Abstrak
Perbanyakkan bibit secara in vitro akan menghasilkan bibit dalam jumlah besar, seragam, dan bebas dari virus atau patogen dalam waktu singkat. Penggunaan thidiazuron (TDZ) dapat meningkatkan kemampuan multiplikasi tunas baik pembentukan tunas adventif maupun proliferasi tunas aksilar. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan konsentrasi TDZ yang dikombinasikan dengan BAP 0.1 mg L-1 dalam media pertumbuhan in vitro optimal untuk multiplikasi tunas mutan jeruk keprok Garut. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni sampai November 2014 di Laboratorium Kultur Jaringan 1 Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap dua faktor dengan faktor pertama adalah tiga klon jeruk keprok Garut (KG 0, KG 13 dan KG 23), faktor kedua adalah empat taraf konsentrasi TDZ yaitu 0 mg L-1, 0.1 mg L-1, 0.2 mg L-1, dan 0.3 mg L-1, setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 10 kali. Hasil penelitian yang diperoleh yaitu kombinasi zat pengatur tumbuh jenis sitokinin BAP dan TDZ pada konsentrasi BAP 0.1 mg L-1 dan TDZ 0.2 mg L-1 merupakan konsentrasi yang paling optimum dalam menginduksi tunas klon jeruk keprok Garut mutan putatif. Klon-klon eksplan jeruk keprok Garut mutan hasil radiasi sinar gamma pada dua dosis 50 Gray dan 150 Gray memberikan respon yang berbeda pada setiap konsentrasi TDZ yang ditambahkan ke media kultur. Multiplikasi tunas dengan pemarapan eksplan dalam media kultur yang mengandung TDZ dalam jangka panjang menyebabkan tunas yang muncul menjadi abnormal.
Kata kunci : multiplikasi tunas, TDZ, radiasi sinar gamma
Abstract
Seed production in vitro will produce seeds in bulk, uniform, and free of viruses or pathogens in a short time. The use of thidiazuron (TDZ) can improve both shoot multiplication of adventitious buds formation and proliferation of axillary buds. The purpose of this research is to get the concentration of TDZ combined with BAP 0.1 mg L-1 in vitro optimal growth media for shoot multiplication of mutant tangerine Garut. The research was conducted from June to November 2014 in the Tissue Culture Laboratory Department of Agronomy and Horticulture Faculty of Agriculture. The research uses a completely randomized design of two factors with the first factor is three clones keprok Garut citrus (KG 0, KG 13 and KG 23), the second factor is the concentration of TDZ four levels ie 0 mg L-1, 0.1 mg L-1, 0.2 mg L-1, and 0.3 mg L-1. and each combination treatment was repeated 10 times. Research results obtained was the combination of two type cytokines (BAP and TDZ) concentrations of 0.1 mg L-1 BAP and TDZ 0.2 mg L-1 is the most optimum concentration in inducing bud mutant clone of tangerine Garut. The explants of clones keprok Garut putative
mutant gamma radiation results in two doses (50 Gray and 150 Gray) give a different response to each concentration of TDZ were added to the culture medium. Multiplication of shoots by growing explants in culture media containing TDZ in the long term lead to bud that appears to be abnormal.
Keywords: shoot multiplication, TDZ, gamma radiation
Pendahuluan
Jeruk keprok Garut merupakan buah jeruk yang banyak diproduksi di Kabupaten Garut Jawa Barat dan telah dilepas pada tahun 1999. Jeruk keprok Garut memiliki cita rasa manis sedikit masam dan segar, dengan tingkat kemanisan berkisar antara 9.5-11.00 Brix, bentuk buah bulat, warna kulit kekuning-kuningan serta warna daging buah kuning oranye dan mudah terlepas dari kulit ari. Produktivitasnya rata-rata 40-50 kg/pohon dalam satu musim. Berdasarkan agroklimatnya varietas tersebut dapat berproduksi dan berkualitas optimum apabila dikembangkan pada wilayah dataran tinggi sekitar 700-1200 meter di atas permukaan laut (Balitbangtan 2012).
