Uji aktivitas antikanker payudara T47D ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn.) secara ultrasonik

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA T47D EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata Linn.) SECARA ULTRASONIK. SKRIPSI. OLEH: AMILA RAHMAWATI NIM. 15630006. JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG 2020.

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA T47D EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata Linn.) SECARA ULTRASONIK. SKRIPSI. Oleh : AMILA RAHMAWATI NIM. 15630006. Diajukan Kepada : Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si). JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG 2020. i.

ii.

iii.

iv.

MOTTO. Sabar dan nikmati prosesnya, Allah sudah memberikan porsi masing-masing kepada setiap hamba-Nya dan semua akan indah pada waktunya. -AR-. Tidak perlu hebat untuk memulai. Tapi anda harus berani memulai untuk menjadi hebat. Langkah pertama kadang terasa sulit, tapi pastikan langkah itu memudahkan anda untuk membuat langkah berikutnya. -Merry Riana-. v.

HALAMAN PERSEMBAHAN. Alhamdulillahirobbil’aalamiin… dengan mengucap rasa syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya. Skripsi ini saya persembahkan kepada: Kedua orang tua saya (Ayah Sumarto dan Ibu Titik Junaidah) yang senantiasa dengan ikhlas mendoakan, memberikan semangat, motivasi dan dukungan baik secara moril maupun material, hingga dapat terselesaikannya tulisan ini. Semoga Allah selalu melimpahkan kasih sayang-Nya dan mengangkat derajat mereka di surga. Aamiin… Adikku tercinta (M. Bayhaqi Rafli) yang selalu menghibur, menemani, memberikan dukungan dan semangat sehingga membuatku lebih tegar. Partner terbaik (Dimas Rahmad Sanubari), Teman sepenelitian (Tyas, Ella, Devi dan Rani), Seluruh teman-teman Kimia A’15 dan Kimia Angkatan ’15, tak lupa Katingku (Mbak Roma dan Mbak Dina). Serta semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu, terimakasih telah menjadi bagian cerita kesuksesanku. Semoga Allah selalu melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Aamiin…. vi.

KATA PENGANTAR. Assalamu’alaikum wa Rahmatullahi wa Barakatuh Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, taufik dan hidayah-Nya kepada penulis, sehingga dapat menyelesaikan penyusunan laporan hasil penelitian dengan judul “Uji Aktivitas Antikanker Payudara T47D Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) secara Ultrasonik”. Sholawat serta salam semoga tetap tercurahkan kepada junjungan kita Nabi Besar Muhammad SAW yang telah membimbing kita menuju jalan yang lurus dan terbebas dari kebodohan dan kejahiliahan. Penulis sadar bahwa penyusunan laporan hasil ini tidak akan terwujud tanpa bantuan, pengarahan dan motivasi dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan banyak terimakasih kepada: 1. Kedua orang tua penulis beserta keluarga yang senantiasa memberikan perhatian, nasihat, doa, dukungan moril dan materil sehingga penyusunan laporan hasil ini dapat terselesaikan. 2. Ibu Elok Kamilah Hayati, M.Si sebagai kepala jurusan Kimia UIN Maulana Malik Ibrahim Malang sekaligus sebagai dosen pembimbing utama yang telah meluangkan waktu untuk membimbing penulis demi terselesaikannya penulisan laporan hasil ini. 3. Ibu Dewi Yuliani, M.Si selaku dosen konsultan dan Bapak A. Ghanaim Fasya, M.Si selaku pembimbing agama, karena atas bimbingan dan arahan beliau penulisan laporan hasil ini dapat terselesaikan.. vii.

4. Segenap Civitas Akademika Jurusan Kimia UIN Maulana Malik Ibrahim yang telah memberikan ilmu, pengalaman, wawasan dan banyak membantu dalam proses penelitian. 5. Dimas Rahmad Sanubari partner yang selalu menemani berproses untuk menjadi lebih baik dan senantiasa memberikan dukungan, motivasi serta bantuan yang tak terukur nilainya. 6. Teman satu kelompok riset Ella, Tyas, Devi dan Rani serta keluarga tim riset Analitik yang telah menjadi teman diskusi, membantu dalam penelitian, saling bertukar wawasan dan saling menyemangati. 7. Teman-teman kimia angkatan 2015 khususnya “Kimia A” atas keceriaan di masa-masa perkuliahan dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari akan kekurangan dan keterbatasan dalam laporan hasil ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak demi peningkatan kualitas laporan hasil penelitian ini. Semoga laporan hasil penelitian ini bisa memberikan manfaat bagi kita semua. Aamiin. Wassalamu’alaikum wa Rahmatullahi wa Barakatuh. Malang, Maret 2020. Penulis. viii.

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................. ii LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. iii LEMBAR PERNYATAAN ................................................................................. iv MOTTO ..................................................................................................................v LEMBAR PERSEMBAHAN .............................................................................. vi KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii DAFTAR ISI ........................................................................................................ ix DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xi DAFTAR TABEL .............................................................................................. xii DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiii ABSTRAK .......................................................................................................... xiv ABSTRACT ..........................................................................................................xv ‫ المستخلص‬.............................................................................................................. xvi. BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang .............................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................5 1.3 Tujuan Penelitian .........................................................................................5 1.4 Hipotesis.......................................................................................................6 1.5 Batasan Masalah...........................................................................................6 1.6 Manfaat Penelitian .......................................................................................6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) .........................................................7 2.2 Asetogenin ..................................................................................................8 2.3 Ekstraksi Metode Ultrasonik ......................................................................10 2.4 Uji Aktivitas Antikanker secara In-vitro dengan Metode MTT.................12 2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...............................................................14 2.6 Identifikasi Asetogenin dengan LC-MS/MS..............................................16 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian ...............................................18 3.2 Alat dan Bahan ...........................................................................................18 3.2.1 Alat ...................................................................................................18 3.2.2 Bahan ...............................................................................................19 3.3 Rancangan Penelitian ................................................................................19 3.4 Tahapan Penelitian .....................................................................................19 3.5 Pelaksanaan Penelitian ...............................................................................20 3.5.1 Preparasi Sampel ................................................................................20 3.5.2 Ekstraksi Senyawa Aktif Daun Sirsak dengan Metode Ultrasonik ....20 3.5.3 Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA) ......................................21 3.5.3.1 Persiapan Plat KLT ...................................................................21 3.5.3.2 Persiapan Fase Gerak (Eluen) ...................................................21 3.5.3.3 Penotolan Sampel .....................................................................21 ix.

3.5.3.4 Proses Elusi ..............................................................................22 3.5.3.5 Identifikasi Noda .......................................................................22 3.5.4 Uji Akivitas Antikanker dengan Metode MTT ..................................22 3.5.4.1 Penyiapan Sel ...........................................................................22 3.5.4.2 Perhitungan Sel .........................................................................23 3.5.4.3 Peletakan Sel pada Plate ...........................................................23 3.5.4.4 Pembuatan Larutan Sampel dan Pemberian Larutan Sampel pada Plate .................................................................................24 3.5.4.5 Pemberian Larutan MTT ...........................................................25 3.5.5 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) ...................................25 3.5.6 Identifikasi Asetogenin dengan LC-MS/MS......................................26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Preparasi Sampel ........................................................................................27 4.2 Ekstraksi Ultrasonik Daun Sirsak .............................................................27 4.3 Identifikasi Senyawa Asetogenin dengan Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA) ........................................................................................30 4.4 Uji Aktivitas Antikanker secara In-vitro dengan Metode MTT ................32 4.5 Pemisahan Senyawa Asetogenin dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) .....................................................................................36 4.6 Identifikasi Senyawa Asetogenin dengan LC-MS/MS .............................37 4.7 Kajian Hasil Penelitian dalam Perspektif Islam .........................................39 BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan ................................................................................................42 5.2 Saran ..........................................................................................................42 DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................................43 LAMPIRAN .........................................................................................................49. x.

DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Daun sirsak ...........................................................................................7 Gambar 2.2 Struktur umum annonaceous asetogenin .............................................9 Gambar 2.3 Reaksi reduksi MTT menjadi formazan .............................................12 Gambar 3.1 Desain plate 96-well untuk percobaan ...............................................24 Gambar 4.1 Hasil KLTA ekstrak daun sirsak sesudah disemprot reagen vanillinasam sulfat di bawah lampu UV366 (a) hasil KLTA ekstrak metanol daun sirsak (b) hasil KLTA ekstrak etanol daun sirsak (c) hasil KLTA etil asetat daun sirsak ........................................................................30 Gambar 4.2 Dugaan mekanisme reaksi asetogenin dan reagen vanillin-asam sulfat..................................................................................................32 Gambar 4.3 Morfologi sel T47D setelah dilakukan uji toksisitas (a) kontrol sel (b) kontrol pelarut DMSO konsentrasi 1000 µg/mL (c) kontrol obat doxorubicin konsentrasi 100 µg/mL (d) sel + ekstrak metanol daun sirsak konsentrasi 1000 µg/mL (e) sel + ekstrak etanol daun sirsak konsentrasi 1000 µg/mL (f) sel + ekstrak etil asetat daun sirsak konsentrasi 1000 µg/mL ..................................................................34. xi.

DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Jenis asetogenin dalam daun sirsak ..........................................................9 Tabel 3.1 Kondisi instrumentasi LC-MS/MS ........................................................26 Tabel 4.1 Hasil ekstrak pekat daun sirsak (Annona muricata Linn.) .....................28 Tabel 4.2 Hasil uji KLTA ekstrak daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5) ............................................................30 Tabel 4.3 Nilai IC50 uji aktivitas antikanker ..........................................................35 Tabel 4.4 Hasil KLTP ekstrak etil asetat daun sirsak ............................................37 Tabel 4.5 Ion asetogenin yang terdeteksi oleh LC-MS/MS ...................................38. xii.

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Rancangan penelitian ........................................................................49 Lampiran 2. Diagram alir ......................................................................................50 Lampiran 3. Pembuatan larutan dan reagen ..........................................................55 Lampiran 4. Perhitungan rendemen ......................................................................57 Lampiran 5. Perhitungan nilai Rf hasil KLTA.......................................................58 Lampiran 6. Perhitungan data dan hasil uji aktivitas antikanker payudara T47D .62 Lampiran 7. Perhitungan nilai Rf hasil KLTP .......................................................67 Lampiran 8. Pola fragmentasi senyawa asetogenin ...............................................68 Lampiran 9. Dokumentasi ......................................................................................73. xiii.

