Saran - Uji aktivitas antikanker payudara T47D ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn.) seca

BAB V PENUTUP

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa asetogenin

pada daun sirsak (Annona muricata Linn.) dengan mengoptimasi eluen

menggunakan metode pemisahan kromatografi lapis tipis. Optimasi tersebut

mampu meningkatkan hasil pemisahan dari senyawa asetogenin yang terkandung

DAFTAR PUSTAKA

Aillah, A. F. 2015. Uji Aktivitas Antikanker Terhadap Sel Kanker Payudara T47D dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif dari Ekstrak dan Fraksi Akar Rumput Bambu (Lophatherum gracile Brogn). Skripsi. Malang: Jurusan Kimia Fakultas SAINTEK UIN Malang.

Abcam. 2007. Human Ductal Breast Epithelial Tumor Cell Line Whole Cell

Lysate.https://www.abcam.com/t47d-whole-cell-lysate-ab14899.html#top-500. Diakses pada tanggal 16 Oktober 2018.

Adelina, R., Febriyanti, R., Oktoberia, I. S., dan Intan, P. R. 2014. Ekstrak Daun

Annona muricata Linn. sebagai Antiproliferasi terhadap Sel Hepar Tikus

Terinduksi 7,12 Dimetilbenz[a]antracene (DMBA). Jurnal Kefarmasian

Indonesia, 4(1), 1-12.

Alali, F. Q., Liu, X. X., dan McLaughlin, J. L. 1999. Annonaceous Acetogenins: Recent Progress. Journal of Natural Products, 62(3) 504-540.

Asbanu, Y. W. A., Wijayanti, N., dan Kusumo, E. 2019. Identifikasi Senyawa Kimia Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L.) dan Uji Aktivitas Antioksidannya dengan Metode DPPH (2,2-Difenil-1-Pikrilhidrasil).

Indonesian Journal of Chemical Science, 8(3), 153-160.

ATTC. 2008. Cell Biology, ATCC® Number: HTB-22TM, Designations: MCF-7. http://www.atcc.org/Products/All/HTB-22.aspx. Diakses pada tanggal 10 Oktober 2018.

Aulianshah, V., Satria, D., dan Hasibuan, P. A. Z. 2012. Uji Sitotoksik Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Sel T47D. Seminar Nasional Farmasi

Universitas Sumatera Utara.

Basmal, J., Amini, S., dan Sugiono. 2009. Seminar Nasional Pengolahan Produk

dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. Jakarta: Balai Bersar Riset

Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan.

Bonneau, N., Baloul, L., Ndob, I. B. B., Sénéjoux, F., dan Champy, P. 2017. The Fruit of Annona squamosa L. as a Source of Environmental Neurotoxins: from Quantification of Squamocin to Annotation of Annonaceous Acetogenins by LC–MS/MS Analysis. Food Chemistry 226, 32-40.

Bonneau, N., Schmitz-Afonso, I., Brunelle, A., Touboul, D., dan Champy, P. 2016. Validation Data for the Quantification of the Annonaceous Acetogenin Annonacin in Rat Brain By UPLC-MS/MS. Data in Brief, 7, 1633-1638. Cameron, D. K., dan Wang, Y. 2006. Application of Protease and High-Intensity

Ultrasound in Corn Starch Isolation from Degermed Corn Flour. Cereal

Feng, Z., Qi, Y., Lian-Na, S., Shou-Hong, G., Xia, T., dan Wan-Sheng, C. 2014. Fingerprint Analysis of Zhimu-Huangbai Herb Pair and Simultaneous determnation of its Alkaloids, Xanthone Glycosides and Steroidal Saponins by HPLC-DAD-ELSD. Chinese Journal of Natural Medicines, 12(7), 0525-0534.

Gorman, J. S. T. 2006. Transition Metal-mediated Cyclizations and Synthesis of

Annonaceous Acetogenin Analogs. Texas: University of Texas.

Grebe, S. K. G., dan Singh, R. J. 2011. LC-MS/MS in the Clinical Laboratory – Where to From Here?. Clin Biochem Rev, 32, 5-31.

Gu, Z., Zhou, D., Wu, J., Shi, G., Zeng, L., dan McLaughlin, J. L. 1997. Screening for Annonaceous Acetogenins in Bioactive Plant Extracts by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. Journal of Natural Products, 60(3), 242–48.

Handayani, H., Sriherfyna, F. H., dan Yunianta. 2016. Ekstraksi Antioksidan Daun Sirsak Metode Ultrasonic Bath (Kajian Rasio Bahan : Pelarut dan Lama Ekstraksi). Jurnal Pangan dan Agroindustri, 4(1), 262-272.

Harborne JB. 1987. Phytochemical Methods. Terjemahkan. Padmawinata K., Soediro I. Penerbit ITB, Bandung.

Hermawan, G. P., dan Laksono, H. 2013. Estraksi Daun Sirsak (Annona muricata L.) Menggunakan Pelarut Etanol. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri, 2(2), 111-115.

Horvat, J., Klaic, B., Metelko, B., dan Sunjic, V. 1985. Mechanism of Levulinic Acid Formation. Tetrahedron, 26(17), 2111-2114.

Jambrak, A. R. 2012. Application of High Power Ultrasound and Microwave in Food Processing: Extraction. Journal of Food Processing & Technology, 3(12).

