BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Spektrofotometri UV-Visibel
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Tetapi
spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm (Dachriyanus, 2004).
Sebagai sumber cahaya biasanya digunakan lampu hidrogen atau deuterium untuk pengukuran uv dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak. Panjang gelombang dari sumber cahaya akan dibagi oleh pemisah panjang gelombang (wavelength separator) seperti prisma atau monokromator.
Spektrum didapatkan dengan cara scanning oleh wavelength separator sedangkan pengukuran kuantitatif bisa dibuat dari spektrum atau pada panjang gelombang tertentu (Dachriyanus, 2004).
Cahaya tampak hanyalah merupakan bagian kecil dari seluruh radiasi elektromagnetik. Spektrum cahaya tampak terdiri dari komponen-komponen merah, jingga, kuning, hijau, biru dan ungu, dimana masing-masing warna mempunyai panjang gelombang yang berbeda. Satuan yang banyak dipergunakan untuk menyatakan panjang gelombang adalah Angstrom, 1 A = 10-10 meter (Triyati, 1985).
Susunan peralatan Spektrofotometer ultraviolet dan sinar tampak yang meliputi bagian-bagian sebagai berikut: sumber cahaya dipergunakan untuk pengukuran absorpsi. Sumber cahaya ini harus memancarkan sinar dengan kekuatan yang cukup untuk penentuan dan pengukuran, juga harus memancarkan cahaya berkesinambungan yang berarti harus mengandung semua panjang gelombang dari daerah yang dipakai. Kekuatan sinar radiasi harus konstan selama
lampu Wolfram. Sedangkan sumber radiasi ultra-violet biasa dipergunakan lampu Hidrogen atau Deuterium yang terdiri dari tabung kaca dengan jendela dari kwartz yang mengandung Hidrogen dengan tekanan tinggi. Oleh karena kaca menyerap radiasi ultra-violet, maka sistim optik spektrofotometer ultra-violet dan sel harus dibuat dari bahan kwartz (Triyati, 1985).
Monokromator dipergunakan untuk memisahkan radiasi ke dalam komponen-komponen panjang gelombang dan dapat memisahkan bagian spektrum yang diinginkan dari lainnya (Triyati, 1985).
Sel absorpsi dipakai dari bahan silika, kuvet dan plastik banyak dipakai untuk daerah sinar tampak. Kualitas data absorban sangat tergantung pada cara pemakaian dan pemeliharaan sel. Sidik jari, lemak atau pengendapan zat pengotor pada dinding sel akan mengurangi transmisi. Jadi sel-sel itu harus bersih sekali sebelum dipakai (Triyati, 1985).
Detektor dipergunakan untuk menghasilkan signal elektrik. Dimana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap. Signal elektrik ini kemudian dialirkan ke alat pengukur. Rekorder dipergunakan untuk mencatat data hasil pengukuran dari detektor, yang dinyatakan dengan angka (Triyati, 1985).
Suatu sumber cahaya; dipancarkan melalui monokromator. Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat tertentu, yang menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi cahaya/ energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet.
Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya
yang diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka (Triyati, 1985).
Menurut Triyati (1985), dalam analisis spektrofotometri ultraviolet dan sinar tampak harus diperhatikan hal-hal sebagai berikut:
1. Kestabilan warna. Sedapat mungkin warna yang dihasilkan stabil untuk beberapa lama.
2. Reaksi warna yang spesifik. Sebaiknya dipakai reaksi warna yang spesifik untuk unsur tertentu, sehingga adanya unsur-unsur lain tidak mengganggu dan pemisahan tidak perlu dilakukan.
3. Sifat zat warna. Kalau zat warna yang terbentuk berada dalam keadaan tertutup dan segera diperiksa karena penguapan akan menyebabkan pemekatan larutan.