ABSTRAK Rahmawati, A. 2020. Uji Aktivitas Antikanker Payudara T47D Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) secara Ultrasonik. Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang. Pembimbing I: Elok Kamilah Hayati, M.Si; Pembimbing II: A. Ghanaim Fasya, M.Si; Konsultan: Dewi Yuliani, M.Si Kata Kunci : Daun Sirsak, asetogenin, ekstraksi ultrasonik, antikanker, LC-MS/MS Senyawa antikanker dapat ditemukan dalam tanaman sirsak (Annona muricata Linn.). Tanaman sirsak diketahui mengandung senyawa golongan asetogenin. Penelitian ini dilakukan, untuk mengetahui aktivitas antikanker dari ekstrak daun sirsak terhadap sel kanker payudara T47D dan mengidentifikasi senyawa asetogenin menggunakan instrumen LC-MS/MS. Sampel dalam penelitian ini diekstraksi menggunakan pelarut metanol, etanol dan etil asetat dengan metode ultrasonik. Pemisahan golongan senyawa asetogenin dengan KLTA untuk mengetahui eluen terbaik. Uji aktivitas antikanker yang digunakan adalah metode MTT (Micro Tetrazolium). Ekstrak hasil aktivitas antikanker terbaik dipisahkan menggunakan KLTP menggunakan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5). Ekstrak dan Isolat asetogenin diidentifikasi menggunakan instrumen LC-MS/MS. Hasil penelitian menunjukkan nilai IC50 yang diperoleh dari sampel ekstrak metanol, etanol dan etil asetat berturut-turut sebesar 353,486; 381,478 dan 105,994 μg/mL.. Hasil identifikasi ekstrak etil asetat daun sirsak dengan LC-MS/MS menunjukkan adanya senyawa annonacin dan annomuricin dengan puncak ion bermuatan [M+H]+ pada m/z sebesar 597.4730 dan 613.4691. Isolat dugaan asetogenin dengan LCMS/MS menunjukkan senyawa annomuricin dengan puncak ion [M+H]+ pada m/z sebesar 613.4671.. xiv.

ABSTRACT Rahmawati, A. 2020. Anticancer Activity Test against Breast Cancer Cells T47D of Ultrasound Soursop Leaves (Annona muricata Linn.) Extract. Chemistry Department, Science and Technology Faculty, Maulana Malik Ibrahim State Islamic University, Malang. Advisor I: Elok Kamilah Hayati, M.Sc; Advisor II: A. Ghanaim Fasya, M.Sc; Consultant: Dewi Yuliani, M.Sc. Keywords: Soursop leaves, acetogenin, ultrasonic extraction, anticancer, LC-MS / MS Anticancer compounds can be found in soursop plants (Annona muricata Linn.). Soursop plants are known to contain acetogenin class compounds. This research was conducted to determine the anticancer activity of soursop leaf extract against T47D breast cancer cells and identify acetogenin compounds using LC-MS/MS instruments. The samples in this study were extracted by ultrasonic methods using methanol, ethanol and ethyl acetate as solvents. Separation of acetogenin compounds from TLC to find the best eluent. The anticancer activity test used MTT (Micro Tetrazolium) method. Extracts from the best anticancer activity were separated with TLC using methanol: dichloromethane (0.5:4,5) as an eluent. Acetogenin extracts and isolates were identified using LC-MS/MS instruments. The results showed the IC50 values obtained from samples of methanol, ethanol and ethyl acetate extracts were 353,486; 381,478 and 105,994 μg/mL. The results of identification of ethyl acetate extract of soursop leaves with LC-MS/MS showed the presence of annonacin and annomuricin compounds with ion peak charged [M+H]+ at m/z of 597.4730 and 613.4691. The alleged isolate of acetogenin with LC-MS/MS showed an annomuricin compound with an [M+H]+ ion at m/z of 613,4671.. xv.

‫املستلخص‬ ‫رمحاوايت ‪ ،‬أ‪ .۲۰۲۰ .‬اختبار نشاط مضاد للسرطان لسرطان الثدي ‪ T47D‬ابستخراج أوراق قشطة‬ ‫شائكة )‪(Annona muricata Linn.‬ابملوجات فوق الصوتية‪ .‬قسم الكيمياء‪ ،‬كلية العلوم‬ ‫والتكنولوجيا‪ ،‬جامعة موالان مالك إبراهيم اإلسالمية احلكومية يف ماالنج‪ .‬املشرفة األوىل‪ :‬إيلوك كاملة‬ ‫حيايت‪ ،‬املاجسترية ؛ املشرف الثاين‪ :‬أمحد غنائم فشا الداجستري ؛ املستشارة‪ :‬ديوي يولياين‪ ،‬املاجسترية‬ ‫الكلمات الرئيسية‪ :‬أوراق قشطة شائكة‪ ،‬أسيتوجينني‪ ،‬استخراج ابملوجات فوق الصوتية‪ ،‬مضاد للسرطان‪،‬‬. ‫‪LC-‬‬. ‫‪MS/MS‬‬. ‫نبات القشطة الشائكة )‪ (Annona muricata Linn.‬هي نبات مفيدة كمضاد للسرطان‪ .‬من املعروف‬ ‫أن نبااتت قشطة شائكة حتتوي على مركبات فئة األسيتوجينني‪ .‬أجري البحث لتحديد نشاط مضاد للسرطان من‬ ‫استخراج أوراق قشطة شائكة خلالاي سرطان الثدي ‪ T47D‬وحتديد مركبات األسيتوجينني ابستخدام أدوات ‪LC-‬‬ ‫‪.MS / MS‬‬ ‫أُستُخ ِر َجت عينة البحث بطريقة املوجات فوق الصوتية ابستخدام امليثانول واإليثانول وأسيتات اإليثيل‬ ‫كمذيبات‪ .‬فصل مركبات األسيتوجينني من ‪ KLTA‬إلجياد أفضل شطف‪ .‬طريقة اختبار نشاط املضاد للسرطان‬ ‫املستخدمة هي طريقة ‪ MTT (Micro Tetrazolium).‬وأما فصل مقتطفات من أفضل نشاط املضاد للسرطان‬ ‫ابستخدام ‪ KLTP‬ابستخدام امليثانول‪ :‬ثنائي كلورو ميثان (‪ )4،5 :0.5‬شطف‪ُ .‬و ِصف اإليثوالت األسيتوجينني‬ ‫ابستخدام أجهزة ‪.LC-MS / MS‬‬ ‫أظهرت النتائج أن قيم ‪ IC50‬احملصولة من عينات مقتطفات امليثانول واإليثانول واإليثيل كانت‬ ‫‪ 353،486‬؛ ‪ 381،478‬و ‪ 105،994‬ميكروغرام ‪ /‬مل‪ .‬أظهرت نتائج حتديد استخراج أسيتات إيثيل ألوراق‬ ‫قشطة شائكة مع ‪ LC-MS / MS‬تدل على وجود مركبات أنوانسني و أنوموريسني مع ذروة أيون مشحونة‬ ‫‪[M+H]+‬عند ‪ m / z‬من ‪ 597.4730‬و ‪ .613.4691‬أظهرت العزلة املزعومة لألسيتوجينني مع ‪LC-‬‬ ‫‪MS/MS‬مركب أنوموريسني مع ذروة أيونية ‪ [M+H]+‬عند ‪ m/z‬من ‪.613،4671‬‬. ‫‪xvi‬‬.

BAB I PENDAHULUAN. 1.1 Latar Belakang Salah satu penyakit yang timbul karena pertumbuhan tidak normal pada sel jaringan tubuh merupakan penyakit kanker. Kanker berperan dalam menyumbang angka kematian terbesar di seluruh dunia, salah satunya adalah kanker payudara. Data World Health Organization (WHO) tahun 2018 menyebutkan bahwa kasus penderita kanker payudara pada laki-laki maupun perempuan di dunia sebesar 2.088.849 dengan tingkat kematian sebesar 6,6%. Proses pengobatan penyakit kanker dapat dilakukan melalui kemoterapi dengan menggunakan obat kimia yang dapat memberikan efek samping. Proses pengobatan penyakit kanker juga dapat melalui terapi komplementer yang memanfaatkan bahan fitokimia atau herbal yang bekerja secara selektif (Rahayuwati dkk., 2017). Sebagaimana dijelaskan dalam surah Al-An’am:99, Allah SWT berfirman,. ِ َّ ‫وهو الَّ ِذي أَنْزَل ِمن‬ ِ ِ ‫ِج ِمنْهُ َحبًّا ُم َََتاكِبا ۚ َوِم َن‬ ْ ‫ات ُك ِل َش ْيء فَأ‬ ْ ‫الس َمآء َمآء ۚ فَأ‬ َ َ‫َخَر ْجنَا بِه نَب‬ ُ ‫َخَر ْجنَا منْهُ َخضرا ُُنْر‬ َ َ ََُ ‫الرَّما َن ُم ْشتَبِها َو َغ ْ َري ُمتَ َشابِه اُنْظُُرْواِ إىل ََثَِرهِ إِذَا أََْثََر‬ َّ ‫َّخ ِل ِم ْن طَلْعِ َها قِْن َوان َدانِيَة َّو َجنت ِم ْن أ َْعنَاب َو‬ ُّ ‫الزيْتُو َن َو‬ ْ ‫الن‬ ۞‫َويَْنعِ ِه إِ َّن ِيف ذلِ ُك ْم َال َايت لَِق ْوم يُّ ْؤِمنُو َن‬ “Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan, maka Kami keluarkan dari tumbuhtumbuhan itu tanaman yang menghijau, Kami keluarkan dari tanaman yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang kurma mengurai tangkaitangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan (Kami keluarkan pula) zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. Perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah, dan (perhatikan pulalah) kematangannya. Sesungguhnya pada. 1.