Jannah, R., Husni, M. A., dan Nursanty, R. 2017. Inhibition Test of Methanol Extract from Soursop Leaf (Annona muricata Linn.) Against Streptococcus

mutans Bacteria. Jurnal Natural, 17(1).

Kadarani, D. K. 2015. Studi Asetogenin, Total Fenol dan Antioksidan pada Ekstrak Biji dan Kulit Buah Srikaya (Annona squamosa L.) sebagai Material Biopeptisida. Tesis. Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Katrin, E., Amaliah, R., Aziz, Z., dan Winarno, H. 2013. Aktivitas Sitotoksik dan

Profil Kromatogram Daun Sirsak (Annona muricata L.) yang Diiradiasi.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 11(1) 244-245.

Khacha-ananda, S., Tragoolpua, K., Chantawannakul, P., dan Tragoolpua, Y. 2013. Antioxidant and Anti-Cancer Cell Proliferation Activity of Propolis Extracts from Two Extraction Methods. Asian Pacific Journal of Cancer

Kim, J. Y., Dao, T. T. P., Song, K., Park, S. B., Jang, H., Park, M. K., Gan, S. U., dan Kim, Y. S. 2018. Annona muricata Leaf Extract Triggered Intrinsic Apoptotic Pathway to Attenuate Cancerous Features of Triple Negative Breast Cancer MDA-MB-231 Cells. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine, 1-10.

Kuete V. dan Efferth T. 2015. Review Article African Flora Has the Potential to Fight Multidrug Resistance of Cancer. BioMed Research International, 1-24.

Kumar, R., Arora, V., Ram, V., Bhandari, A., dan Vyas, P. 2011. Hypoglycemic and Hypolipiemic Effect of Allopolygerbal Formulations in Streptozotocin Induced Diabetes Mellitus in Rats. International Journal of Diabeetes

Mellitus, 1-6.

Lilbaiq, F. Z. 2017. Uji Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) yang Diembankan pada Zeolit NaX Menggunakan Metode Impregnasi Kering sebagai Antikanker Payudara T47D. Skripsi. Malang: Jurusan Kimia Fakultas SAINTEK UIN Malang.

Listyawati, S., Sismindai, Mubarika, S., Murti, Y. B. 2012. Aktivitas Kemoprevensi Ekstrak Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) pada Karsinogenesis Kulit Menct BALB/C Terinduksi Radiasi Ultra Violet. Seminar Nasional IX

Pendidikan Biologi FKIP UNS.

Manarizki, W. A. 2019. Optimasi Pemisahan Senyawa Asetogenin pada Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) secara Kromatografi Lapis Tipis Berdasarkan Jenis Pelarut dan Lama Ekstraksi Ultrasonik. Skripsi. Malang: Jurusan Kimia Fakultas SAINTEK UIN Malang.

McLaughlin, J. L. 2008. Paw Paw and Cancer: Annonaceous Acetogenins from Discovery to Commercial Products. Journal of Natural Products, 71(7), 1311-21.

Melecchi, M. I. S., Péres, V. F., Dariva, C., Zini, C. A., Abad, F. C., Martinez, M. M., dan Caramão, E. B. 2005. Optimization of the Sonication Extraction Method of Hibiscus tiliaceus L. Flowers. Ultrasonics Sonochemistry, 13(2006), 242-250.

Miyata, M., Kudo, G., Lee, Y. H., Yang, T. J., Gelboin, H, V., Fernandez-Salguero, P., Kimura, S., dan Gonzalez, F. J. 1999. Targeted Disruption of The Microsomal Epoxide Hydrolase Gene: Microsomal Epoxide Hydrolase is

Required for the Carcinogenic Activity of

7,12-Dimethylbenz[α]anthracene. The Journal of Biological Chemistry, 274(34), 23963–23968.

Moektiwardoyo, M., Iskandar, Y., Susilawati, Y., Musfiroh, I., Sumiwi, S.A., Levita, J., Abdassah, M. 2018. Jawer Kotok, Plectranthus Scutellarioides,

Moghadamtousi, S. Z. 2016. In Vitro and In Vivo Evaluation of the Chemopreventive, Gastroprotective and Wound Healing Potential of

Annona muricata. Thesis. Kuala Lumpur: Fakultas Sains Universitas

Malaya Kuala Lumpur.

Mosmann, T. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of

Immunological Methods, 65, 55-63.

Muhartono dan Subeki. 2015. Penggunaan Ekstrak Daun Sirsak sebagai Obat Kemoterapi Kanker Payudara. Prosiding Seminar Presentasi Artikel Ilmiah

Dies Natalis FK Unila ke 13.

Mukharomah, S. 2019. Potensi Senyawa Asetogenin dari Daun Sirsak yang Diembankan pada Zeolit NaX sebagai Senyawa Antikanker Payudara T47D. Skripsi. Malang: Jurusan Kimia Fakultas SAINTEK UIN Malang. Murtiyaningsih, H. 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan

Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA).

Agritrop, 15(1), 83-93.

Mulia, K., Krisanti, E., Maulana, T., dan Dianursanti. Selective Polarity-Guided Extraction and Purification of Acetogenins in Annona Muricata L. Leaves.

International Journal of Technology, 6(7), 1221-1227.