4. Sensitif. Sensitif yaitu dengan perubahan konsentrasi yang kecil, akan menyebabkan pemekatan larutan.
5. Larutan homogen. Larutan yang homogen akan mengabsorpsi cahaya di setiap bagian sama.
Kegunaan spektrofotometer ultra-violet dan sinar tampak dalam analisis kimia adalah untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Kelemahan Spektrofotometer ultra-violet dan sinar tampak dalam analisis kualitatif adalah kurang teliti. Hal tersebut disebabkan karena pita-pita absorpsi yang diperoleh melebar, dengan demikian kurang khusus atau terbatas pemakaiannya. Walaupun demikian, berdasarkan spektrum serapan ultra-violet dan sinar tampak, dapat dipakai untuk mengetahui ada atau tidak adanya gugus fungsional tertentu dalam senyawa organik. Alat ini dapat juga dipergunakan untuk menentukan jumlah kecil senyawa berkadar rendah yang dapat mengabsorpsi dalam media non
Menurut Triyati (1985), Pemakaian spektrofotometer ultra-violet dan sinar tampak dalam analisis kuantitatif mempunyai beberapa keuntungan:
- Dapat dipergunakan untuk banyak zat organik dan anorganik. Adakalanya beberapa zat harus diubah dulu menjadi senyawa berwarna sebelum dianalisa.
- Selektif. Pada pemilihan kondisi yang tepat dapat dicari panjang gelombang untuk zat yang dicari.
- Mempunyai ketelitian yang tinggi, dengan kesalahan relatif sebesar 1% — 3%, tetapi kesalahan ini dapat diperkecil lagi.
- Dapat dilakukan dengan cepat dan tepat.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di Laboratorium Biologi Farmasi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tanaman, pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol buah kemloko. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH dari bulan Agustus sampai bulan Oktober 2018.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil (Total Wrap), batang pengaduk, alat tanur (Nabertherm), blender (philips), cawan porselin, Hotplate (Hanna), kertas perkamen, kertas saring, klem, kondensor, koran, krus porselen, lemari pengering, lumpang, neraca analitik (Mettler Toledo), oven (Memmert), penangas air, perkolator, pipet mikro (Eppendorf; 10-100 µL), pipet mikro (Eppendorf; 100-1000 µL), pipet volume (Herma; 1 ml), pipet volume (Herma; 2 ml), pipet volume (Herma; 5 ml), rotary evaporator (Haake D), serbet, spatula, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), stamfer, statif, sudip, dan tisu.
3.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah kemloko (Phyllanthus emblica L.), air suling, etanol 96%, bahan-bahan yang berkualitas proanalisa : alfa naftol, amil alkohol, asam nitrat pekat, asam asetat
bismuth nitrat, DPPH (1.1-diphenyl-2-picryl-hydrazil), iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, raksa (II) klorida, serbuk magnesium, serbuk seng, timbal (II) asetat dan toluena.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 g natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL (Depkes RI., 1995).
3.3.2 Pereaksi besi (III) klorida 1%
Sebanyak 1 g besi (III) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL, lalu disaring (Marjoni, 2016).
3.3.3 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 mL asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 mL (Marjoni, 2016).
3.3.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut nitrat dilarutkan dalam 20 mL HNO3, kemudian dicampur dengan larutan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 mL air suling. Campuran dibiarkan sampai memisah secara sempurna. Ambil larutan jernih dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 mL (Marjoni, 2016).
3.3.5 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan sedikit demi sedikit 2 g iodium, lalu dicukupkan dengan air sulinghingga 100 mL (Depkes RI., 1995).
3.3.6 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 mL (Depkes RI., 1995).
3.3.7 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 mL asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 mL asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga volume 50 mL (Depkes RI., 1995).
3.3.8 Pereaksi Meyer
5 g kalium iodida dalam 10 mL aquadest, kemudian ditambahkan larutan 1,36 gram merkuri (II) klorida dalam 60 mL air suling. Larutan kemudian dikocok dan ditambahkan aquadest sampai 100 mL (Marjoni, 2016).
3.3.9 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 mL (Marjoni, 2016).
3.3.10 Pereaksi kloralhidrat
Larutan kloralhidrat dibuat dengan cara melarutkan kloralhidrat sebanyak 50 g dalam 20 mL air (Depkes RI., 1995).
3.3.11 Pembuatan pereaksi DPPH
Pembuatan pereaksi DPPH 0,5 mM, Sebanyak 20 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol hingga diperoleh volume larutan 100 mL (konsentrasi 200 µg/mL) (Molyneux, 2004).