2 yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman”(Q.S. Al-An’am:99).. Allah SWT menurunkan hujan untuk menumbuhkan berbagai macam tumbuhan di muka bumi agar manusia dapat mengelola dan mengambil manfaatnya. Potensi inilah yang harus dipelajari dan digali oleh manusia mulai dari manfaat sebagai bahan makanan sampai obat tradisional. Tumbuhan yang bermanfaat sebagai obat salah satunya adalah tumbuhan sirsak. Tumbuhan sirsak terutama pada bagian daunnya memiliki manfaat salah satunya sebagai obat antikanker. Daun sirsak dapat digunakan sebagai obat antikanker karena memiliki senyawa metabolit sekunder. Menurut Adelina dkk. (2014), kandungan metabolit sekunder terbanyak dalam ekstrak etanol daun sirsak adalah golongan senyawa asetogenin yang berpotensi sebagai antipoliferasi pada sel tumor hepar tikus putih. Mulia dkk. (2015) menyebutkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun sirsak mengandung senyawa asetogenin yang dibuktikan dengan hasil KLT dan LC-MS. Hasil penelitian Pradana dkk. (2015) menunjukkan bahwa fraksi metanol daun sirsak diduga terdapat senyawa turunan asetogenin dan memiliki sifat toksik terhadap larva udang dengan nilai LC50 sebesar 35,1 ppm. Penggunaan pelarut metanol (Jannah dkk., 2017), etanol (Ranisaharivony dkk., 2015) dan etil asetat (Katrin dkk., 2013) dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa asetogenin. Daun sirsak memiliki senyawa-senyawa metabolit sekunder dengan berbagai konsentrasi. Efek sitotoksisitas suatu obat herbal sangat bergantung pada efek sinergis dari senyawa-senyawa yang ada. Berdasarkan Lilbaiq (2017) ekstrak daun sirsak menghasilkan nilai uji aktivitas antikanker T47D dengan IC50 sebesar 83,6.

3 g/mL. Mukharomah (2019) menunjukkan bahwa ekstrak daun sirsak dan isolat ekstrak daun sirsak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 92,821 dan 523.600,437 g/mL. Ekstrak etanol biji sirsak memiliki nilai IC50 sebesar 41,087 g/mL (Nurafiah, 2012) dan fraksi semi polar ekstrak biji sirsak memiliki nilai IC50 sebesar 87,711 g/mL terhadap sel T47D (Widodo, 2013). Menurut Kumar dkk. (2015), ekstrak kasar suatu bahan alam memiliki suatu senyawa metabolit sekunder yang bekerja sinergis dalam menginhibisi aktivitas enzim, sehingga memiliki aktivitas antikanker yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan satu golongan senyawa. Pemilihan metode ekstraksi sangat penting dilakukan untuk menentukan tingkat keberhasilan proses ekstrasi selain dari segi penggunaan pelarut. Salah satu metode ekstraksi yang digunakan dalam pengambilan senyawa aktif asetogenin adalah metode ultrasonik yang memanfaatkan gelombang ultrasonik. Melecchi dkk. (2005) menyebutkan bahwa gelombang ultrasonik membentuk getaran atau efek kavitasi yang menyebabkan dinding sel tanaman pecah. Ekstraksi menggunakan uktrasonik dapat meningkatkan efisiensi waktu hampir 50%. Beberapa penelitian membuktikan adanya hasil rendemen dari proses ekstraksi dengan menggunakan ekstraksi ultrasonik. Hasil penelitian Safdar dkk. (2017) menyebutkan bahwa ekstraksi ultrasonik pada kulit jeruk mandarin kinnow selama 40 menit dengan pelarut etanol 80% menghasilkan rendemen sebesar 19,24% dan ekstraksi maserasi selama 20 jam memberikan rendemen sebesar 18,46%. Cameron dan Wang (2006) melakukan ekstraksi pati jagung dengan ultrasonik selama 2 menit menghasilkan rendemen sebesar 55,2-67,8%. Hasil tersebut hampir sama dengan rendemen yang didapatkan dengan memanaskan air selama 1 jam yaitu.

4 sebesar 53,4%. Hal ini menunjukkan bahwa proses ekstraksi ultrasonik memberikan hasil rendemen yang lebih besar dengan waktu ekstraksi yang lebih cepat. Khacha-ananda. dkk.. (2013). membandingkan. aktivitas. antikanker. menggunakan sampel berupa propolis yang diekstraksi menggunakan metode ultasonik dan maserasi selama 24 jam. Hasil untuk uji aktivitas antikanker paruparu A549 diperoleh nilai IC50 sebesar 93,96 g/mL untuk metode ultrasonik dan 104,5 g/mL untuk maserasi. Uji aktivitas antikanker dengan metode yang sama juga dilakukan pada sel HeLa yang menghasilkan nilai IC50 sebesar 58,77 g/mL dengan metode ultrasonik dan 80,96 g/mL dengan maserasi. Zamaniyah (2018) membandingkan hasil uji aktivitas antikanker fraksi n-hekasan ekstrak etanol daging biji kluwak menggunakan metode ekstraksi maserasi dan metode ultrasonik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 sebesar 664 µg/mL untuk maserasi dan 461,75 µg/mL untuk ultrasonik. Metode ultrasonik memberikan hasil uji aktivitas antikanker dengan nilai IC50 yang lebih rendah jika dibandingkan dengan ekstraksi maserasi. Metode yang digunakan untuk melihat efek sitotoksik ekstrak daun sirsak pada sel kanker payudara T47D adalah metode MTT (micro tetrazolium). Metode MTT banyak digunakan dalam pengujian aktivitas antikanker dikarenakan proses pengerjaannya relatif cepat, sensitif, dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah besar dan lebih akurat (Basmal dkk., 2009). Sel T47D banyak digunakan dalam penelitian tentang kanker payudara karena T47D memiliki beberapa kelebihan yaitu memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, penanganan yang mudah dan memiliki homogenitas yang tinggi (Abcam, 2007)..

5 Berdasarkan uraian di atas, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas ekstrak daun sirsak dengan variasi pelarut berupa metanol, etanol dan etil asetat dengan metode ekstraksi ultrasonik. Hal ini dilakukan agar dapat ditemukan obat tradisional sebagai pnghambat aktivitas kanker payudara T47D yang efisien tanpa membahayakan jaringan sehat lainnya.. 1.2 Rumusan Masalah Rumusan masalah pada penelitian ini antara lain: 1. Ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn.) apakah yang memiliki nilai IC50 terendah terhadap sel kanker payudara T47D? 2. Bagaimana hasil identifikasi ekstrak daun sirsak yang berpotensi sebagai agen antikaner payudara T47D dengan LC-MS/MS?. 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah: 1. Untuk mengetahui ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn.) yang memiliki nilai IC50 terendah terhadap sel kanker payudara T47D. 2. Untuk mengetahui hasil identifikasi ekstrak daun sirsak yang berpotensi sebagai agen antikaner payudara T47D dengan LC-MS/MS.. 1.4 Hipotesis Hipotesis penelitian sebagai berikut: 1. Terdapat perbedaan aktivitas antikanker (IC50) pada ekstrak metanol, ekstrak etanol dan ekstrak etil asetat daun sirsak (Annona muricata Linn.)..

6 2. Terdapat senyawa asetogenin pada ekstrak dengan nilai IC50 terbaik dengan menggunakan LC-MS/MS.. 1.5 Batasan Masalah Batasan masalah dalam penelitian ini adalah: 1. Sampel yang digunakan adalah daun sirsak yang berasal dari daerah Tarik, Sidoarjo. 2. Ekstraksi dengan metode ultrasonik frekuensi 42 kHz selama 20 menit. 3. Pelarut yang digunakan adalah metanol, etanol dan etil asetat. 4. Uji antikanker secara in-vitro terhadap cell line kanker payudara T47D dengan metode MTT (microtetrazolium). 5. Identifikasi senyawa asetogenin menggunakan KLT. 6. Identifikasi senyawa asetogenin menggunakan LC-MS/MS.. 1.6 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah: 1. Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi kepada masyarakat mengenai daun sirsak (Annona muricata Linn.) dapat dijadikan sebagai obat antikanker. 2. Sebagai salah satu referensi dan perbandingan dalam penelitian lebih lanjut..

BAB II TINJAUAN PUSTAKA. 2.1 Daun Sirsak (Annona muricata Linn.) Daun sirsak merupakan bagian dari tanaman sirsak (Annona muricata Linn.). Daun sirsak memiliki bentuk telur atau lanset dengan ujung runcing, tepi rata, pangkal meruncing, pertulangan menyirip dan berwarna hijau kekuningan (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991) seperti pada Gambar 2.1. Susunan taksonomi dari tanaman sirsak adalah sebagai berikut (Sunarjono, 2005): Divisio Subdivisio Kelas Ordo Famili Genus Spesies. : Spermathophyta : Angiospermae : Dicotyledoneae : Ranales : Annonaceae : Annona : Annona muricata Linn.. Gambar 2.1 Daun sirsak (Annona muricata Linn.) (Sunarjono, 2005). Daun sirsak bermanfaat sebagai antidiare, analgetik, antidisentri, antiasma, antihelmintik, antikanker (McLaughlin, 2008) dan antioksidan (Zakiah dkk., 2017). Kandungan fitokimia terbanyak dalam daun sirsak adalah golongan senyawa asetogenin (Adelina dkk., 2014). Hal tersebut membuktikan bahwa segala sesuatu. 7.

8 yang Allah SWT ciptakan memiliki manfaat yang terkandung didalamnya. Sebagaimana dijelaskan dalam surat Asy-Syuara:7, Allah SWT berfirman,. ِ ِ ‫األر‬ ۞‫ض َك ْم أَنْبَ ْت نَا فِ َيها ِم ْن ُك ِل َزْوج َك ِري‬ ْ ‫أ ََوََلْ يََرْوا إ َىل‬ “Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, berapakah banyaknya Kami tumbuhkan di bumi itu berbagai macam tumbuh-tumbuhan yang baik?”(Q.S. AsySyu’ara 7). Berdasarkan ayat di atas, kata ‫ َزْوج َك ِري‬yang berarti “tumbuh-tumbuhan yang baik” terkandung makna bahwa, tumbuhan yang Allah SWT ciptakan di muka bumi ini memiliki manfaat bagi kehidupan. Kata ‫ َزْوج َك ِري‬juga dijelaskan dalam kitab tafsir as-Showi bahwa, Allah SWT menciptakan tumbuhan yang beragam jenisnya di bumi, kemudian dari tumbuhan tersebut Allah SWT memberikan manfaat yang dapat mendatangkan kebaikan bagi makhluk-Nya (Shihab, 2002). Salah satu jenis tumbuhan yang bermanfaat bagi manusia adalah tumbuhan sirsak terutama pada bagian daunnya.. 2.2 Asetogenin Asetogenin merupakan senyawa yang didapatkan dari hasil isolasi tanaman Annonaceae (Zeng dkk., 1996). Asetogenin terdiri dari senyawa poliketida dengan struktur 30-32 rantai karbon tidak bercabang yang terikat pada 5-metil-2-furanon. Struktur asetogenin terdapat gugus furanon yang memiliki aktivitas sitotoksik (Hermawan dan Laksono, 2013) yang bersifat selektif dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tanpa menyerang sel tubuh yang normal (Redaksi Trubus, 2012)..