Nurafiah, M. 2012. Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Biji Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Sel T47D dan Profil Kromatografinya. Skripsi. Surakarta: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Pradana, P. Y., Suratno dan Retnowati, R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Turunan Acetogenin dari Daun Sirsak (Annona muricata) serta Uji Toksisitas. Kimia Student Journal, 1(1), 798-804.

Puriyanti, Y., Kamal, N., Soraya, S. A., dan Ardhiansyah, M. 2018. Ekstraksi

Annonaceous Acetogenin dari Daun Sirsak (Annona muricata L.) untuk

Menentukan Variabel Optimum terhadap Hasil Ekstraksi. Jurnal ITEKIMA, 4(2).

Puspitasari, M. L., Tara, V. W., Tri, D. W., Jaya, M. M., dan Nur, I. N. 2016. Aktivitas Antioksidan Suplemen Herbal Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) dan Kulit Manggis (Garcinia mangostana L.): Kajian Pustaka. Jurnal

Pangan dan Agroindustri, 4(1), 283-290.

Putra, E. D. L. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. Medan: USU.

Rachmani, E. P. N., Suhesti, T. S., dan Widiastuti, R. 2012. The Breast of Anticancer from Leaf Extract of Annona muricata Againts Cell Line in T47D. International Journal of Applied Science and Technology, 2(1).

Rahayuwati, L., Ibrahim, K., dan Komariah, M. 2017. Pilihan Pengobatan Pasien Kanker Payudara Masa Kemoterapi: Studi Kasus. Jurnal Keperawatan

Indonesia, 20(2), 118-127.

Ranisaharivony, B. G., Ramanandraibe, V., Rasoanaivo, L. H., Rokotovao, M., dan Lemaire, M. 2015. Separation and Potencial Variation of Chemical Constituent of Soursop Seeds. Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry, 4(2), 161-171.

Redaksi Trubus. 2012. Daun Sirsak Vs Kanker. Jakarta: PT Trubus Swadaya. Rosenberg, M. J (Brooklyn, NY). 1981. Method for the extraction of a factor that

mediates contact inhibition of cell growth. United State: New York

University.

Rupprecht, J. K., Hui, Y. H., dan McLaughlin, J. L. 1990. Annonaceous Acetogenins: A Review. Journal of Natural Products, 53(2) 237-278. Safdar, M. N., Kausar, T., Jabbar, S., Mumtaz, A., Ahad, K., dan Saddozai, A. A.

2017. Extraction and Quantification of Polyphenols from Kinnow (Citrus

reticulate L.) Peel Using Ultrasound and Maceration Techniques. Journal of Food and Drug Analysis, 25 (3), 488-500.

Sastrohamidjojo, H. 2007. Kromatografi. Yogyakarta: UGM Press. Shihab, M. Q. 2002. Tafsir Al-Amanah. Jakarta: Lentera Hati.

Sukhramani, P. S., Tirthani, S. R., Desai, S. A., dan Suthar, M. P. 2011. Biological Cytotoxicity Evaluation of Spiro[azetidine-2,3’-indole]-2’, 4(1’H)-dione derivatives for Anti-lung and Anti-breast Cancer Activity. Der Pharmacia

Lettre, 3(5), 236-243.

Sunarjono, H. 2005. Sirsak dan Srikaya Budidaya untuk Menghasilkan Buah

Prima. Agrbisnis. Jakarta: Penebar Swadaya.

Swari, S. R. 2012. Penentuan Kandungan Annonaceous Acetogenin pada Daun Sirsak Menggunakan Metode Spektrofotometri Gugus Lakton. Skripsi. Depok: Program Studi Ekstensi Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Indonesia.

Syamsuhidayat, S.S., dan Hutapea, J. R. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia,

Edisi Kedua. Jakarta: Departemen Kesehatan RI.

Wicaksono, A. 2011. Kalahkan Kanker dengan Sirsak. Tegal: Citra Media Mandiri. Widodo, R. D. 2013. Sitotoksisitas Fraksi Semi Polar Ekstrak Etanol Biji Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Sel T47D dan Profil Kromatografinya.

Skripsi. Surakarta: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Winata, E. W., dan Yunianta. 2015. Ekstraksi Antosianin Buah Murbei (Morus alba L.) Metode Ultrasonic Bath (Kajian Waktu dan Rasio Bahan : Pelarut).

Yiallouris, A. dkk. 2018. Annonacin Promotes Selective Cancer Cell Death via NKA-dependent and SERCA-dependent Pathways. Official Journal of the

Cell Death Differentiation Association, 9, 764.

Zakiah, N., Yanuarman, Frengki dan Munazar. 2017. Aktifitas Hepatoprotektif Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Kerusakan Hati Tikus yang Diinduksi dengan Parasetamol. Jurnal AcTion: Aceh Nutrition

Journal, 2(1), 25-31.

Zamaniyah, M. 2018. Perbandingan Aktivitas Sitotoksik Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Daging Biji Kluwak (Pangium Edule R.) dengan Metode Ekstraksi Maserasi dan Ultrasonik terhadap Sel Kanker Payudara T47D. Skripsi. Semarang: Universitas Wahid Hasyim Semarang.

Zeng, L., Ye, Q., Oberlies, N. H., Shi, G., Gu, Z. M., He, K., dan McLaughlin, J. L. 1996. Recent Advances in Annonaceous Acetogenins. Natural Product

LAMPIRAN 1 L.1. Rancangan Penelitian

Daun Sirsak (Annona muricata Linn.)