Tanaman jeruk keprok dapat diperbanyak secara generatif dan vegetatif, namun umumnya diperbanyak secara vegetatif melalui okulasi dan penyambungan (Sunarjono 2009). Namun cara ini memiliki keterbatasan yaitu jumlah bibit yang dihasilkan sedikit dan memerlukan waktu yang lama, sehingga tidak efektif untuk pemenuhan bibit dalam skla besar. Untuk itulah perbanyakkan bibit secara in vitro akan menghasilkan bibit dalam jumlah besar, seragam, dan bebas dari virus atau patogen dalam waktu singkat.
Pada perbanyakan in vitro setiap spesies, kultivar, atau varietas memberikan respon masing-masing yang berbeda terhadap komposisi media dan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh tanaman (plant growth substances) atau hormon di definisikan sebagai senyawa organik yang aktif dalam jumlah kecil yaitu antara 10-6–10-5 mM yang disintesiskan pada bagian tertentu dari tanaman dan pada umumnya diangkut ke bagian tanaman lain yang memberikan respon secara biokimia, fisiologis dan morfologis. Zat pengatur tumbuh tersebut mencakup zat- zat endogen maupun eksogen atau sintetik (Wattimena 1988).
Zat pengatur tumbuh tanaman berperan penting dalam mengontrol proses biologi dalam jaringan tanaman. Perannya antara lain mengatur kecepatan pertumbuhan dari masing-masing jaringan dan mengintegrasikan bagian-bagian tersebut guna menghasilkan bentuk atau jaringan tanaman. Aktivitas zat pengatur tumbuh di dalam pertumbuhan tergantung dari jenis, struktur kimia, konsentrasi, genotipe tanaman serta fase fisiologis tanaman (Lestari 2011).
Zat pengatur tumbuh sitokinin merupakan senyawa pengganti adenine yang meningkatkan pembelahan sel dan fungsi pengaturan pertumbuhan. Sitokinin ditemukan paling banyak didaerah meristem dan arena dengan potensi tumbuh berkesinambungan termasuk akar, daun muda, buah yang berkembang, dan biji. Sitokinin diduga diproduksi dalam akar dan ditranslokasikan ke pucuk, karena zat tersebut ditemukan dalam larutan xylem. Peran sitokinin dalam tumbuhan yaitu mengatur pembelahan sel, pembentukan organ, pembesaran sel dan organ, pencegahan kerusakan klorofil, pembentukan kloroplas, penundaan senescens,
pembukaan dan penutupan stomata, serta perkembangan mata tunas dan pucuk (Harjadi 2009). Sitokinin yang paling banyak digunakan pada kultur in vitro
adalah kinetin, benziladenin (BA), zeatin, serta 6-[γ,γ-dimethylallylamino]purine
atau 2iP. Zeatin adalah sitokinin yang disintesis secara alamiah, sedangkan kinetin dan BA adalah sitokinin sintetik.
Menurut Guo et al. (2011), bahwa disamping BA atau kinetin penggunaan thidiazuron (TDZ) dapat pula meningkatkan kemampuan multiplikasi tunas baik pembentukan tunas adventif maupun proliferasi tunas aksilar. Penambahan TDZ meningkatkan kandungan konsentrasi zat pengatur tumbuh endogen pada tanaman dikotil. TDZ mempengaruhi pembentukan purin dan metabolism sitokinin, mendorong terjadinya perubahan sitokinin ribonukleotida menjadi ribonukleosida yang secara biologi lebih aktif. Kombinasi BA atau BAP dengan TDZ bermanfaat meningkatkan kemampuan proliferasi tunas.
TDZ dilaporkan memiliki efektivitas yang tinggi pada konsentrasi rendah (nM sampai µM). Selain itu menurut Mithila et al. (2003) TDZ mampu menginduksi tunas pada proses organogenesis pada konsentrasi rendah dan pada konsentrasi tinggi mampu menginduksi embriogenesis somatik pada tanaman African violet, serta telah banyak digunakan untuk menstimulasi regenerasi dan proliferasi tunas aksilar. Menurut Victor et al. (1999) bahwa pemberian TDZ meningkatkan kandungan sitokinin endogen sehingga mampu menginduksi embriogenesis somatik kacang tanah.
Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan konsentrasi TDZ yang dikombinasikan dengan BAP 0.1 mg L-1 dalam media pertumbuhan in vitro
optimal untuk multiplikasi tunas jeruk keprok Garut mutan putatif. Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah terdapat satu konsentrasi TDZ yang dikombinasikan dengan BAP 0.1 mg L-1 dalam media pertumbuhan in vitro
optimal untuk multiplikasi tunas jeruk keprok Garut mutan putatif.
Bahan dan Metode
Penelitian multiplikasi tunas ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai November 2014 di Laboratorium Kultur Jaringan 1 Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB.
Bahan yang digunakan adalah tiga klon jeruk keprok Garut mutan putatif dan wild type (KG 0, KG 13 dan KG 23) yang diperbanyak secara in vitro
generasi M1V4. Media tanam yang digunakan untuk multiplikasi tunas adalah media MW yang ditambahkan zat pengatur tumbuh sitokinin jenis thidiazuron (TDZ) dikombinasikan dengan benziladenin purine (BAP) konsentrasi 0.1 mg L-1. Peralatan yang digunakan laminar air flow, autoclave, botol kultur, gelas beaker, gelas ukur, pinset, gunting dan peralatan tanam lainnya.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktor. Faktor pertama adalah tiga klon jeruk keprok Garut mutan putatif, dan faktor kedua adalah empat taraf konsentrasi TDZ yaitu 0 mg L-1, 0.1 mg L-1, 0.2 mg L-1, dan 0.3 mg L-1. Sehingga diperoleh 12 kombinasi perlakuan, dan setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 10 kali. Jumlah total satuan percobaan adalah sebanyak 120 unit percobaan.
Pengamatan multiplikasi tunas dilakukan seminggu sekali selama delapan minggu pada masing-masing unit percobaan. Peubah yang diamati adalah waktu inisiasi tunas, jumlah tunas, tinggi tanaman, dan jumlah daun. Data yang diperoleh dianalisis sidik ragam dengan program STAR. Apabila sidik ragam memberikan hasil yang berpengaruh nyata maka dilakukan uji lanjut DMRT pada tingkat kepercayaan 95% untuk mengetahui beda antar perlakuan.
Hasil dan Pembahasan
Multiplikasi merupakan salah satu tahapan yang perlu dilakukan dalam kultur jaringan selain inisiasi dan aklimatisasi. Salah satu faktor pendukung keberhasilan multiplikasi adalah kombinasi zat pengatur tumbuh yang ditambahkan dalam media kultur jaringan. Menurut Wattimena et al (1992), pengaruh zat pengatur tumbuh untuk suatu proses morfogenesis atau pertumbuhan dan perkembangan tanaman merupakan kerja sama dari dua atau lebih zat pengatur tumbuh. Pemilihan zat pengatur tumbuh dikaitkan dengan urutan tingkat pekerjaan kultur jaringan.
Percobaan multiplikasi tunas ini didukung dengan penggunaan media tumbuh MS vitamin MW yang diperkaya dengan 2 (dua) jenis sitokinin yang berbeda yaitu empat konsentrasi TDZ yang berbeda dikombinasikan dengan konsentrasi 0.1 mg L-1. Data peubah pengamatan yang diamati dianalisis secara statistika, namun sebelum dianalisis dilakukan transformasi data menggunakan metode transformasi Log Y+10 untuk memperkecil nilai koefisien keragaman hasil analisis ragam sehingga data yang diperoleh memiliki tingkat validitas yang baik.
Persentase jumlah eksplan yang bertunas atau efisiensi pertunasan dari setiap klon-klon yang digunakan dan taraf konsentrasi TDZ yang ditambahkan dapat dilihat pada Tabel 10.