9 OH. OH. H3C. OH. X. O OH. O O. Gambar 2.2 Struktur umum annonaceous asetogenin (Gorman, 2006). Asetogenin bersifat semi polar, mudah larut dalam pelarut organik (Zeng dkk., 1996), tidak tahan panas dan dapat mengalami perubahan struktur pada suhu>60˚C (Handayani dkk., 2016). Struktur umum dari asetogenin pada Gambar 2.2. Tanaman sirsak telah diidentifikasi mengandung 50 jenis asetogenin. Asetogenin yang terkandung dalam daun sirsak terdapat 18 jenis (Zeng dkk., 1996). Beberapa jenis asetogenin yang terkandung dalam daun sirsak dirangkum pada Tabel 2.1.. Tabel 2.1 Jenis asetogenin dalam daun sirsak (Alali dkk., 1999) No. Nama Rumus Molekul Berat Molekul 1 Annonacin C35H64O7 597 2 cis-Annonacin C35H64O7 597 3 Annomuricin A C35H64O8 612 4 Annomuricin B C35H64O8 612 5 Annomuricin C C35H64O8 612 6 Annomuricin E C35H64O8 612 7 2,4-cis-Annomuricin-D-one C35H64O8 612 8 2,4-trans-Annomuricin-D-one C35H64O8 612 9 Annopentocin A C35H64O8 612 10 Annopentocin B C35H64O8 612 11 Annopentocin C C35H64O8 612 12 Muricapentocin C35H64O8 612 13 Muricatocin A C35H64O8 612 14 Muricatocin B C35H64O8 612 15 Muricatocin C C35H64O8 612 16 Annohexocin C35H64O9 628 17 Murihexocin C37H68O7 628. Adanya asetogenin dalam daun sirsak telah dibuktikan oleh beberapa penelitian. Pradana dkk. (2015) menyebutkan bahwa hasil uji Kedde menunjukkan adanya gugus lakton pada ekstrak etanol daun sirsak yang diperkuat oleh spektra.

10 FTIR yang menunjukkan adanya lakton tidak jenuh dari sampel tersebut. Hasil penelitian Swari (2012) menyatakan bahwa fraksi metanol ekstrak etanol daun sirsak mengandung senyawa asetogenin dari hasil spektra FTIR dengan adanya serapan dari gugus lakton tidak jenuh. Selain itu, Mulia dkk. (2015) mengidentifikasi asetogenin dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol daun sirsak menggunakan LC-MS yang menghasilkan nilai serapan m/z sebesar 597,23 dengan waktu retensi lebih dari 25 menit. Ekstrak daun sirsak hasil ekstraksi maserasi secara in-vitro berpotensi sebagai antikanker payudara T47D (Rachmani dkk., 2012). Penelitian tersebut menghasilkan nilai IC50 sebesar 17,1 g/mL. Aktivitas antikanker ini tidak berbeda nyata dengan standar obat tamoxifen dengan nilai IC50 sebesar 13,41 g/mL (Muhartono dan Subeki, 2015). Hasil tersebut menunjukkan bahwa penggunaan ekstrak daun sirsak memiliki aktivitas yang hampir sama dengan obat kemoterapi.. 2.3 Ekstraksi Metode Ultrasonik Ekstraksi. dengan. menggunakan. metode. ultrasonik. bertujuan. untuk. mendapatkan senyawa organik pada tanaman dengan memanfaatkan gelombang utrasonik. Frekuensi gelombang ultrasonik yaitu antara 20-500 kHz (Jambrak, 2012). Ekstraksi dengan cara merambatkan energi dari gelombang ultrasonik mealui media perambatan berupa cairan akan menimbulkan efek kavitasi yang dapat mengekstrak senyawa ke dalam pelarut (Winata dan Yunianta, 2015). Ekstraksi ultrasonik menunjukkan efisiensi dalam penggunaan pelarut yang relatif sedikit dan waktu yang lebih cepat. Penggunaan ekstraksi ultrasonik dapat menjaga kualitas bahan, meningkatkan ekstraksi komponen suatu bahan dan.

11 meningkatkan rendemen (Jambrak, 2012). Safdar dkk. (2017) ekstraksi ultrasonik kulit jeruk mandarin kinnow 30 kali lebih cepat daripada ekstraksi maserasi, dengan hasil rendemen ultrasonik sebesar 19,24% dan maserasi memberikan rendemen sebesar 18,46%. Cameron dan Wang (2006) membandingkan metode ekstraksi ultrasonik selama 2 menit dengan ekstraksi yang dibantu dengan pemanasan air selama 60 menit, dengan parameter keberhasilan dari nilai rendemen berturut-turut sebesar 55,2-67,8% dengan ultrasonik dan 53,4% dengan bantuan pemanasan air. Penggunaan ekstraksi ultrasonik dapat mempengaruhi hasil uji aktivitas antikanker selain dari nilai rendemen. Khacha-ananda dkk. (2013) menghasilkan nilai IC50 ekstrak propolis terhadap antikanker paru-paru A549 sebesar 104,5 g/mL dengan maserasi dan 93,96 g/mL dengan ultrasonik. Selain itu, sampel. propolis diuji aktivitas antikanker serviks pada sel HeLa dengan nilai IC50 sebesar 80,96 g/mL melalui ekstraksi maserasi, dan nilai IC50 sebesar 58,77 g/mL melalui ekstraksi ultrasonik. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa metode ekstraksi ultrasonik menghasilkan nilai IC50 yang lebih baik jika dibandingan dengan metode maserasi. Pemilihan pelarut yang digunakan juga berpengaruh dalam memberikan efektifitas yang tinggi terhadap porses ekstraksi. Pemilihan pelarut ekstraksi berdasarkan kelarutan suatu senyawa dalam pelarut tersebut. Menurut Jannah dkk. (2017), pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi senyawa daun sirsak merupakan pelarut polar atau semi polar yang bersifat universal sehingga diharapkan dapat menarik metabolit sekunder yang bersifat polar hingga semi polar. Daun sirsak yang diekstraksi dengan pelarut metanol menghasilkan rendemen.

12 sebesar 37,87%. Puriyanti (2018) menyebutkan hasil rendemen ekstrak etanol daun sirsak sebesar 33,98% dan ekstrak etil asetat dengan rendemen sebesar 16,75%.. 2.4 Uji Aktivitas Antikanker secara In-vitro dengan Metode MTT Penelitian ini menggunakan metode MTT (Methylthiazol Tetrazolium). Pengujian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antikanker dari suatu sampel pada kultur sel yang digunakan. Prinsip uji MTT adalah reaksi reduksi oksidasi di dalam sel. Garam MTT akan direduksi oleh enzim reduktase suksinat tetrazolium menjadi kristal formazan seperti pada Gambar 2.3.. NADH + H. N N. N. N. NH N. Br N CH3. N. NAD + HBr. N. N CH3. S S CH3 CH3. MTT (Kuning). Formazan (Ungu). Gambar 2.3 Reaksi reduksi MTT menjadi formazan (Sukhramani dkk., 2011). Garam MTT yang berwarna kuning akan berubah menjadi warna biru keunguan yang menunjukkan terbentuknya kristal formazan. Absorbansi kristal formazan. dapat. diketahui. dengan. menggunakan. ELISA. (Enzyme-linked. immunosorbent assay) reader pada panjang gelombang antara 500-600 nm. Semakin. besar intensitas warna biru keunguan, maka jumlah sel hidup semakin banyak (Mosmann, 1983). Beberapa penelitian tentang aktivitas antikanker payudara T47D menggunakan metode MTT. Mukharomah (2019) menunjukkan bahwa sampel ekstrak etanol.

13 daun sirsak menghasilkan nilai IC50 sebesar 92,821 µg/mL. Lilbaiq (2017) dengan sampel berupa ekstrak etanol daun sirsak yang diembankan pada zeolite NaX menghasilkan nilai IC50 sebesar 83,6 µg/mL. Aulianshah dkk. (2012) dan Rachmani dkk. (2012) menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak memberikan nilai IC50 berturut-turut sebesar 31,14 dan 17,1 µg/mL. Metode MTT memiliki beberapa kelebihan, antara lain relatif cepat, sensitif, akurat, dan dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah besar (Basmal dkk., 2009). Hasil dari uji MTT menghasilkan nilai IC50 yang digunakan sebagai parameter dalam menunjukkan konsentrasi sampel dalam menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50%. Selain itu, nilai IC50 dapat menunjukkan suatu senyawa memiliki sifat toksik terhadap sel. Semakin besar nilai IC50 menunjukkan bahwa potensi suatu senyawa yang semakin tidak toksik (Miyata dkk., 1999). Menurut Kuete dan Efferth (2015), suatu bahan yang memiliki nilai IC50 <50 µg/mL memiliki sifat sitotoksik yang kuat, sifat sitotoksik moderat jika 50 µg/mL <IC50< 200 µg/mL, 200 µg/mL < IC50< 1000 µg/mL bersifat sitotoksik lemah dan tidak toksik pada nilai IC50> 1000 µg/mL. Sel kanker payudara T47D merupakan sel yang diperoleh dari jaringan payudara wanita yang terkena ductal carcinoma. Sel T47D dapat tumbuh di media RPMI (Roswell Park Memorial Institute) (ATCC, 2008). Kelebihan dari T47D adalah dapat ditumbuhkan pada suhu 37˚C, dapat tumbuh secara kontinu, menempel pada dasar cawan, memiliki homogenitas yang tinggi, penanganan mudah, dan memiliki kemampuan pertumbuhannya sangat cepat. Sel T47D ini mudah diganti dengan dengan sel baru yang telah dibekukan jika terjadi kontaminasi (Abcam, 2007)..