3.4 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tanaman 3.4.1 Pengumpulan bahan tanaman
Pengambilan bahan tanaman dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tanaman yang sama dengan daerah lain. Bahan tanaman yang digunakan adalah buah kemloko. Bahan diambil dari Desa Simardona, Kecamatan Batang Onang, Kabupaten Padang Lawas Utara, Provinsi Sumatera Utara.
3.4.2 Identifikasi tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di Medanesse – Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi, Universitas Sumatera Utara.
Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 46.
3.4.3 Pembuatan simplisia
Buah kemloko dicuci bersih dari pengotoran dengan air mengalir sampai bersih dan ditiriskan. Kemudian dikeringkan di lemari pengering dengan suhu 400 – 500C. Buah kemloko dianggap kering apabila sudah rapuh, kemudian simplisia yang telah kering diserbuk menggunakan blender, dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
3.5 Karakterisasi Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah kemloko dengan mengamati bentuk, bau, rasa, dan warna.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah kemloko. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian dimati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar air a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 mL toluen dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 mL air suling, kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama kurang lebih 30 menit, lalu volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,1 mL.
b. Penetapan kadar air simplisia
Labu berisi toluen tersebut dimasukkan 5 g simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kemudian toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik dan setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,1 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1998).
3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL air-kloroform (2,5 mL air-kloroform dalam aquadest sampai 1 L) dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 1050C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96 % dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak
dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 1050C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus porselin bersama isinya dijarkan perlahan hingga arang habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total didihkan dengan 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, dinginkan dan ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 1995).
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dari serbuk simplisia, ekstrak etanol meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin, tanin, glikosida dan steroida/ triterpenoida.
3.6.1 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air panas, didihkan selama lebih kurang 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi
warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Marjoni, 2016).
3.6.2 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit. Didinginkan dan disaring. Filtratnya dipakai untuk percobaan sebagai berikut:
a. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning.
b. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan bewarna coklat sampai hitam.
c. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga.
Apabila terdapat endapan putih paling sedikit dengan 2 atau 3 dari pengujian diatas, maka simplisia dinyatakan positif mengandung alkaloid (Marjoni, 2016).
3.6.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Marjoni, 2016).
3.6.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 mL air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
Jika terjadi warna hijau, biru, atau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Marjoni, 2016).
3.6.5 Pemeriksaan glikosida
Menurut Depkes RI (1995), pemeriksaan glikosida yaitu sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 mL campuran etanol 95 % dengan air suling (7:3), ditambahkan asam sulfat pekat sehingga diperoleh pH 2, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Sebanyak 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran isopropanol dan kloroform (2:3), dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan dengan temperatur tidak lebih dari 50 0C. Sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol. Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut:
a. Larutan sisa dimasukkan ke dalan tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula.
b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air. Larutkan sisa dalam 5 mL asam asetat anhidrat. Tambahkan 10 tetes asam sulfat pekat, akan terjadi warna biru atau hijau, menunjukkan adanya glikosida.
3.6.6 Pemeriksaan steroida/triterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 mL n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu
menunjukkan adanya triterpenoid (Marjoni, 2016).
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan secara ekstraksi dingin yaitu dengan metode perkolasi. Keuntungan metode perkolasi : tidak membutuhkan panas, sampel selalu dialiri oleh pelarut baru, pelarut dialirkan melalui sampel sehingga proses penyarian lebih sempurna (Marjoni, 2016).
Sebanyak 600 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup, kemudian direndam dengan cairan penyari etanol selama 3 jam. Kemudian massa dimasukkan ke dalam perkolator, cairan penyari etanol dituang secukupnya sampai terdapat selapis cairan penyari di atas serbuk simplisia, kemudian mulut perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam.
