3METODE PENELITIAN
3.2 Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam bentuk survei lapangan selama4 bulan, kemudian dilanjutkan deteksi keberadaan virus dalam tubuh nyamuk di laboratorium.Kegiatan survei dilakukan pada rumah penduduk yang bersedia diperiksa di lokasi penelitian.Jumlahrumah minimalyang diperiksa dalam penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
n = N 1 + N (d²) (Notoatmodjo 2002) Keterangan : N = Besar populasi n = Besar sampel
d = Tingkat kepercayaan yang diinginkan yaitu 0.05
Dari perhitungan tersebut diperoleh 124 rumah setiap bulan pengamatan. Semua nyamuk yang tertangkap dari 124 rumah tersebut dijadikan sebagai sampel dalam penelitian ini, dengan beberapa tahapan kegiatan yaitu: 1) Pengumpulan telur nyamuk; 2) Pengumpulan larva; 3) Penangkapan nyamuk dewasa; 4) Wawancara dan observasi pengetahuan, sikap dan perilaku masyarakat; 5) Deteksi virus chikungunya pada nyamuk.
3.2.1 Bagan Alur Penelitian
Pengumpulan Telur Pengumpulan Larva Pengumpulan Nyamuk Dewasa PSP Masyarakat Lapangan Identifikasi Nyamuk Deteksi CHIKV PCR Laboratorium
3.2.2 Pengumpulan Telur Nyamuk
Telurdikumpulkan menggunakan ovitrap yaitu berupa kaleng kecil yang dicat warna hitam. Cara pemasangannya adalah mengisi kaleng ovitrap dengan air sampai ± setengah (250ml), lalu masukkan kertas saring mengelilingi kaleng
ovitrap, kemudian disimpan di tempat-tempat gelap yang diduga sebagai tempat
persembunyian nyamuk, misalnya bawah kolong tempat tidur, bawah meja, atas lemari dan sebagainya. Pengambilan ovitrap dilakukan 5 hari kemudian dan selanjutnya dibawa ke laboratorium untuk dihitung jumlah telurnya. Telur yang sudah di hitung tersebut tersebut ditetaskan di laboratorium dan dipelihara atau
rearing sampai dewasa. Dari data pengumpulan telur tersebut dapat dihitung
Ovitrap Index.Pemasangan ovitrap dilakukan 2 kali dalam seminggu pada rumah
penduduk yang tidak didapatkan larva maupun nyamuk dewasa.
3.2.3 Pengumpulan Larva Nyamuk
Pengumpulan larva nyamuk dilakukan dengan mengamati semua wadah atau tempat penampungan air yang berada di dalam maupun di luar rumah penduduk yang diperiksa. Tempat penampungan yang dimaksud berupa bak mandi dan WC, ember, drum, tempayan, kaleng dan ban bekas, kelopak daun dan lain-lain.Pengamatan ada atau tidaknya larva nyamuk dilakukan secara visual
dengan menggunakan alat bantu berupa senter dan pipet. Jika positif, maka larva tersebut diambil dengan menggunakan cidukan atau gayung dan dipindahkan ke dalam plastik dengan menggunakan pipet.Larva dari setiap wadah yang positif dipisahkan, diberi label dan dibawake laboratorium untuk diidentifikasi.Kemudian wadah positif tersebut dicatat jenis, bahan, dan warna.Kepadatan larvadari lapangandihitungIndex Larvayaitu Angka Bebas Jentik (ABJ), House index (HI),
Container index (CI)dan Breteau index (BI). Pengumpulan larva dilakukan 2kali
seminggu selama 4 bulan dari jam 06.00 sampai jam 18.00.