14 2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji KLT (kromatografi lapis tipis) digunakan untuk menguji adanya asetogenin dalam ekstrak daun sirsak dengan menggunakan reagen vanillin. Asetogenin dapat diidentifikasi dengan menggunakan reagen vanilin-asam sulfat karena memiliki gugus lakton tidak jenuh. Reagen akan berinteraksi dengan gugus karbonil dari asetogenin (Ranisaharivony dkk., 2015). Beberapa penelitian menggunakan eluen yang berupa campuran pelarut metanol:diklorommetana yang bersifat semi polar ke nonpolar. Asetogenin bersifat lipofilik, sifat tersebut menunjukkan bahwa asetogenin lebih menyukai lemak dan pelarut organik daripada air (Ranisaharivony dkk., 2015). Pradana dkk. (2015) memisahkan asetogenin dengan eluen metanol:diklorometana (4,5:0,5) yang dibantu dengan reagen Kedde dan dihasilkan noda merah muda pucat yang menandakan bahwa fraksi metanol ekstrak etanol daun sirsak mengandung asetogenin. Hasil tersebut didukung dengan data FTIR yang menyebutkan adanya serapan dari gugus lakton. Ranisaharivony dkk. (2015) melakukan penelitian dengan menggunakan sampel berupa ekstrak etanol biji sirsak dengan eluen etanol:diklorometana (1:19). Penelitian tersebut, menghasilkan nilai Rf asetogenin sebesar 0,23; 0,27 dan 0,34 yang dibantu dengan reagen vanillin. Mukharomah (2019) melakukan pemisahan asetogenin dari ekstrak etanol daun sirsak dengan menggunakan eluen etanol:diklorometana (1:9) menghasilkan nilai Rf sebesar 0,4625; 0,475 dan 0,725 dengan menggunakan reagen vanillin. Identifikasi yang digunakan dalam proses pemisahan senyawa melalui metode kromatografi lapis tipis menggunakan acuan nilai Rf (Reterdation Factor). Nilai Rf.

15 yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran pelarut tertentu dan reagen yang digunakan (Sastrohamidjojo, 2007). Nilai Rf asetogenin dengan menggunakan eluen metanol:diklorometana memiliki rentang dari 0,2 sampai 0,7 (Rupprecht dkk., 1990).. 2.6 Identifikasi Asetogenin dengan LC-MS/MS Identifikasi dengan menggunakan LC-MS/MS berfungsi untuk mendukung hasil yang telah didapatkan pada proses KLT. LC-MS/MS merupakan metode pemisahaan dengan kromatografi cair (HPLC) dan deteksi berat molekul dengan spektrometri massa (Grebe dan Singh, 2011). Spektroskopi massa berupa spektrometer massa yang dapat menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif seperti mengidentifikasi senyawa yang belum diketahui, menentukan struktur dari suatu senyawa melalui pola fragmentasinya dan menghitung berapa banyak senyawa dalam sampel. Spektrometer massa (MS) bekerja berdasarkan molekul pengion, mengidentifikasi ion-ion yang dihasilkan menurut m/z. Proses identifikasi asetogenin menggunakan LC-MS/MS yang dilengkapi dengan electrospray ionization (ESI) mode positif sebagai sumber ionisasi (Bonneau dkk., 2017). ESI akan menghasilkan ion [M+H]+ dan [M+Na]+. ESI mampu menganalisis molekul besar seperti protein, polimer dan karbohidrat. Menurut Gu dkk. (1997), metode ESI dapat meningkatkan sensitivitas LC-MS/MS dan menurunkan jumlah sampel yang diperlukan dalam analisis struktural. Kolom yang digunakan adalah C18 (2,0x50 mm, 3,0 µm) dengan fase gerak berupa A (0,1% asam format dalam air) dan B (0,1% asam format dalam asetonitril). Fase gerak menggunakan sistem gradien dengan A:B (9:1-1:9) (Kim.

16 dkk., 2018). Keuntungan sistem gradien adalah dapat memisahkan beberapa komponen senyawa kimia dengan dengan sifat kepolaran yang berbeda (Feng dkk., 2014), meningkatkan sensitivitas proses pemisahan, meningkatkan efisiensi waktu analisis (Putra, 2004) dan meningkatkan resolusi pemisahan (Ariani dkk., 2015). Hasil penelitian Mulia dkk. (2015) pada waktu retensi lebih dari 25 menit didapatkan beberapa puncak dari kromatogram, dengan ion yang dominan sebanyak 60% pada m/z sebesar 597,23 mengindikasikan ion molekular [M+H]+ yang diduga sebagai senyawa annonacin yang memeliki nilai m/z sebesar 596,88. Penelitian Gu dkk. (1997) pada Rollinia mucosa didapat hasil identifikasi ion asetogenin dengan menggunakan LC-MS/MS dengan waktu retensi 37-43 menit. Kim dkk. (2018) menyatakan bahwa dalam daun sirsak terdapat senyawa asetogenin yang dibuktikan dari pola fragmentasi yang didapat yaitu [M-112u+Na]+ yang menunjukkan hilangnya gugus lakton tidak jenuh dan [M-xH2O+H]+ yang menunjukkan hilangnya gugus hidroksil. Puncak dominan yang didapatkan pada m/z sebesar 597,4695 yang menunjukkan adanya senyawa C35H64O7 yang merupakan senyawa annonacin. Yiallouris dkk. (2018) penelitian pada ekstrak etanol daun dan biji sirsak dengan menggunakan LC-MS menghasilkan puncak ion annonacin pada waktu retensi 11,9 menit dengan nilai m/z sebesar 597,63 dengan puncak tambahan pada m/z 619,59; 579,64 dan 561,59. Menurut Bonneau dkk. (2016), hasil LC-MS/MS dari annonacin menunjukkan adanya ion [M+Na]+ dengan nilai m/z sebesar 619,4 yang diindikasikan penyebab hilangnya gugus lakton tidak jenuh. Ion tersebut lebih banyak jika daripada ion [M+H]+ dengan m/z sebesar 597,4. Menurut Ranisaharivony dkk. (2015), senyawa annonacin dalam daun sirsak menghasilkan.

17 ion [M+Na]+, [M+H]+, [MH-H2O]+, [MH-2H2O]+, [MH-3H2O]+ dan [MH-4H2O]+ dengan nilai m/z berturut-turut sebesar 619,6; 597,4; 579,4; 561,5; 543,5 dan 525,5..

BAB III METODE PENELITIAN. 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian Penelitan dilaksanakan pada Mei-Februari tahun 2020 di Laboratorium Kimia Organik dan Laboratorium Kimia Analitik Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang, Labratorium Parasitologi Jurusan Kedokteran Umum, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada dan Badan Reserse Kriminal Polri Pusat Laboratorium Forensik Jakarta Timur. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1. Alat. Alat-alat yang digunakan dalam proses preparasi sampel adalah seperangkat alat gelas, blender kering, ayakan 60 mesh dan neraca analitik. Pada proses ekstraksi ultrasonik digunakan alat ekstraksi ultrasonic cleanser, spatula, Erlenmeyer, corong Buchner dan botol semprot. Mikropipet 200, 1000 L, penangas air, mikroskop inverted, laminar airflow, inkubator CO2, vortex, tabung conical, 96-well plate, cawan petri, hemocytometer, counter dan ELISA (Enzymelinked. immunosorbent. assay). reader. digunakan. pada. metode. MTT. (microtetrazolium). Lampu UV, pipa kapiler, chamber, dan LC-MS/MS digunakan dalam proses identifikasi.. 18.

19 3.2.2. Bahan. Bahan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak yang berasal dari Tarik, Sidoarjo. Bahan-bahan kimia yang dibutuhkan adalah metanol, etanol, etil asetat, aquades dan diklorometana. Bahan yang digunakan dalam metode MTT adalah sel kanker payudara T47D, PBS, tripsin-EDTA, media RPMI, MK (Media Komplit), DMSO 0,2%, MTT 5 mg/mL, SDS 10% dan etanol 70%. Bahan yang dibutuhkan dalam proses identifikasi adalah reagen vaniillin, asam asetat, asam sulfat pekat dan plat silika G60 F254.. 3.3 Rancangan Penelitian Penelitian ini berupa pengujian eksperimental di laboratorium berupa ekstrak daun sirsak dengan metode ekstraksi ultrasonik sebagai antikanker sel payudara T47D. Ekstraksi dengan metode ultrasonik senyawa aktif dari daun sirsak selama 20 menit menggunakan pelarut etanol, etil asetat, dan metanol. Hasil ekstraksi kemudian dialiri gas N2. Selanjutnya dilakukan Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA) dan uji aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D dengan metode MTT (secara in-vitro). Ekstrak pekat dianalisis menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) dan Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).. 3.4 Tahapan Penelitian Tahapan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah sebagai berikut: 1.. Preparasi sampel.. 2.. Ekstraksi daun sirsak menggunakan metode ultrasonik..

20 3.. Identifikasi dengan KLTA.. 4.. Uji aktivitas antikanker dengan metode MTT.. 5.. Identifikasi dengan menggunakan KLTP.. 6.. Identifikasi dengan menggunakan LC-MS/MS.. 3.5 Pelaksanaan Penelitian 3.5.1 Preparasi Sampel Sampel daun sirsak segar sebanyak 2 kg dicuci dengan air hingga bersih. Sampel dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Sampel yang telah kering dihaluskan dan diayak menggunakan ayakan 60 mesh.. 3.5.2 Ekstraksi Senyawa Asetogenin dengan Metode Ultrasonik Sebanyak 20 g serbuk daun sirsak dimasukkan masing-masing ke dalam tiga Erlenmeyer dan ditambahkan metanol ke dalam Erlenmeyer pertama, etanol ke dalam Erlenmeyer kedua dan etil asetat ke dalam Erlenmeyer ketiga, perbandingan sampel:pelarut sebesar 1:10. Selanjutnya, sampel diekstraksi menggunakan ekstraktor ultrasonik selama 20 menit (Handayani dkk., 2016) pada suhu kamar dengan frekuensi 42 kHz. Hasil ekstraksi disaring dengan corong Buchner dan dialiri gas N2, kemudian ditimbang serta dihitung rendemennya dengan Persamaan 3.1.. Berat ekstrak. % Rendemen= Berat sampel x 100% .................................................................... (3.1).

21 3.5.3 Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA) Pemisahan senyawa aktif dengan metode KLT dilakukan pada masing-masing sampel ekstrak daun sirsak, yaitu metanol, etanol dan etil asetat.. 3.5.3.1 Persiapan Plat KLT Plat silika G60 F254 dengan ukuran 1x10 cm digunakan sebagai fasa diam dalam proses pemisahan senyawa aktif dari sampel. Selanjutnya plat diberi penanda yang berupa garis dengan jarak 1 cm dari tepi bawah untuk menentukan posisi awal totolan dan penanda pada bagian batas atas dengan jarak 0,5 cm dari tepi atas plat yang berfungsi sebagai batas proses elusi. Kemudian, plat diaktivasi untuk menghilangkan kadar air yang terkandung di dalamnya dengan cara dioven pada suhu 100˚C selama 30 menit.. 3.5.3.2 Persiapan Fase Gerak (Eluen) Eluen dijenuhkan dalam chamber dengan cara mencampur sesuai komposisi eluen. ke dalam chamber lalu ditutup rapat dan dijenuhkan selama 1 jam.. Penjenuhan ini berfungsi untuk menyeimbangkan tekanan uap pada seluruh bagian chamber. Adapun eluen adalah campuran metanol:diklorometana dengan variasi 1:19 (Mukharomah, 2019), dan 0,5:4,5 (Pradana dkk., 2015).. 3.5.3.3 Penotolan Sampel Ekstrak daun sirsak ditotolkan sebanyak 5 totolan (di tempat yang sama) pada garis penanda bagian bawah plat menggunakan pipa kapiler. Kemudian plat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan..