Preparasi Sampel

Ekstraksi Ultrasonik Berdasarkan Variasi Pelarut (metanol, etanol dan etil asetat) selama 20 menit

Disaring dengan Corong Buchner

Ekstrak Daun Sirsak Ampas

Dialiri Gas N2 Uji Aktivitas Antikanker Pemisahan dengan KLTP Uji Fitokimia Identifikasi dengan LC-MS/MS Identifikasi dengan KLTA

- Ditimbang 50 g

- Dimasukkan ke dalam masing-masing Erlenmeyer

- Ditambahkan 250 mL pelarut (metanol, etanol atau etil asetat)

- Diekstraksi menggunakan ekstraktor ultrasonik selama 20 menit dengan frekuensi 42 kHz

- Disaring dengan corong Buchner

Ampas Ekstrak Daun Sirsak Hasil - Dialiri gas N2 LAMPIRAN 2 Diagram Alir L.2.1 Preparasi Sampel

L.2.2 Ekstraksi Komponen Aktif Daun Sirsak

- Diambil pada bagian ke 4-5 dari pucuk batang daun

- Dicuci, ditiriskan, dipotong kecil-kecil dan dikering anginkan - Dihaluskan dengan digiling sampai serbuk

- Diayak dengan ayakan 60 mesh

Hasil

- Dikeluarkan dari freezer

- Dihangatkan dalam penangas air pada suhu 37˚C selama 2-3 menit

- Dipindahkan ke dalam tabung conical yang telah berisi 10 mL media RPMI

- Disentrifugasi dengan 1200 rpm selama 10 menit

- Ditambah 4 mL media MK dan dihomogenkan - Dipindahkan ke cawan petri

- Diinkubasi selama 3-4 jam - Diamati di bawah mikroskop L.2.3 Kromatografi Lapis Tipis Analitik

L.2.4 Uji Aktivitas Antikanker L.2.5.1 Penyiapan Sel

*Apabila jumlah sel di dalam cawan petri telah konfluen maka dilakukan panen sel

Ekstrak Daun Sirsak 10000 ppm

- Ditotolkan sebanyak ±10 totolan pada jarak 1 cm dari tepi bawah plat ukuran 1x10 cm

- Dikeringkan

- Dielusi dengan beberapa campuran eluen

- Dihentikan pengelusian ketika eluen telah sampai di garis batas atas

- Diperiksa di bawah sinar UV

- Diberikan masing-masing reagen vanillin - Diamati hasil noda dan dihitung nilai Rf nya Hasil

Sel Kanker Payudara T47D

Hasil*

Supernatan Pelet

- Dipipet 10 µL panenan sel ke dalam hemacytometer - Diamati dan dihitung dibawah mikroskop inverted

dengan counter - Dibuang media MK

- Dicuci dengan ±5 mL PBS dan dilakukan 3 kali pengulangan

- Ditambah 1 mL tripsin-EDTA - Diinkubasi 3 menit

- Diamati di bawah mikroskop

- Ditambahkan 5 mL RPMI dan diresuspensi - Diinkubasi suhu 37˚C/5% CO2 selama 24 jam. -

L.2.5.2 Panen Sel

L.2.5.3 Perhitungan Sel Kanker

L.2.5.4 Peletakan Sel pada Plate Sel Kanker Payudara T47D

Hasil

Sel Kanker Payudara T47D

- Diletakkan sel sesuai perhitungan ke dalam tabung conical

- Ditambahkan media RPMI volume total mencapai 10 mL

- Dipipet 100 µL ke dalam masing-masing sumuran pada plate 96-well

- Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C/5% CO2

Hasil

Sel Kanker Payudara T47D (Konfluen)

- Dibuang media sel

- Ditambahkan 1 µL larutan MTT ke setiap sumuran - Diinkubasi selama 3-4 jam

- Diamati dengan mikroskop - Ditambah 100 µL SDS 10%

- Dimasukkan ke dalam kotak sterofoam

- Diinkubasi dalam tempat gelap dengan suhu ruang selama 24 jam

- Dibaca nilai absorbansi dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550-600 nm

- Ditimbang 10 mg

- Ditambahkan 100 µL DMSO 0,2% dan divortex - Diambil sel dalam plate 96-well dari inkubator - Dibuang media

- Dimasukkan 100 µL PBS ke dalam semua sumuran

- Dimasukkan larutan sampel sebanyak 100 µL dengan konsentrasi 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,63 ppm - Diulangi sebanyak 4x

- Diinkuabasi selama 24 jam

L.2.5.5 Pembuatan Larutan Sampel dan Pemberian Larutan Sampel pada Plate

L.2.5.6 Pemberian Larutan MTT Sel Kanker Payudara T47D

Hasil Ekstrak Daun Sirsak

L.2.5 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Ekstrak Daun Sirsak dengan IC50 Terbaik

- Ditotolkan sebanyak ±10 totolan pada jarak 1cm dari tepi bawah plat ukuran 1x20 cm

- Dikeringkan

- Dielusi dengan eluen terbaik hasil KLTA

- Dihentikan pengelusian ketika eluen telah sampai di garis batas atas

- Diperiksa di bawah sinar UV

- Diberikan masing-masing reagen vanillin - Diamati hasil noda dan dihitung nilai Rf nya Hasil

LAMPIRAN 3

Pembuatan Larutan dan Reagen L.3.1 Pembuatan Reagen Vanillin

Reagen Vanillin dibuat dengan 0,5 gram vanillin yang dilarutkan dengan 42,5 mL metanol, 5 mL asam asetat dan 2,5 mL H2SO4 pekat, dihomogenkan.

