengan menggunakan variasi waktu inkubasi.
d. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum
Menentukan konsentrasi substrat yang sesuai dengan enzim tripsin dilakukan dengan variasi konsentrasi 2 mg/mL; 4 mg/mL; 6 mg/mL; 8 mg/mL dan 10 mg/mL. Penentuan ini dilakukan pada pH, suhu, dan waktu inkubasi optimum. Prosedur yang dilakukan sama seperti lampiran 4 dengan menggunakan variasi konsentrasi substrat.
e. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Pada Kondisi Optimum
Prosedur yang dilakukan dalam menentukan aktivitas enzim tripsin pada kondisi optimum yaitu sama dengan Lampiran 4. Penentuan ini dilakukan pada pH, suhu, dan waktu inkubasi optimum yang telah diketahui pada prosedur sebelumnya.
f. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin terhadap Penambahan ZnSO4 dengan Metode Anson Termodifikasi
1) Tabung Ts (sampel)
Memasukkan 5 mL larutan kasein 1% ke dalam 5 tabung reaksi yang berbeda kemudian melakukan prainkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC.
28
0,0015 M; 0,0020 M; 0,0025 M; dan 0,0030 M pada masing-masing tabung sebanyak 1 mL dan 1 mL larutan tripsin serta diaduk hingga homogen. Setelah itu, melakukan inkubasi selama waktu inkubasi optimum dan pada suhu optimum yang telah diperoleh pada prosedur sebelumnya. Setelah diinkubasi tambahkan 3 mL larutan TCA 10% dan mengaduknya dengan kuat untuk menghentikan reaksi. Mendiamkan 20 menit dalam air es. Semua tabung disentrifugasi klinis selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Mengambil 2 mL filtrat yang telah disentrifugasi.
2) Tabung B (Blangko)
Memasukkan 2 mL buffer fosfat 0,1 M ke dalam tabung reaksi. 3) Tabung To (Kontrol)
Memasukkan 1 mL larutan tripsin kedalam 5 tabung reaksi berbeda. Kemudian memasukan 3,0 mL TCA 10% dan diaduk sampai homogen. Selanjutnya, menambahkan secara bervariasi ZnSO4 pada masing-masing tabung sebanyak 1 mL dan memasukkan 5 mL larutan kasein 1% yang telah dilakukan prainkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC ke dalam 5 tabung
reaksi yang berbeda serta mengaduknya dengan kuat. Selanjutnya, didiam- kan 20 menit dalam air es. Semua tabung disentrifugasi klinis selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian, diambil 2 mL filtrat yang telah disentrifugasi.
Filtrat diuji dengan metoda Anson yaitu dengan mencampurkan 2 mL TCA-filtrat dengan 4 mL 0,5 M NaOH. Lalu, ditambahkan 1 mL reagen Folin- Ciocalteau dan mendiamkan selama 10 menit kemudian mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 650 nm. Untuk blanko langsung dilakukan penambahan
29
4 mL 0,5 M NaOH dan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau. Ringkasan cara kerja dapat dilihat dalam bentuk bagan pada Lampiran 5.