22 3.5.3.4 Proses Elusi Plat yang telah ditotol dengan ekstrak daun sirsak dielusi dengan eluen yang telah dijenuhkan. Kemudian chamber ditutup rapat hingga eluen mencapai batas penanda bagian atas plat. Plat yang telah dielusi diangkat dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.. 3.5.3.5 Identifikasi Noda Noda-noda hasil pemisahan pada plat silika G60 F254 diamati di bawah sinar UV 254 dan 366 nm. Noda yang dihasilkan ditandai menggunakan pensil, kemudian disemprot dengan reagen vanillin-asam sulfat, di oven pada suhu 70˚C dan diamati dibawah sinar UV. Selanjutnya, diamati perubahan warna yang terjadi dan dihitung nilai Rfnya dengan Persamaan 3.2.. Rf =. Jarak, senyawa, dari titik. asal jarak. pelarut dari. titik asal. ................................................................................ (3.2). 3.5.4 Uji Aktivitas Antikanker dengan Metode MTT 3.5.4.1 Penyiapan Sel Sel kanker payudara T47D dikeluarkan dari freezer yang bersuhu -80˚C, kemudian sel tersebut dicairkan dengan cara dihangatkan selama 2-3 menit dengan penangas air pada suhu 37˚C. Setelah sel mencair dipindahkan, ke tabung conical yang berisi media RPMI sebanyak 10 mL. Proses selanjutnya sel kanker (pelet) dipisahkan dari media RPMI dengan cara disentrifugasi dengan 1200 rpm selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan ditambahkan 4 mL MK dan dihomogenkan. Campuran pelet dan MK dimasukkan ke dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu 37˚C/5%.

23 CO2 selama 3-4 jam. Panen sel ditandai dengan jumlah sel yang melekat di dasar cawan petri sudah konfluen (70-80%) yang diamati di bawah mikroskop. Tahapan panen sel yaitu, MK dibuang terlebih dahulu, ditambahkan ±5 mL PBS dan dihomogenkan kemudian dibuang, dilakukan pengulangan 3 kali. TripsinEDTA ditambahkan sebanyak 1 mL secara merata pada cawan petri, kemudian diinkubasi selama 3 menit dan diamati di bawah mikroskop inverted. Panenan sel pada cawan petri ditambahkan 5 mL media RPMI dan diresuspensi penambahan RPMI berfungsi untuk menginaktifkan sel. Sel diamati di bawah mikrosop inverted dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37˚C/5% CO2 selama 24 jam.. 3.5.4.2 Perhitungan Sel 10 L panenan sel dipipetkan ke dalam hemacytometer. Kemudian hemacytometer yang berisi panenan sel diamati dan dihitung di bawah mikroskop inverted dan dihitung menggunakan counter. Jumlah sel kanker yang dihitung dapat diketahui dengan Persamaan 3.3.. Sel yang dihitung =. sel kamar A+ sel kamar B+ sel kamar C+ sel kamar D 4. x 104 .................. (3.3). 3.5.4.3 Peletakan Sel pada Plate Jumlah sel yang akan diletakkan pada setiap sumuran diketahui dengan menggunakan Persamaan 3.4. Sel diletakkan sesuai perhitungan ke dalam tabung conical, media RPMI ditambahkan hingga volume total mencapai 10 mL, dan dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran pada plate 96-well sebesar 100 µL. Namun, sebanyak 4 sumuran tidak ditambahkan sel dikarenakan berfungsi sebagai.

24 kontrol media. Kemudian plate 96-well diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37˚C/5% CO2.. Panenan mL panenan sel yang ditransfer =. 3.5.4.4. total sel yang diperlukan sel yang terhitung. ........................ (3.4). Pembuatan. Larutan Sampel. dan Pemberian Larutan. Sampel pada Plate. Ekstrak kasar daun sirsak (metanol, etanol dan etil asetat) ditimbang sebanyak 10 mg dan ditambahkan masing-masing 100 L DMSO 0,2%, kemudian divortex. Sel dalam plate 96-well diambil dari inkubator, kemudian media RPMI dibuang. Sumuran yang terisi sel ditambahkan 100 L PBS dan dibuang kembali. Larutan sampel ekstrak daun sirsak dimasukkan sebanyak 10 L dengan konsentrasi 1000, 500; 250; 125; 62,5; 31,25 dan 15,63 ppm seperti pada Gambar 3.1. Perlakuan tersebut dilakukan 4 kali pengulangan dan diinkubasi kembali selama 24 jam.. Gambar 3.1 Desain plate 96-well untuk percobaan.

25 3.5.4.5. Pemberian Larutan MTT. Larutan MTT dibuat dari 9 mL media RPMI dengan 1 mL MTT stok (5 mg/mL) di tabung conical dan diresuspensi. Larutan MTT ditambahkan sebanyak 1 L ke setiap sumuran. Formazan akan terbentuk saat sel diinkubasi selama 3-4 jam di dalam inkubator. Apabila formazan telah terbentuk, sel diamati kondisinya menggunakan mikroskop inverted, lalu 100 µL SDS 10% ditambahkan ke dalam setiap sumuran, dimasukkan plate ke dalam kotak sterofoam dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Selanjutnya, nilai absorbansi ditentukan menggunakan ELISA reader untuk mengetahui nilai IC50 dari setiap sampel ekstrak daun sirsak dengan panjang gelombang 595 nm dan dihitung prosentase sel hidup dengan Persamaan 3.5. Data dari prosentase sel hidup ditentukan nilai IC50 nya menggunakan microsoft office excel.. (A-B). Persentase sel hidup=(C-B) x 100% .................................................................. (3.5) A adalah absorbansi perlakuan; B adalah absorbansi kontrol media dan C adalah absorbansi kontrol negatif. 3.5.5 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Ekstrak daun sirsak yang menghasilkan nilai IC50 terbaik dilakukan pengujian senyawa aktif menggunakan metode KLTP. Plat silika G60 F254 ukuran 10x20 cm digunakan dalam proses pemisahan dengan KLTP. Tahapan yang dilakukan sama seperti pada KLTA, namun penggunaan eluen pada proses KLTP ini merupakan eluen yang memberikan hasil pemisahan terbaik pada KLTA. Noda senyawa asetogenin yang dihasilkan dihitung nilai Rfnya kemudian dikerok dan dilarutkan.

26 dalam pelarut yang digunakan pada proses ekstraksi. Selanjutnya disentrifugasi untuk mengendapkan silikanya.. 3.5.6 Identifikasi Asetogenin dengan LC-MS/MS Ekstrak etil asetat daun sirsak dan isolat hasil KLTP diambil 2 mg untuk dianalisis menggunakan LC-MS/MS dengan kondisi pada Tabel 3.1.. Tabel 3.1 Kondisi instrumentasi LC-MS/MS Nama Kondisi Kolom C18 UHPLC ACQUITY UPLC®H-Class System (waters,USA) Fasa gerak 0,1% asam format dalam air (fasa A) 0,1% asam format dalam asetonitril (fasa B) Sistem elusi Gradien 0 menit A:B (95%:5%) 2 menit A:B (75%:25%) 3 menit A:B (75%:25%) 14 menit A:B (0%:100%) 15 menit A:B (0%:100%) 19 menitA:B (95%:5%) 23 menit A:B (95%:5%) Laju alir 0,2 mL/menit Volume injeksi 5 µL MS type Xevo G2-S Qtof (waters, USA) Sumber ionisasi ESI (Electrospray Ionization) mode positif Software MassLynx V4.1 Kontrol suhu kolom 50˚C.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN. 4.1 Preparasi Sampel Proses preparasi sampel terdiri atas dua tahapan utama. Tahapan pertama terbagi lagi atas dua tahapan, yaitu penyiapan sampel dan pencucian. Penyiapan sampel diawali dengan pemilihan daun yang digunakan dengan kriteria daun urutan ke-3 sampai ke-5 dari ujung ranting, karena pada daun-daun tersebut senyawa asetogenin banyak dihasilkan. Hal ini sesuai pernyataan Wicaksono (2011), bahwa pada daun sirsak usia muda senyawa asetogenin belum banyak terbentuk, sedangkan pada daun sirsak usia tua senyawa asetogenin mulai terdegradasi sehingga kadarnya berkurang. Proses pencucian sampel, tujuannya untuk membersihkan daun sirsak dari kotoran yang menempel. Tahapan kedua terdiri atas dua kegiatan yakni pengeringan dan penghalusan sampel. Pengeringan sampel bertujuan mengurangi kadar air pada daun sirsak untuk menghindari perkembangbiakan mikroba dan sampel dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama. Agar senyawa pada daun tidak rusak proses pengeringan sampel dilakukan pada suhu ruang. Proses penghalusan sampel bertujuan untuk memperbesar luas permukaan sampel agar proses kontak sampel dengan pelarut semakin besar, sehingga proses ektraksi ultrasonik lebih efektif.. 4.2 Ekstraksi Ultrasonik Daun Sirsak Metode ultrasonik merupakan metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini. Proses ekstraksi ini bertujuan untuk mengekstrak senyawa asetogenin. 27.