Tabel 10. Persentase efisiensi pertunasan tiga klon jeruk keprok Garut mutan putatif pada empat taraf konsentrasi TDZ
Genotipe % Efisiensi Pertunasan
T0 T1 T2 T3 Rata-rata
KG 0 62,50 93,75 100,00 81,25 84,38
KG 13 100,00 100,00 93,75 62,50 89,06
KG 23 50,00 87,50 75,00 81,25 73,44
Rata-rata 70,83 93,75 89,58 75,00
Keterangan : T0 = BAP 0.1 mg L-1+ TDZ 0 mg L-1, T1= BAP 0.1 mg L-1+TDZ 0.1 mg L-1, T2= BAP 0.1 mg L-1+TDZ 0.2 mg L-1, T3= BAP 0.1 mg L-1+TDZ 0.3 mg L-1
Kombinasi BAP dan TDZ konsentrasi 0.1 mg L-1 memiliki rata-rata persentase efisiensi pertunasan yang paling tinggi yaitu sebesar 93.75%. Seiring peningkatan konsentrasi TDZ yang ditambahkan pada media kultur menyebabkan penurunan persentase pertunasan dari setiap klon. Klon KG 13 memiliki nilai rata- rata persentase efisiensi pertunasan tertinggi dibandingkan klon lainnya yaitu sebesar 89.06% (Tabel 10).
Proses multiplikasi tunas pada media yang ditambahkan sitokinin tunggal (BAP 3 mg L-1) ditandai dengan munculnya bintik tunas pada ketiak daun (node)
eksplan. Bintik ini terus berkembang hingga membentuk kubah yang akan membelah menjadi dua dan berkembang menjadi daun. Munculnya tunas pada perlakuan sitokinin kombinasi (BAP dan beberapa taraf TDZ) diawali dengan pembengkakan pada pangkal eksplan dan munculnya bintik tunas. Pembengkakan pangkal eksplan tidak selalu diikuti dengan pembentukan kubah yang akan tumbuh berkembang menjadi tunas baru. Pembengkakan tersebut dapat diikuti dengan pembentukan kalus baik solid maupun remah, terjadi secara tidak beraturan dan pangkal eksplan yang membengkak mengalami perubahan warna dari hijau menjadi hijau keputihan atau hijau kekuningan hingga kuning kecoklatan (ditunjukkan oleh panah merah pada Gambar 10b-d). Hal ini terjadi pada setiap klon jeruk keprok Garut mutan yang diujikan pada media yang ditambahkan ketiga konsentrasi TDZ.
Gambar 10. Multiplikasi tunas klon jeruk keprok Garut mutan putatif pada media MW perlakuan TDZ kombinasi BAP 0.1 mg L-1, a) tanpa TDZ atau kontrol, b) TDZ 0.1 mg L-1, c) TDZ 0.2 mg L-1, d) TDZ 0.3 mg L-1 Keterangan :Panah merah menunjukkan pangkal eksplan yang membengkak dan
terbentuknya kalus.
Peubah-peubah pengamatan multiplikasi tunas (waktu inisiasi tunas, jumlah tunas, dan jumlah daun per tunas) dianalisis sidik ragam dan memiliki nilai koefisien keragaman adalah berkisar antara 1.360 – 7.991. Hal ini mengindikasikan bahwa rancangan percobaan yang diterapkan pada penelitian ini menghasilkan keragaman data yang cukup rendah serta data pengamatan yang diperoleh memiliki tingkat validitas yang baik.
Secara umum kecuali peubah pengamatan tinggi tanaman menunjukkan bahwa laju multiplikasi tunas jeruk keprok Garut klon mutan putatif tidak dipengaruhi oleh interaksi antara klon dengan taraf konsentrasi TDZ yang dikombinasikan dengan BAP konsentrasi 0.1 mg L-1. Namun demikian, pengaruh tunggal dari empat taraf konsentrasi TDZ kombinasi BAP berpengaruh nyata terhadap multiplikasi tunas klon jeruk keprok Garut mutan putatif, sedangkan pada faktor klon jeruk keprok Garut mutan putatif tidak memberikan pengaruh secara nyata. Peubah pengamatan yang diamati meliputi waktu inisiasi tunas, jumlah tunas, dan jumlah daun per tunas (Tabel 11).