L.3.2 Pembuatan Larutan SDS 10% (b/v) SDS 10% = ^{1 g}

10 mL

SDS (Sodium Deodecyle Sulohate) ditimbang sebanyak 1 g. Kemudian dimasukkan dalam labu ukur 10 mL. Akuades ditambahkan sampai tanda batas dan dikocok hingga homogen.

L.3.3 Pembuatan Larutan Stok MTT (5 mg/mL)

Serbuk MTT ditimbang sebanyak 50 mg. Kemudian dilarutkan dalam 10 mL PBS dan diaduk dengan vortex.

L.3.4 Pembuatan Larutan DMSO 0,1% M1 x V1 = M2 x V2

99% x V1 = 0,1% x 10 mL V1 = 0,01 mL = 10 µL

Larutan DMSO 99% diambil sebanyak 10 µL dengan mikropipet. Kemudian dimasukkan dalam labu ukur 10 mL. Akuades ditambahkan sampai tanda batas dan dikocok hingga homogen.

L.3.5 Pembuatan Larutan PBS

Larutan PBS dapat dibuat dari 0,1 gram KCl, 0,1 gram KH2PO4, 4 gram NaCl dan 1,08 gram Na2HPO4.H2O yang dilarutkan dalam 250 mL aquades steril. Kemudian dihomogenkan dalam beaker glass 500 mL dengan menggunakan

magnetic stirer, pH larutan diatur hingga mencapai 7,2 ±0,2 dengan penambahan

labu ukur 500 mL, ditambahkan aquades steril hingga tanda batas dan dihomogenkan.

L.3.6 Pembuatan Media Kompleks

FBS 10% dan penisilin-streptomisin dicairkan pada suhu kamar, disiapkan botol duran 100 mL. Diambil 10 mL FBS dengan menggunakan pipet volume 10 mL. Kemudian dimasukkan dalam botol duran. Penisilin-streptomisin diambil 1 mL dengan pipet ukur dan dimasukkan ke dalam botol duran. Ditambahkan fungizon 0,5 mL dan media cair (RPMI) sampai 100 mL.

L.3.7 Pembuatan Larutan Stok 100.000 ppm Ekstrak Daun Sirsak Berat ekstrak = 10 mg

Volume pelarut = 100 µL (DMSO)

Ppm = ^{10 mg}

100 µL = ^{10000 µg}

0,1 mL = 100000 µg/mL

Larutan stok 100.000 ppm dibuat dengan cara ditimbang 10 mg sampel dan ditambah dengan 100 µL DMSO.

L.3.8 Pembuatan Larutan 1000 ppm Ekstrak Daun Sirsak Larutan Stok Ekstrak Daun Sirsak = 100.000 ppm

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x 1 mL = 100000 µg/mL x V2

V1 = 0,01 mL = 10 µL

Larutan 100.000 ppm ekstrak daun sirsak diambil 10 µL menggunakan mikropipet, kemudian ditambahkan 990 µL media RPMI dan diresuspensi hingga homogen.

Lampiran 4. Perhitungan Rendemen

% Rendemen=^{Berat ekstrak}

Berat sampel^{x 100%} L.4.1 Ekstrak metanol daun sirsak

Berat sampel = 15 g

Berat ekstrak pekat = 2,2136 g % Rendemen = ^{Berat ekstrak}

Berat sampel x 100%

% Rendemen = ^{2,2136 g}

15 g x 100%

% Rendemen = 14,757%

L.4.2 Ekstrak etanol daun sirsak

Berat sampel = 15 g

Berat ekstrak pekat = 2,1918 g % Rendemen = ^{Berat ekstrak}

Berat sampel x 100%

% Rendemen = ^{2,1918 g}

15 g x 100%

% Rendemen = 14,612%

L.4.3 Ekstrak etil asetat daun sirsak

Berat sampel = 15 g

Berat ekstrak pekat = 0,7302 g

% Rendemen = ^{Berat ekstrak}_{Berat sampel} x 100%

% Rendemen = ^{0,7302 g}

15 g x 100%

Lampiran 5. Perhitungan Nilai Rf Hasil KLTA

Rf = ^{Jarak senyawa dari titik asal} jarak pelarut dari titik asal

L.5.1 Hasil nilai Rf pada ekstrak metanol daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5) Nomor Noda Jarak Tempuh Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) Rf 1 0,75 8 0,093 2 1,45 8 0,181 3 1,9 8 0,237 4 2,15 8 0,268 5 2,4 8 0,3 6 2,9 8 0,36 7 3,5 8 0,437 8 4,5 8 0,562 9 4,8 8 0,6 10 5,7 8 0,712 11 6,3 8 0,787 12 7 8 0,875 13 7,4 8 0,925

L.5.2 Hasil nilai Rf pada ekstrak etanol daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5)

Nomor Noda ^{Jarak Tempuh} Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) ^Rf 1 1,3 8 0,162 2 3,3 8 0,412 3 3,7 8 0,462