28 menggunakan pelarut metanol, etanol dan etil asetat. Pemilihan pelarut ini didasarkan pada prinsip like dissolve like yang berarti suatu senyawa akan terekstrak pada pelarut dengan kepolaran yang sama. Hasil ekstrak pekat dan rendemen ditunjukkan pada Tabel 4.1.. Tabel 4.1 Hasil ekstrak pekat daun sirsak (Annona muricata Linn.) Warna Berat Sampel Berat Ekstrak Pelarut Ekstrak (gram) Kental (gram) Metanol Hijau 15 2,2136 Etanol Hijau tua 15 2,1918 Etil Asetat Hijau 15 0,7302. Rendemen (%) 14,757 14,612 4,868. Berdasarkan Tabel 4.1 ekstrak metanol dan etil asetat daun sirsak yang diekstraksi menggunakan metode ultrasonik selama 20 menit menghasilkan rendemen berturut-turut sebesar 14,757 dan 4,868%. Hasil tersebut tidak berbeda jauh dengan penelitian Asbanu dkk., (2019) dengan menggunakan ekstraksi maserasi selama 24 jam yang dihasilkan rendemen untuk ekstrak metanol dan etil asetat berturut-turut sebesar 14,6 dan 3,2%. Hasil rendemen ekstrak etanol yang diekstraksi secara ultrasonik selama 20 menit sebesar 14,612%. Adapun penelitian Mukharomah (2019) menggunakan metode maserasi selama 24 jam menghasilkan rendemen sebesar 15,22%. Hasil rendemen yang diperoleh menggunakan metode ultrasonik selama 20 menit tidak jauh berbeda dengan metode maserasi selama 24 jam, sehingga penggunaan metode ultrasonik menunjukkan adanya efisiensi waktu yang lebih cepat. Ekstrak metanol dan etanol menghasilkan rendemen yang lebih besar daripada ekstrak etil asetat. Hal ini dikarenakan metanol dan etanol dapat merusak dinding sel tanaman, sehingga metabolit sekunder pada daun sirsak dapat diekstrak..

29 Metanol dan etanol dapat mengekstrak senyawa asetogenin dengan membentuk ikatan hidrogen. Beberapa metabolit sekunder yang terdapat pada daun sirsak masih membentuk ikatan glikosida yang dapat larut dalam pelarut metanol dan etanol. Asam fenolat dan asam ferulat merupakan beberapa aglikon yang ada dalam daun sirsak dengan gula sebagai glikonnya. Aglikon yang berupa saponin dan flavonoid berpasangan dengan glikonnya yang berupa sapogenin dan glikon O-glikosil (Puspitasari, dkk. 2016). Selain itu, gugus alifatik pada pelarut metanol dan etanol dapat melarutkan senyawa yang bersifat non polar. Pelarut etil asetat memiliki sifat semi polar sehingga dapat mengekstrak senyawa yang bersifat semi polar (Harborne, 1987) salah satunya senyawa asetogenin. Rendahnya nilai rendemen ini menunjukkan bahwa senyawa semi polar dalam daun sirsak memiliki komposisi yang lebih sedikit dibandingkan dengan senyawa polar. Penelitian yang dilakukan oleh Kadarani (2015) dengan menggunakan HPLC, bahwa dalam ekstrak metanol kulit buah srikaya matang terdapat senyawa asetogenin dengan kadar 32158.97 ppm. Hasil penelitian Ranisaharivony (2015) menunjukkan bahwa dalam ekstrak etanol biji sirsak didapatkan senyawa asetogenin sebanyak 4,2%. Fraksi etil asetat daun sirsak yang dianalisis menggunakan LC-MS menunjukkan adanya senyawa asetogenin (Mulia dkk., 2015)..

30 4.3 Identifikasi Senyawa Asetogenin dengan Kromatografi Lapis Tipis Analitik (KLTA) Senyawa asetogenin pada ekstrak daun sirsak diidentifikasi menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Variasi eluen yang digunakan meliputi metanol:diklorometana (1:19) dan metanol:diklorometana (0,5:4,5). Hasil pemisahan menggunakan eluen 0,5:4,5 menghasilkan intensitas warna yang lebih tinggi, sehingga warna dari senyawa asetogenin terlihat lebih jelas. Hasil pemisahan senyawa dengan eluen terbaik 0,5:4,5 ditunjukkan pada Gambar 4.1 dan Tabel 4.2.. asetogenin. a. b. c. Gambar 4.1 Hasil KLTA ekstrak daun sirsak sesudah disemprot reagen vanillinasam sulfat di bawah lampu UV366 (a) hasil KLTA ekstrak metanol daun sirsak (b) hasil KLTA ekstrak etanol daun sirsak (c) hasil KLTA ekstrak etil asetat daun sirsak.. Tabel 4.2 Hasil uji KLTA ekstrak daun sirsak dengan eluen metanol:diklorometana (0,5:4,5) Warna Spot di bawah Lampu No. Sampel Ekstrak Nilai Rf UV366 1 Metanol 0,575 Oranye 2 Etanol 0,675 Oranye 3 Etil Asetat 0,350 Oranye.

31 Berdasarkan Gambar 4.1 hasil KLTA menghasilkan beberapa noda dan satu noda yang diduga senyawa asetogenin pada masing-masing ekstrak ditunjukkan pada Tabel 4.2. Perbedaan nilai Rf asetogenin pada masing-masing ekstrak dikarenakan adanya perbedaan koefisien distribusi, dimana senyawa asetogenin dengan nilai Rf rendah menandakan senyawa tersebut memiliki koefisien distribusi yang besar dan lebih tertahan pada fase diam yang bersifat polar daripada fase geraknya yang non polar begitu juga sebaliknya. Senyawa aktif pada sampel akan terpisah sesuai dengan kemampuannya terhadap fase gerak maupun fase diam (Manarizki, 2019). Noda asetogenin yang berwarna oranye dihasilkan karena adanya interaksi antara senyawa asetogenin dengan reagen vanilin-asam sulfat. Perubahan warna merah menjadi oranye ini diawali dengan terjadinya pembukaan cincin lakton pada senyawa asetogenin. Proses tersebut dikarenakan adanya reaksi antara asetogenin dengan vanilin yang dibantu dengan katalis asam sulfat. Reaksi pembukaan cincin asetogenin diawali dengan gugus karbonil dari asetogenin menyerang H+ asam sulfat. Proses tersebut akan meningkatkan muatan positif pada atom C yang terikat pada gugus karbonil asetogenin, sehingga terbentuk karbokation yang bersifat elektrofilik. Gugus hidroksil pada vanilin yang bersifat kaya elektron akan membentuk ikatan dengan karbokation pada asetogenin. Tahap selanjutnya adalah pelepasan H+ dari OH+ vanilin untuk menstabilkan atom O. H+ yang dilepas akan berikatan dengan atom O pada gugus eter dari asetogenin dengan membentuk OH+ yang bersifat tidak stabil. Oleh karena itu, senyawa asetogenin melepaskan H+ dan membentuk gugus karbonil kembali yang menyebabkan terbukanya cincin lakton. Ion H+ yang dilepas akan kembali.

32 berikatan dengan ion hidrogen sulfat dan membentuk asam sulfat yang bertindak sebagai katalis (Horvat dkk., 1985). Terjadinya perubahan warna noda asetogenin diakibatkan adanya perpanjangan konjugasi pada senyawa hasil reaksi dikarenakan adanya perpanjangan konjugasi pada senyawa asetogenin. Dugaan mekanisme reaksi yang terjadi ditunjukkan pada Gambar 4.2.. Gambar 4.2 Dugaan mekanisme reaksi asetogenin dan reagen vanilin-asam sulfat. 4.4 Uji Aktivitas Antikanker secara In-vitro dengan Metode MTT Ekstrak daun sirsak masing-masing diuji aktivitas antikanker secara in-vitro menggunakan sel T47D dengan metode MTT. Sifat sitotoksik dari ekstrak daun sirsak dalam menghambat dan membunuh sel kanker payudara T47D dapat diketahui melalui uji aktivitas antikanker. Tahap pengujian aktivitas antikanker terdiri dai penyiapan sel kanker, panen sel, perhitungan sel, uji toksisitas, pemberian reagen MTT dan pembacaan asorbansi. Penyiapan sel kanker merupakan proses dihidupkan kembali sel kanker payudara T47D yang tidak aktif kemudian ditumbuhkan dan dibiakkan dalam MK.

33 (media kompleks) pada cawan petri hingga konfluen 80%. Nutrisi yang dibutuhkan oleh sel kanker untuk tumbuh berasal dari MK. MK yang digunakan mengandung penicilin streptomycin 2% yang berfungsi sebagai antibakteri, fungizone 0,5% sebagai obat antijamur, FBS (Fetal Bovine Serume) 10% sebagai suplemen pertumbuhan sel dan RPMI merupakan media yang baik untuk menumbuhkan sel kanker payudara T47D (Rosenberg, 1981). Sel yang telah konfluen kemudian dilakukan panen sel. Tahapan panen sel adalah membuang MK dan dilakukan penambahan PBS (Phosphate Buffer Saline) yang bertujuan agar tidak ada sisa MK di dalam sel, hal ini dikarenakan untuk memaksimalkan kerja dari tripsin. Proses selanjutnya adalah pelepasan ikatan antar sel dan ikatan sel dengan matriks tanpa merusak sel itu sendiri menggunakan tripsin-EDTA. Perhitungan sel dilakukan dengan bantuan hemacytometer dan mikroskop inverted. Perhitungan sel kanker hidup sebanyak 86,25 x 104 sel/mL yang dapat dilihat di Lampiran 6.1. Perhitungan untuk sel yang akan diletakkan pada plate didapatkan sebesar 1,16 mL sesuai dengan rumus pada Lampiran 6.2. Selanjutnya, sel tersebut ditambahkan media RPMI sampai volume total 10 mL. Karena setiap sumuran pada plate 96 well ini berisi 10.000 sel dalam 100 µL. Konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan dalam uji poliferasi sel yaitu 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 dan 15,63 µg/mL. Proses pemberian larutan MTT (microtetrazolium) berfungsi sebagai pemberi tanda pada sel hidup dengan terbentuknya kristal formazan. Proses terbentuknya formazan diawali dengan penyerapan MTT oleh sel kanker payudara T47D dan masuk ke dalam sistem respirasi sel di mitokondria. Reaksi reduksi MTT menjadi kristal melalui.

34 pembukaan cincin seperti pada Gambar 2.3 melibatkan enzim reduktase suksinat tetrazolium dalam sel hidup. Reaksi reduksi seluler ini membutuhkan kofaktor NADH yang dihasilkan oleh sel hidup, sehingga jumlah kristal formazan yang terbentuk akan sebanding dengan jumlah sel hidup (Moektiwardoyo dkk., 2018). Morfologi sel yang telah di lakukan uji toksisitas dan ditambah larutan MTT diamati di bawah mikroskop inverted pada Gambar 4.3 dan gambar pada Lampiran 8.4.. a. b. d. e. c. f. Gambar 4.3 Morfologi sel T47D setelah dilakukan uji toksisitas (a) kontrol sel; (b) kontrol pelarut DMSO konsentrasi 1000 µg/mL; (c) kontrol obat doxorubicin konsentrasi 100 µg/mL; (d) sel + ekstrak metanol daun sirsak konsentrasi 1000 µg/mL; (e) sel + esktrak etanol daun sirsak 1000 µg/mL; (f) sel + ekstrak etil asetat daun sirsak 1000 µg/mL.. Berdasarkan Gambar 4.3 (a) kontrol sel menunjukkan bahwa sel kanker hidup ditandai dengan banyaknya jarum-jarum yang menunjukkan terbentuknya kristal formazan. Penggunaan pelarut DMSO tidak menghasilkan aktivitas antikanker yang ditandai dengan tidak adanya perubahan kristal formazan pada Gambar 4.3.