Waktu inisiasi tunas tiga klon jeruk keprok Garut mutan putatif (KG 0, KG 13 dan KG 23) relatif sama atau tidak berbeda secara nyata. Waktu inisiasi munculnya tunas terjadi pada umur 3-4 minggu setelah sub kultur (MSSK) atau sekitar 20-22 hari setelah sub kultur (Tabel 11). Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan klon yang terbentuk hasil induksi mutasi dengan radiasi sinar gamma pada berbagai dosis radiasi tidak berpengaruh terhadap kecepatan waktu inisiasi tunas dari setiap buku klon. Klon KG 23 yang merupakan klon hasil iradiasi sinar
gamma pada dosis 150 Gray memiliki waktu inisiasi tunas yang lebih cepat satu hari dibandingkan dengan klon kontrol atau tanpa iradiasi. Sedangkan klon KG 13 yang merupakan klon hasil iradiasi sinar gamma pada dosis 50 Gray memiliki waktu inisiasi tunas terlama yaitu sekitar 22 hari.
Perbedaan taraf konsentrasi zat pengatur tumbuh TDZ kombinasi BAP memberikan pengaruh yang cukup nyata terhadap kecepatan inisiasi tunas klon jeruk mutan. Menurut George dan Sherrington (1984) pertumbuhan dan morfogenesis eksplan dalam kultur in vitro diatur oleh keseimbangan zat pengatur tumbuh antara pada media dengan hormon endogen yang terdapat dalam eksplan. Inisiasi tunas tercepat dihasilkan oleh eksplan yang ditanam dalam media sitokinin tunggal (BAP 0.1 mg L-1)yaitu pada hari ke-13 setelah sub kultur. Dan kecepatan inisiasi tunas mengalami penurunan atau waktu munculnya tunas melambat seiring dengan terjadinya peningkatan konsentrasi TDZ dalam media MS vitamin MW. Media sub kultur yang ditambahkan sitokinin kombinasi BAP dan TDZ 0.3 mg L-1 memiliki inisiasi tunas yang paling lama yaitu 28 hari setelah sub kultur atau dua kali lebih lama dibandingkan dengan sitokinin tunggal BAP.
Jumlah tunas rata-rata yang muncul pada ketiga klon keprok Garut mutan putatif yang digunakan memberikan respon atau pengaruh yang berbeda. Klon KG 13 memiliki rata-rata jumlah tunas paling banyak yaitu 2.275 tunas, dan klon KG 23 memiliki rata-rata jumlah tunas paling rendah yaitu 1.625 tunas. Beberapa taraf konsentrasi TDZ kombinasi BAP 0.1 mg L-1 yang ditambahkan dalam media kultur tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap rata-rata jumlah tunas yang dihasilkan. Jumlah tunas terbanyak dihasilkan pada eksplan yang ditanam pada media yang ditambahkan BAP dan TDZ 0.2 mg L-1 yaitu rata-rata sebanyak 2.300 tunas, sedangkan pada kontrol atau media yang hanya diberikan BAP 0.1 mg L-1 yaitu sebanyak 1.767 tunas.
Tabel 11. Respon tiga klon jeruk keprok Garut mutan putatif terhadap empat taraf konsentrasi TDZ kombinasi BAP pada umur 10 MSSK
Perlakuan
Rata-rata waktu inisiasi tunas
(hari)
Rata-rata jumlah tunas
Rata-rata jumlah daun per tunas
(helai) Klon
KG 0 21.400a 2.000ab 2.910a
KG 13 22.025a 2.275a 3.006a
KG 23 20.300a 1.625b 2.605a
Taraf TDZ
TDZ 0 mg L-1 13.133a 1.767a 6.356a
TDZ 0.1 mg L-1 21.067b 2.033a 1.499b
TDZ 0.2 mg L-1 22.733b 2.300a 1.637b
TDZ 0.3 mg L-1 28.033c 1.767a 1.870b
Keterangan : Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf 5%. Data merupakan hasil ANOVA yang telah ditransformasi menggunakan Log Y+10 dengan nilai KK berkisar antara 1.360 – 7.991.