3.2.4 PengumpulanNyamuk Dewasa
Nyamuk dewasa diperoleh dengan cara penangkapan menggunakan metode
HumanLanding Collection (HLC)atau umpan orang dan Resting Collection (RC).
rumah dan 1 orang lagi menangkap di luar rumah.Penangkapan nyamuk dengan umpan orang dilakukan selama 20 menit per rumah dan 5 menit selanjutnya menangkap nyamuk yang sedang istirahat. Tiap penangkap duduk dengan celana digulung sampai lutut dan menunggu 20 menit untuk digigit nyamuk. Nyamuk yang hinggap langsung ditangkap dengan aspirator dan dimasukkan dalam gelas kertas atau paper cup dibedakan per rumah dan metode penangkapan, kemudian dibawa ke laboratorium dan dimasukkan freezer -20°C.Keragaman spesies dan kepadatan nyamuk yang tertangkap dihitung Landing Rate (LR), Man Biting Rate
(MBR), Resting Rate (RR).Pengumpulan nyamuk dewasa dilakukan 2 kali seminggu selama 4 bulan dari jam 06.00 sampai jam 18.00.
3.2.5 Identifikasi Nyamuk
Nyamuk yang telah dikumpulkan tersebut, diidentifikasi sesuai kunci identifikasi Depkes (2008).Nyamuk dipisahkan berdasarkan jenis, waktu, lokasi pengambilan dan dimasukkan kedalam tabung eppendorf sebanyak 5-25 ekor per tabung, laludimasukkan freezerdengan suhu -80°C sampai dilakukanRT-PCR.
3.2.6 Deteksi Virus Chikungunya Pada Nyamuk
Pemeriksaanvirus chikungunya dalam tubuh nyamuk di lakukan terhadap semua nyamuk hasil penangkapan dari lapangan dengan RT-PCR. Kegiatan yang dilakukan meliputi: 1) Ekstraksi RNA virus; 2) Pengujian RT-PCR
Ekstraksi RNA Virus
Ekstraksi RNA virus diawali dengan menggerus nyamuk menggunakan
pestle kemudian ditambahkan media (BA1) sesuai jumlah nyamuk. Sebanyak
10-25 nyamukditambahkan BA1 1ml; 5-10 nyamukditambahkan BA1 500 µl; dan bila kurang dari 5 nyamukditambahkan BA1 250µl. Gerusan diaduk sampai larut, setelah itu sentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 3 menit, kemudian 140 µl supernatan diambil untuk ekstraksi RNA virus dengan tahapan sebagai berikut: Pertama, sebanyak 560 lysis mix yang terdiri atas 560 µl AVL dan 5.6µl
RNA-carrierdimasukkan ke dalam tabung eppendorf1.5ml, lalu ditambahkan
sampel 140µl, kemudian vortexselama 15 detik, setelah itu di inkubasi dalam
tersebut ditambahkan ethanol sebanyak 560µl, lalu vortex selama 15 detik dan
sentrifuse 5 detik; Ketiga, sebanyak 630µl larutan tersebut dipindahkan ke dalam
spin column yang terpasang pada collection tube, dan sentrifuseselama 30 detik,
kemudian collection tube dibuang dan diganti dengan collection tubeyang baru (langkah tersebut diulangi sampai campuran habis);Keempat, selanjutnya ditambahkan 600µl AW1, lalusentrifuseselama 30 detik, dancollection tube
dibuang sertadiganti, kemudian ditambahkan lagi 600µl AW2, lalu
sentrifuseselama 30 detik, lalu collection tube dibuang dan diganti, setelah
itusentrifusedengan kecepatan maksimum 1 menit dengan tujuan untuk
mengeringkan, collection tube dibuang dan spin column dipindahkan ke eppendorf 1.5 ml.Kemudian ditambahkan buffer AVE 60µl (tepat ditengah tanpa menyentuh dinding atau filter),lalu didiamkan selama 3 menit
dansentrifusedengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.Hasil ekstraksi RNA
tersebut dapat langsung digunakan sebagai templateRT-PCR atau dapat simpan pada suhu -80°C bila tidak digunakan.