59 4 4,1 8 0,512 5 4,5 8 0,562 6 5,25 8 0,656 7 5,5 8 0,687 8 6,1 8 0,762 9 7 8 0,875 10 7,4 8 0,925

L.5.3 Hasil nilai Rf pada ekstrak etil asetat daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5) Nomor Noda Jarak Tempuh Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) Rf 1 0,5 8 0,062 2 0,9 8 0,112 3 1,5 8 0,187 4 1,75 8 0,218 5 2,8 8 0,35 6 3,1 8 0,387 7 4,4 8 0,55 8 5,1 8 0,637 9 5,6 8 0,7 10 7,05 8 0,881 11 7,3 8 0,912 12 7,7 8 0,962

L.5.4 Hasil nilai Rf pada metanol daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (1:19) Nomor Noda Jarak Tempuh Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) Rf 1 0,4 8 0,05 2 0,8 8 0,1 3 1,2 8 0,15 4 1,7 8 0,212 5 2 8 0,25 6 2,35 8 0,293 7 4,2 8 0,525 8 4,7 8 0,587 9 5,25 8 0,656 10 5,65 8 0,706 11 6,25 8 0,781 12 6,8 8 0,85 13 7,1 8 0,887 14 7,35 8 0,918

L.5.5 Hasil nilai Rf pada etanol daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (1:19)

Nomor Noda ^{Jarak Tempuh} Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) ^Rf 1 2,25 8 0,281 2 2,7 8 0,337 3 3,35 8 0,418 4 3,7 8 0,462 5 5 8 0,625 6 5,7 8 0,712 7 5,9 8 0,737

8 6,25 8 0,781

9 6,65 8 0,831

10 7,1 8 0,887

11 7,4 8 0,925

L.5.6 Hasil nilai Rf pada etil asetat daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (1:19)

Nomor Noda ^{Jarak Tempuh} Noda (cm) Jarak Tempuh Eluen (cm) ^Rf 1 0,4 8 0,05 2 0,7 8 0,087 3 1 8 0,125 4 1,65 8 0,206 5 1,9 8 0,237 6 4,1 8 0,512 7 5,3 8 0,662 8 7,2 8 0,9 9 7,6 8 0,95

Lampiran 6. Perhitungan Data dan Hasil Uji Aktivitas Antikanker Payudara T47D

L.6.1 Perhitungan sel kanker

Pengamatan jumlah sel dengan hemacytometer di bawah mikroskop

invertred

Jumlah sel hidup =^{Ʃ sel kuadran A + B + C + D}

4 x 10⁴

=^{85+ 84 + 77+ 99}

4 x 10⁴

= 86,25 x 104 sel/mL

L.6.2 Peletakan sel pada plate

Panenan sel yang ditransfer =^{Jumlah total sel yang diperlukan}

Jumlah sel yang terhitung

= ^{100 x 10}

86,25 x 10⁴

=1,16 mL

Setiap sumuran pada plate akan diisi sebanyak 100 µL campuran sel kanker dengan media RPMI. Total volume campuran yang dibutuhkan pada plate 96 well yaitu sebanyak 100 µL x 100 sumuran = 100.000 µL atau 10 mL, sehingga jumlah sel yang dipanen sebanyak 1,16 mL, ditambahkan media RPMI hingga total volume 10 mL dan dihomogenkan.

L.6.3 Perhitungan Persentase Sel Hidup dan Nilai IC50 Persentase sel hidup = ^(A-B)

(C-B) x 100% Kuadran A 85 Kuadran B 84 Kuadran C 77 Kuadran D 99

A adalah absorbansi perlakuan (media kultur + sel + sampel), B adalah absorbansi kontrol media (media kultur) dan C adalah absorbansi kontrol negatif (media kultur + sel). Absorbansi Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Ulangan 4 ^Rata-rata Kontrol sel 0,537 0,518 0,482 0,474 0,502 Kontrol media ^0,131 ^0,152 ^0,151 ^0,156 ^0,147

a. Ekstrak metanol daun sirsak  Perhitungan persentase sel hidup

- Konsentrasi 500 µg/mL → % sel hidup= ^0,272-0,147

0,502-0,147 x 100% = 35,139%

- Konsentrasi 250 µg/mL → % sel hidup= ^0,328-0,147

0,502-0,147 x 100% = 50,996%

- Konsentrasi 125 µg/mL → % sel hidup= ^0,447-0,147

0,502-0,147 x 100% = 84,4%

- Konsentrasi 62,5 µg/mL → % sel hidup= ^0,483-0,147

0,502-0,147 x 100% = 94,628%  Perhitungan IC50 y = -0.1368x + 98.357 R² = 0.9002 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 200 400 600 %Sel H idu p Konsentrasi (µg/mL)

Ekstrak Metanol Daun Sirsak

Ekstrak metanol daun sirsak

Linear (Ekstrak metanol daun sirsak)

y = -0,1368x + 98,357

x = ^50-98,357

-0,1368

(IC50) x = 353,486 µg/mL

b. Ekstrak etanol daun sirsak  Perhitungan persentase sel hidup

- Konsentrasi 500 µg/mL → % sel hidup= ^0,265-0,147_0,502-0,147 x 100% = 33,262% - Konsentrasi 250 µg/mL → % sel hidup= ^0,388-0,147