TDZ merupakan salah satu sitokinin sintesis turunan dari phenylurea, sitokinin tipe urea memiliki aktivitas lebih kuat dibanding tipe purin atau adenine seperti BAP (Huetteman dan Preece 1993). Kombinasi perlakuan zat pengatur
tumbuh jenis sitokinin BAP dan TDZ 0.2 mg L-1 merupakan konsentrasi yang paling optimum dalam menginduksi tunas klon jeruk keprok Garut mutan putatif, hal ini disebabkan oleh karena terjadinya sinergisme antara BAP dengan TDZ. Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Nielsen et al. (1993) bahwa media dengan penambahan dua jenis sitokinin yang berbeda menentukan jumlah dan kualitas tunas yang dihasilkan.
Pada peubah pengamatan jumlah daun per tunas eksplan tidak menunjukkan adanya interaksi pada kedua faktor. Selain itu pada peubah tunggal klon jeruk keprok Garut mutan putatif yang digunakan tidak menunjukkan adanya perbedaan yang nyata terhadap rata-rata jumlah daun per tunas. Rata-rata jumlah daun per tunas terbanyak dimiliki oleh klon KG 13 yaitu 3.006 helai dan terendah pada klon KG 23 yaitu 2.605 helai. Sedangkan pada faktor tunggal taraf konsentrasi TDZ yang diberikan pada media perlakuan terdapat perbedaan yang nyata antar perlakuan dimana jumlah daun per tunas terbanyak terjadi pada klon yang dikulturkan di media perlakuan BAP 0.1 mg L-1 tunggalyaitu rata-rata 6.356 helai. Dan peningkatan konsentrasi sitokinin jenis TDZ ke dalam media tanam menyebabkan terjadinya penurunan jumlah daun pada eksplan jeruk keprok Garut mutan putatif. Hal ini disebabkan karena perkembangan tunas menjadi daun normal pada eksplan yang ditanam pada media yang diberikan sitokinin jenis TDZ kombinasi BAP menjadi lebih lambat dibandingkan dengan yang ditanam pada media yang hanya diperkaya oleh sitokinin tunggal BAP 0.1 mg L-1 (Gambar 11). Tunas eksplan pada media TDZ kombinasi BAP mengalami pemanjangan jaringan dan lambatnya pembukaan kuncup tunas sehingga tunas eksplan yang muncul menjadi kategori abnormal pada saat akhir pengamatan yaitu minggu ke-10 MSSK.
Pada Gambar 11a terlihat bahwa eksplan ketiga klon yang diinduksi pertunasannya dengan sitokinin BAP 0.1 mg L-1 mengalami pertumbuhan tunas yang normal dimana calon tunas berkembang menjadi tunas membuka dan terjadi penambahan jumlah daun serta tinggi tanaman. Hal demikian tidak terjadi pada eksplan yang ditumbuhkan pada media yang ditambahkan TDZ pada 3 taraf konsentrasi (Gambar 11b-d).
Proses perkembangan kuncup tunas dalam membuka, mengalami pertambahan jumlah daun dan tinggi tanaman pada eksplan yang ditumbuhkan pada media yang ditambahkan sitokinin BAP kombinasi tiga konsentrasi TDZ yang berbeda lebih lambat dibandingkan pada eksplan yang dikulturkan pada media yang mengandung sitokinin tunggal BAP 0.1 mg L-1. Menurut Nielsen et al. (1995), hal ini disebabkan oleh TDZ maupun BA dapat berikatan dengan reseptor yang merupakan cytokinin binding protein (CBP). CBP memiliki dua gugus ikatan dimana satu gugus mengikat sitokinin tipe adenine dan yang lainnya mengikat sitokinin tipe phenylurea. Ikatan TDZ dengan gugus phenylurea
CBP dapat meningkatkan efek sitokinin pada pembentukan tunas dan peningkatan konsentrasi TDZ yang dapat menyebabkan toksin bagi sel tanaman.