RT-PCR
DeteksiRNA virus chikungunya dengan menggunakan pasangan Primermenggunakan Primer forward CHIKnsP1-S dengan sekuens 5’-TAG-AGC-AGG-AAA-TTG-ATC-CC-3’ dan Primer reverse CHIKnsP1-C dengan sekuens 5’-CTT-TAA-TCG-CCT-GGT-GGT-AT-3’ (Rohani et al.
2005).Sebelum di lakukan RT- PCR, perlu disiapkan campuran PCR Master Mix
PCR di atas cold block dalam biosafety cabinetuntuk volume/reaksi 12.5µl, yang terdiri atas beberapa reagen sebagai berikut: dH20 1.25 µl, 2x buffer6.25 µl, Primer forward (200 pmole) 0.25 µl, Primer reverse (200 pmole) 0.25 µl, Enzyme
0.25 µl. Masukkan 8.5 µl campuran PCR kedalam masing-masing tabung PCR dan ditambahkan 4 µl template untuk setiap sampel.Tabung tersebut ditutup rapat dan disentrifuse, kemudian tempatkan pada mesin PCR untuk amplifikasi.Amplifikasi dilakukan pada total volume/reaksi 12.5 µl menggunakan
Superscript III one-step RT-PCR kit (Invitrogen) dengan 200 pmol primers dan 4
µl template RNA.Kondisi PCR diawali dengan tahapreverse traskripsi pada suhu
48°C selama 30 menit, yang diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada 94°C selama 1 menit, Anneling pada 54°Cselama 90 detik dan ekstensi pada 72°Cselama 2
menit serta diakhiri ekstensi final pada 72°Cselama 7 menit (Rohani et al. 2005; Thavara et al. 2009).
Elektroforesis
Produk amplifikasi selanjutnya diseparasi pada 1% gel agarose. Gel agarose 1% dibuat dengan cara mencampurkan 1 gram agarose dengan 100ml TAE buffer, kemudian dipanaskan pada microwave sampai larut, diaduk rata dan didinginkan pada air mengalir sampai hangat. Selanjutnya ditambahkan 5 µl etidium bromida (0.5 µl/10 ml agarosa) kemudian diaduk rata. Gel tersebut dimasukkan ke dalam cetakan, dibiarkan dingin dan mengeras (±30 menit). Setelah agarose mengeras, dimasukkan ke dalam tangki (chamber) elektroforesis yang berisi buffer TAE.Berikutnya disiapkan 1 µl loading dye (6x), ditambahkan produk PCR 5 µl dan diaduk sampai merata di atas kertasparafilm, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada gel agarose, lalu masukkan pula berturut-turut5 µl Ladder DNA 1 kb diletakkan sesuai kebutuhan,5 µl kontrol negatif dan 5 µl kontrol positif pada sumur-sumur berikutnya.Kontrol positif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi
master mix yang dicampur dengan RNA virus chikungunya yang diperoleh dari
Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor (PSSP-IPB).Kontrol negatif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi master mix yang dicampur dengan
RNAase-free water. Elektroforesis dengan arus listrik 120 Vselama 45 menit,
DNA akan bergerak dari kutup negatif ke kutub positif.
Visualisasi
Setelah dielektroforesis, gel agarose diletakkandi atas transluminator ultra
violetuntuk melihat hasil amplifikasi. Pita molekul yang terlihat pada gel agarose
menandakan adanya segmen DNA. Pita DNA tersebut kemudian dibandingkan dengan pita yang ada pada kontrol positif dan Ladder atau marker.
3.2.7 Survai Perilaku Masyarakat
Kegiatansurvaipengetahuan, sikap dan tindakan masyarakat dalam melakukan pencegahan terhadap penyakit chikungunya diperoleh dengan cara wawancara terhadap penduduk dengan panduan kuesioner terstruktur (Depkes 2007). Penduduk yang diwawancarai sebanyak 124 orang yang (satu rumah
diwakili oleh satu orang) berusia lebih dari 15 tahun dan bersedia untuk diwawancarai.