0,502-0,147 x 100% = 67,792%

- Konsentrasi 125 µg/mL → % sel hidup= ^0,464-0,147

0,502-0,147 x 100% = 89,279%

- Konsentrasi 62,5 µg/mL → % sel hidup= ^0,467-0,147

0,502-0,147 x 100% = 90,03%

 Perhitungan IC50

y = -0,1366x +102,11

x = ^50-102,11_-0,1366

(IC50) x = 381,478 µg/mL

c. Ekstrak etil asetat

 Perhitungan persentase sel hidup

- Konsentrasi 15,65 µg/mL → % sel hidup= ^0,423-0,147

0,502-0,147 x 100% = 77,738%

- Konsentrasi 31,25 µg/mL → % sel hidup= ^0,433-0,147

0,502-0,147 x 100% = 80,459% y = -0.1366x + 102.11 R² = 0.9855 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 200 400 600 %Sel hid up Konsentrasi (µg/mL)

Ekstrak etanol daun sirsak

Ekstrak etanol daun sirsak

Linear (Ekstrak etanol daun sirsak)

- Konsentrasi 62,5 µg/mL → % sel hidup= ^0,404-0,147

0,502-0,147 x 100% = 72,296%

- Konsentrasi 125 µg/mL → % sel hidup= ^0,288-0,147

0,502-0,147 x 100% = 39,737%  Perhitungan IC50 y = -0,3732x + 89,43 x = ^50-89,43 -0,372 (IC50) x = 105,994 µg/mL

d. Kontrol obat doxorubicin

 Perhitungan persentase sel hidup

- Konsentrasi 100 µg/mL → % sel hidup= ^0,216-0,147

0,502-0,147 x 100% = 19,376%

- Konsentrasi 50 µg/mL → % sel hidup= ^0,289-0,147

0,502-0,147 x 100% = 39,924%

- Konsentrasi 25 µg/mL → % sel hidup= ^0,309-0,147

0,502-0,147 x 100% = 45,648%

- Konsentrasi 12,5 µg/mL → % sel hidup= ^0,357-0,147

0,502-0,147 x 100% = 58,972% y = -0.3732x + 89.43 R² = 0.9165 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 50 100 150 % Sel hidu p Konsentrasi (µg/mL)

Ekstrak Etil Asetat Daun Sirsak

Ekstrak etil asetat daun sirsak

Linear (Ekstrak etil asetat daun sirsak)

 Perhitungan IC50 y = -0,4166x +60,511 x = ^50-60,511 -0,4166 (IC50) x = 25,230 µg/mL y = -0.4166x + 60.511 R² = 0.9587 0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150 %Sel H idu p Konsentrasi (µg/mL) Kontrol Obat Doxorubicin

Kontrol Obat Doxorubicin

Linear (Kontrol Obat Doxorubicin)

Lampiran 7. Perhitungan Nilai Rf Hasil KLTP Nilai Rf = ^{jarak tempuh senyawa}

jarak tempuh eluen

Nilai Rf 1 = ² 8 = 0,250 Nilai Rf 2 = ^2,25₈ = 0,281 Nilai Rf 3 = ^2,6 8 = 0,325 Nilai Rf 4 = ^3,1 8 = 0,387 Nilai Rf 5 = ^3,5 8 = 0,437 Nilai Rf 6 = ^3,6 8 = 0,450 Nilai Rf 7 = ^3,8 8 = 0,475 Nilai Rf 8 = ^4,9 8 = 0,612 Nilai Rf 9 = ^6,8 8 = 0,850 Nilai Rf 10 = ^7,1 8 = 0,887 Nilai Rf 11 = ^7,45 8 = 0,931 Nilai Rf 12 = ^7,7 8 = 0,962

Lampiran 8. Pola Fragmentasi Senyawa Asetogenin L.8.1 Senyawa Annonacin annonacin +H⁺ [M+H]⁺ m/z 597 -H2O [M+H-H2O]⁺m/z 579 -H2O [M+H-2H2O]⁺m/z 561 -H2O [M+H-3H2O]+ m/z 543

69 [M+H-3H2O]⁺m/z 543 -H2O [M+H-4H2O]⁺m/z 525 annonacin + Na⁺ [M+Na]⁺ m/z 619 -112 amu [M+Na-112]⁺ m/z 507

L.8.2 Senyawa Annomuricin [M+H-3H2O]+ m/z 559 annomuricin +H⁺ [M+H]⁺ m/z 613 -H2O [M+H-H2O]⁺m/z 595 -H2O [M+H-2H2O]⁺m/z 577 -H2O

71 [M+H-3H2O]⁺m/z 559 [M+H-4H2O]⁺m/z 541 -H2O annomuricin [M+H-5H2O]⁺m/z 523 -H2O +Na⁺ [M+Na]⁺ m/z 635

[M+Na]⁺ m/z 635

-112 amu

Lampiran 9. Dokumentasi L.9.1 Proses Ultrasonik

Pengeringan daun Serbuk daun sirsak Ekstraksi

sirsak ultrasonik

Hasil ekstrak daun sirsak

L.9.2 Pemisahan Senyawa Aktif dengan KLTA  Eluen Metanol:Diklorometana (0,5:4,5)

Ekstrak etanol Sebelum disemprot reagen Sesudah disemprot reagen

Ekstrak etil asetat Sebelum disemprot reagen Sesudah sisemprot reagen

 Eluen Metanol:Diklorometana (1:19)