35 (b). Disisi lain, Gambar 4.3 (c) kontrol obat doxorubicin konsentrasi 100 µg/mL mampu membunuh sel kanker payudara T47D yang ditandai dengan tidak adanya kristal formazan pada sel. Gambar 4.3 (d-f) merupakan sel kanker yang diberikan sampel ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 1000 µg/mL menunjukkan bahwa sampel dapat membunuh sel kanker payudara. Namun, masih ditemukan adanya kristal formazan dalam sel berbeda dengan kontrol obat yang tidak terdapat kristal formazan. Reaksi antara MTT dan sel kanker payudara T47D dapat diberhentikan dengan menambahkan SDS 10% sebagai reagen stopper yang berfungsi sebagai penghambat pembentukan kristal formazan sebelum dianalisis (Aillah, 2015) dan melisiskan membran sel (Murtiyaningsih, 2017). Membran sel yang telah lisis memudahkan kristal formazan keluar dari sel dan larut dalam SDS. Nilai IC50 dari masing-masing sampel yang ditunjukkan pada Tabel 4.3.. Tabel 4.3 Nilai IC50 uji aktivitas antikanker Sampel Ekstrak metanol daun sirsak Ekstrak etanol daun sirsak Ekstrak etil asetat daun sirsak. IC50 (µg/mL) 353,486 381,478 105,994. Berdasarkan Tabel 4.3 ekstrak etil asetat daun sirsak memiliki nilai IC50 yang rendah terhadap sel kanker payudara T47D yaitu sebesar 105,994 µg/mL. Aktivitas antikanker tersebut dimungkinkan karena adanya senyawa asetogenin yang terdapat dalam pelarut etil asetat. Hal tersebut didukung dengan spektrum hasil LC-MS/MS pada Tahap 4.6 yang menunjukkan adanya dua puncak senyawa asetogenin pada ekstrak etil asetat daun sirsak..

36 Moghadamtousi (2016) menyebutkan bahwa senyawa annonacin ditemukan pada biji, daun dan pericarp sirsak. Annonacin dapat digunakan sebagai moluskisida dan berfungsi sebagai inhibitor dari mitokondria kompleks I. Senyawa annomuricin pada daun dan pericarp sirsak bersifat toksik terhadap larva udang, sel HT-29 (sel kanker kolon), MCF-7 (sel kanker payudara) dan A549 (sel kanker paru). Asetogenin dapat membedakan antara sel normal dan sel kanker oleh karena itu, asetogenin bekerja secara selektif dalam menghambat atau membunuh sel kanker. Cara asetogenin dalam membedakan sel kanker dengan sel normal berdasarkan kebutuhan ATP (adenosine triphosphate) dari sel tersebut. Sel kanker tumbuh lebih cepat daripada sel normal sehingga membutuhkan ATP dalam jumlah yang lebih banyak (Redaksi Trubus, 2012). Asetogenin akan masuk ke dalam sel kanker dan menempel di dinding bagian dalam mitokondria. Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai tempat penghasil ATP bagi sel. Asetogenin berperan dalam menghambat produksi ATP dalam sel kanker yang dapat mengakibatkan suplai energi untuk sel kanker menjadi terhambat. Sel kanker yang kekurangan ATP akan lemah dan akhirnya mati (Alali dkk., 1999).. 4.5 Pemisahan Senyawa Asetogenin dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Sampel ekstrak etil asetat daun sirsak digunakan dalam proses pemisahan senyawa asetogenin menggunakan metode KLTP. Eluen terbaik yang digunakan pada. proses. KLTP. adalah. metanol:diklorometana. (0,5:4,5).. Pemisahan. menggunakan KLTP ini menghasilkan 12 noda yang ditunjukkan pada Tabel 4.4..

37 Tabel 4.4 Hasil KLTP ekstrak etil asetat daun sirsak Warna spot di bawah Noda Nilai Rf Warna noda lampu UV366 1 0,250 Tidak berwarna Biru 2 0,281 Tidak berwarna Merah muda 3 0,325 Hijau kebiruan Merah keoranyean 4 0,387 Abu-abu Merah muda 5 0,347 Kuning Merah keoranyean 6 0,450 Hijau Merah 7 0,475 Abu-abu Merah muda 8 0,612 Kuning Hitam 9 0,850 Tidak berwarna Biru 10 0,887 Tidak berwarna Merah muda 11 0,931 Hijau Merah 12 0,962 Kuning Merah muda *Rupprecht dkk., (1990) Keterangan: (+) mengandung senyawa asetogenin (-) tidak mengandung senyawa asetogenin. *Rf referensi + -. Berdasarkan Tabel 4.4 dapat diketahui bahwa pada noda ke-3 diduga mengandung senyawa asetogenin dengan nilai Rf sebesar 0,325 dengan warna hijau kebiruan pada sinar tampak dan berwarna oranye di bawah sinar UV366. Hal ini sesuai dengan Rupprecht dkk. (1990) bahwa Rf dengan rentang nilai 0,2-0,7 menandakan adanya senyawa acetogenin pada daun sirsak dan ketika direaksikan dengan reagen vanilin-asam sulfat yang ditandai dengan adanya perubahan warna noda menjadi oranye.. 4.6 Identifikasi Senyawa Asetogenin dengan LC-MS/MS Hasil ekstrak etil asetat daun sirsak dan hasil KLT menunjukkan adanya senyawa dugaan asetogenin pada ekstrak etil asetat. Data identifikasi tersebut didukung dengan hasil identifikasi menggunakan LC-MS/MS untuk mengetahui secara keseluruhan senyawa yang terkandung dalam sampel ekstrak etil asetat daun sirsak dan hasil isolat asetogenin asetat dun sirsak. Hasil identifikasi ekstrak etil.

38 asetat daun sirsak positif mengandung senyawa asetogenin jenis annonacin dan annomuricin. Disisi lain, isolat ekstrak etil asetat daun sirsak positif mengandung annomuricin. Senyawa annomuricin cenderung lebih polar jika dibandingkan dengan annonacin. Hal ini dapat dilihat dari waktu retensi yang dihasilkan, bahwa annomurcin menghasilkan waktu retensi sebesar 13,9 dan annonacin sebesar 16,17. Hasil ion molekuler asetogenin yang dideteksi menggunakan LC-MS/MS ditunjukkan pada Tabel 4.5 dan Lampiran 8.5.. Tabel 4.5 Ion asetogenin yang terdeteksi oleh LC-MS/MS m/z Ion Esktrak Etil Asetat Daun Sirsak Molekuler Annonacin Annomuricin + [M+Na] 619.4550 635.4496 [M+Na-112]+ 507.4200 523.4074 + [M+H] 597.4730 613.4691 [M+H-H2O]+ 579.4622 595.4574 + [M+H-2H2O] 561.4520 577.4460 + [M+H-3H2O] 543.4417 559.4357 [M+H-4H2O]+ 525.4313 541.4250. Isolat Asetogenin Annomuricin 635.4488 523.4067 613.4671 595.4561 577.4460 559.4348 541.4247. Berdasarkan Tabel 4.5 dapat diketahui bahwa ekstrak daun sirsak mengandung senyawa annonacin dan annomuricin. Senyawa annonacin ditandai dengan adanya puncak ion bermuatan pada m/z 597.4730 yang menunjukkan adanya [M+H]+. Selain itu, terdapat puncak ion tambahan pada m/z 619.4550; 507.4200; 579.4622; 561.4520; 543.4417 dan 525.4313 yang menunjukkan ion molekuler secara berturut-turut [M+Na]+, [M+Na-112]+, [M+H-H2O]+, [M+H-2H2O]+, [M+H3H2O]+ dan [M+H-4H2O]+. Ion molekuler tersebut sesuai dengan Yiallouris dkk. (2018) yang menunjukkan ion puncak annonacin pada m/z sebesar 597,63 dan.

39 puncak tambahan pada m/z sebesar 619,59; 579,64 dan 561,59. Pola fragmentasi senyawa annonacin ditunjukkan pada Lampiran 8.1. Hasil pada Tabel 4.5 menunjukkan adanya senyawa annomuricin ditandai dengan puncak ion molekuler pada [M+H]+ dengan m/z sebesar 613.4691. Terdapat puncak ion molekuler tambahan antara lain, [M+Na]+, [M+Na-112]+, [M+H-H2O]+, [M+H-2H2O]+, [M+H-3H2O]+ dan [M+H-4H2O]+ dengan nilai m/z secara berturutturut sebesar 635.4496; 523.4074; 595.4574; 577.4460; 559.4357 dan 541.4250. Pola fragmentasi senyawa annomuricin Lampiran 8.2.. 4.7 Kajian Hasil Penelitian dalam Perspektif Islam Ekstrak etil asetat daun sirsak menunjukkan adanya potensi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 sebesar 105,994 µg/mL. Oleh karena itu, penelitian ini telah membuktikan bahwa tumbuhan sirsak merupakan salah satu ciptaan Allah SWT yang bermanfaat bagi manusia sebagaimana firman Allah SWT dalam surah Luqman ayat 10.. ِ ‫السمو‬ ِ ‫ت بِغَ ِْري َع َمد تَ َرْوَنَا َوأَلْقى ِيف األَْر‬ ‫ث فِْي َها ِم ْن ُك ِل َدابَّة َوأَنْ َزلْنَا‬ َّ َ‫ض َرَو ِاس َي أَ ْن ََتِْي َد بِ ُك ْم َوب‬ َّ ‫َخلَ َق‬ ۞‫الس َم ِاء َماء فَأَنْبَ ْت نَا فِْي َها ِم ْن ُك ِل َزْوج َك ِري‬ َّ ‫ِم َن‬ “Dia menciptakan langit tanpa tiang yang kamu melihatnya dan Dia meletakkan gunung-gunung (di permukaan) bumi supaya bumi itu tidak menggoyangkan kamu dan memperkembang biakkan padanya segala macam jenis binatang. Dan Kami turunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan padanya segala macam tumbuh-tumbuhan yang baik”(Q.S. Luqman:10).. Berdasarkan tafsir Al-Misbah bahwa Allah SWT menciptakan langit yang tinggi tanpa adanya tiang. Dia meletakkan gunung yang kokoh di bumi yang.