Pada penelitian ini eksplan dikulturkan pada masing-masing media perlakuan selama empat minggu, kemudian disub kultur pada media perlakuan optimum yaitu BAP dan TDZ 0.2 mg L-1 selama empat minggu, dan disubkulturkan kembali pada media MW yang ditambahkan BAP 0.1 mg L-1 hingga akhir pengamatan yaitu pada minggu ke-10. Hal ini dilakukan dengan asumsi untuk mencegah terjadinya pencoklatan atau browning yang berakhir pada kematian
eksplan akibat menurunnya kandungan nutrisi pada media tanam. Namun yang terjadi dalam penelitian ini akibat eksplan selalu berada dalam media yang mengandung TDZ hingga delapan minggu setelah sub kultur adalah pertumbuhan tunas eksplan yang muncul menjadi tunas abnormal yaitu pemanjangan yang berlebih dan kuncup tunas lambat membuka.
Gambar 11. Pertumbuhan tunas klon jeruk keprok Garut mutan putatif pada media MW perlakuan TDZ kombinasi BAP 0.1 mg L-1, a) tanpa TDZ atau kontrol, b) TDZ 0.1 mg L-1, c) TDZ 0.2 mg L-1,d) TDZ 0.3 mg L-1 Menurut Tapan et al. (1998) bahwa eksplan yang tumbuh di media yang mengandung TDZ dalam jangka waktu panjang akan mengalami pertumbuhan yang berlebihan dan kemudian nekrosis. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Rostiana (2007) yang menyatakan bahwa penggunaan TDZ yang secara terus menerus dapat menyebabkan penurunan efek sitokinin dalam menginduksi multiplikasi tunas piretrum. Menurut Guo et al. 2011, TDZ merupakan sitokinin berbasis urea dan tidak terdegradasi oleh enzim sitokinin oksidase dalam jaringan tanaman dan menurut Nielsen et al. 1995, pengikatan TDZ pada CBP sebagai sitokinin pertama menyebabkan gugus adenine sitokinin berubah sehingga sitokinin tipe adenine tidak dapat berikatan pada gugus tersebut yang berakibat mempengaruhi aktivitas sitokinin menjadi menurun. Disarankan untuk melakukan dua kali sub kultur dalam aplikasinya yaitu inkubasi jaringan tanaman pada media TDZ untuk periode tertentu (pada umumnya 10 sampai 20 hari) kemudian dilanjutkan dengan sub kultur pada media yang tidak mengandung hormon pertumbuhan. Hal ini lebih memberikan pengaruh yang signifikan terhadap pertumbuhan pucuk dan atau embriogenesis somatik. Aplikasi induksi multiplikasi tunas melalui dua tahap sub kultur juga telah diterapkan pada
Rauvolfia tetraphylla L. (Faisal et al. 2005), dan Curcuma longa L (Prathanturarug et al. 2003). Metode aplikasi penggunaan TDZ yang dilakukan adalah eksplan dikulturkan pada media yang mengandung TDZ selama 4 minggu kemudian di sub kultur pada media tanpa TDZ atau tanpa zat pengatur tumbuh selama 8 minggu.
Tunas-tunas abnormal akibat eksplan dikulturkan dalam media yang ditambahkan empat konsentrasi TDZ kombinasi BAP secara berkepanjangan diamati jaringannya (bagian calon tunas) dibawah mikrospkop setelah disayat secara melintang dan membujur (ditunjukkan melalui Gambar 12). Penampang membujur dan melintang memperlihatkan bahwa jaringan batang eksplan yang tumbuh pada media yang ditambahkan TDZ memiliki kerapatan struktur jaringan yang lebih renggang dibandingkan pada kontrol. Susunan struktur batang yang berkembang dengan baik adalah sebagai berikut epidermis yang dilapisi kutikula, korteks yang tersusun atas parenkim-kolenkim-skelerenkim, jaringan sistem