Ekstrak etanol Sebelum disemprot reagen Sesudah disemprot reagen

Ekstrak etil asetat Sebelum disemprot reagen Sesudah disemprot reagen

L.9.3 Uji Aktivitas Antikanker menggunakan Metode MTT

Perhitungan sel Panen sel Peletakan sel pada plate 96-well

Sel + obat 100 µg/mL Sel + obat 12,5 µg/mL Sel + obat 1,563µg/mL

Sel + ekstrak metanol daun sirsak

1000 µg/mL

Sel + ekstrak metanol daun sirsak

125 µg/mL

Sel + ekstrak metanol daun sirsak

15,63 µg/mL

Sel + ekstrak etanol daun sirsak 1000

µg/mL

Sel + ekstrak etanol daun sirsak 125

µg/mL

Sel + ekstrak etanol daun sirsak 15,63

µg/mL

Sel + ekstrak etil asetat daun sirsak

1000 µg/mL

Sel + ekstrak etil asetat daun sirsak

125µg/mL

Sel + ekstrak etil asetat daun sirsak

Elisa reader

L.9.4 Pemisahan Senyawa Aktif dengan KLTP Eluen Metanol:Diklorometana (0,5:4,5)

L.9.5 Identifikasi menggunakan LC-MS/MS  Ekstrak Etil Asetat Daun Sirsak

Kromatogram ekstrak etil asetat daun sirsak: a. energi rendah (b) energi tinggi

S1 Kimia UIN Malang

Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 % 0 100 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 % 0 100

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 1: TOF MS ES+

BPI 7.37e6 16.17 15.74 15.36 14.29 13.96 12.71 11.48 13.16 13.36 14.68 15.12 16.33 16.50 17.28 16.81 17.38 18.1018.33

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 2: TOF MS ES+

BPI 5.58e6 16.51 15.73 14.30 12.70 11.47 13.95 12.93 13.15 14.67 15.37 15.13 16.14 16.91 18.12 17.29 Ekstrak etil asetat

daun sirsak

Ekstrak etil asetat daun sirsak di bawah

lampu UV 256 nm

Ekstrak etil asetat daun sirsak di bawah

lampu UV 366 nm

Spektrum ekstrak etil asetat daun sirsak Rt 16,17: (a) energi rendah (b) energi tinggi

Spektrum ekstrak etil asetat daun sirsak Rt 15,74: (a) energi rendah (b) energi tinggi

Prediksi komposisi kimia dari m/z 597.4730

S1 Kimia UIN Malang

m/z 500502504506508510512514516518520522524526528530532534536538540542544546548550552554556558560562564566568570572574576578580582584586588590592594596 % 0 100 m/z 500502504506508510512514516518520522524526528530532534536538540542544546548550552554556558560562564566568570572574576578580582584586588590592594596 % 0 100

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 736 (16.171) 1: TOF MS ES+

7.37e6 597.4730 561.4524 543.4418 525.4314 507.4203 505.4052 499.4145 _508.4237 _515.4097 523.4137 526.4344 _533.4325 539.4090541.4256 544.4451 553.4577 557.4198_559.4360 ^562.4558 _573.4161 577.4467579.4626 569.4547 580.4658 589.4806591.4264 _595.4575

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 736 (16.182) 2: TOF MS ES+

2.68e6 597.4743 543.4419 525.4312 507.4201 505.4023 503.2439 ^508.4234 _515.2453 521.3994523.4150 510.4323 526.4347 541.4252 527.4377 531.2401 539.4097 561.4525 544.4451 545.4492 555.4053 551.4446 ^557.4205 562.4559 579.4630 577.4466 573.4164 563.4594 569.4559 ^580.4661 587.4661 ^591.4268^593.4396

S1 Kimia UIN Malang

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 717 (15.757) 1: TOF MS ES+ 3.41e6 597.4739 579.4623 561.4517 543.4412 525.4308 507.4196 505.4031 501.4252 508.4230 _515.4090 521.3992_523.4137 526.4340 527.4366531.4052 539.4089541.4246 544.4446 559.4356 545.4476549.4221 557.4187 562.4551 577.4460 573.4153 563.4581 567.4355 580.4656 591.4255 581.4686 585.4515 596.4823

Amelia Rahmawati kode Ektrak daun sirsak 716 (15.747) 2: TOF MS ES+

2.88e6 597.4746 525.4316 507.4204 505.4036 503.3859 508.4236 523.4151 509.4261 521.3975 515.4453 543.4418 526.4346 527.4376 541.4254 539.4092 528.4404 531.4153 579.4630 561.4523 544.4453 545.4481 555.4056 549.4286 559.4362 562.4558 577.4464 573.4153 563.4582 567.4380 580.4662 581.4688 591.4261 585.4515 _595.4566 b a a b

Spektrum ekstrak etil asetat daun sirsak Rt 13,95: (a) energi rendah (b) energi tinggi

 Isolat Hasil KLTP

Kromatogram isolat hasil KLTP: a. energi rendah (b) energi tinggi

Spektrum isolat hasil KLTP Rt 13,93: (a) energi rendah (b) energi tinggi

Dalam dokumen Uji aktivitas antikanker payudara T47D ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn.) secara ultrasonik (Halaman 59-97)