Kemudian, cairan perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 tetes per detik lalu tambahkan berulang-ulang etanol sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia dan ditampung ke dalam botol berwarna bening. Perkolasi dihentikan apabila cairan perkolat terakhir diuapkan diatas penangas air tidak meninggalkan sisa(Ditjen POM Depkes RI, 1979). Penambahan pelarut dilakukan sampai perkolat sudah tidak mengandung senyawa aktif lagi. Hal ini dapat dilakukan dengan pengamatan secara visual dengan cara melihat secara fisik pada tetesan perkolat. Apabila tetesan sudah tidak berwarna, maka penambahan pelarut sudah dapat dihentikan. Sisa pelarut yang masih ada di dalam perkolator dihabiskan dan dikumpulkan dengan perkolat sebelumnya (Marjoni, 2016).Perkolat dipekatkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40oC, lalu diuapkan sisa pelarut diatas penangas air sampai diperoleh ekstrak kental kemudian disimpan di lemari pendingin (Ditjen POM
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Spektrofotometer UV-Visibel 3.8.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi radikal bebas DPPH dalam larutan metanol (sehingga terjadi perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning) dengan nilai IC50 (konsentrasi sampel uji yang memerangkap radikal bebas 50%) sebagai parameter menentukan aktivitas antioksidan sampel uji tersebut (Sapri dkk., 2013).
3.8.2 Pembuatan larutan blanko
Ditimbang sebanyak 20 mg serbuk DPPH kemudian dilarutkan dalam metanol hingga diperoleh volume larutan 100 mL (konsentrasi 200 µg/mL).
Larutan DPPH (konsentrasi 200 µg/mL) dipipet sebanyak 5 mL, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 mL, dicukupkan volumenya dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 40 µg/mL) (Sapri dkk., 2013).
3.8.3. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Larutan DPPH konsentrasi 40 µg/mL dihomogenkan dan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm (Sapri dkk., 2013).
3.8.4 Pembuatan larutan induk
3.8.4.1 Pembuatan larutan induk ekstrak etanol buah kemloko (EEBK) Sebanyak 25 mg ekstrak etanol buah kemloko (Phyllanthus emblicaL.)ditimbang kemudian dilarutkan dalam labu tentukur 25 mL dengan metanol, lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 1000 µg/mL).
3.8.4.2 Pembuatan larutan induk vitamin c
Sebanyak 25 mg serbuk vitamin c ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda (konsentrasi 500 µg/mL).
3.8.5 Pembuatan larutan uji
3.8.5.1 Pembuatan larutan uji ekstrak etanol buah kemloko (EEBK)
Ditimbang sebanyak 25 mg ekstrak etanol buah kemloko kemudian dilarutkan dalam labu tentukur 25 mL dengan metanol, lalu volumenya dicukupkan denganmetanol sampai garis tanda (konsentrasi 1000µg/mL).Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan induk (konsentrasi 1000 µg/mL)dipipet sebanyak 50µl ke dalam labu tentukur 25mL (konsentrasi 2 µg/mL; LIB II), lalu larutan LIB II dipipet 1,25mL; 2,5 mL;
3,75mL; 5 mL ke dalam labu ukur 5mL(Konsentrasi masing-masing : 0,5 µg/mL, 1µg/mL, 1,5 µg/mL, 2µg/mL). ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 1mL larutan DPPH 0.5 mM (konsentrasi 200 µg/mL) lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit pada suhu kamar, lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh.
3.8.5.2 Pembuatan larutan vitamin c
Ditimbang sebanyak 25 mg serbuk vitamin c, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 500 µg/mL). Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan induk (konsentrasi 500 µg/mL) dipipet sebanyak 20 µL; 40 µL; 60 µL; 80 µL ke dalam labu ukur 5 mL untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 2 µg/mL, 4 µg/mL, 6 µg/mL, 8 µg/mL, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 1 mL larutan DPPH 0.5 mM (konsentrasi 200 µg/mL) lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai
menggunakan spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang yang diperoleh.
3.8.5.3 Analisis persen pemerangkapan radikal bebas DPPH
Menurut Al Ridho dkk. (2013), Prinsip dari metode uji aktivitas antioksidan ini adalah pengukuran aktivitas antioksidan secara kuantitatif yaitu dengan melakukan pengukuran penangkapan radikal DPPH oleh suatu senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis sehingga dengan demikian akan diketahui nilai aktivitas peredaman radikal bebas yang dinyatakan dengan nilai IC50 (inhibitory concentration), yaitu dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Aktivitas pemerangkapan radikal bebas (%) = AKontrol − ASampel
AKontrol 𝑥 100%
Keterangan: Akontrol = Absorbansi tidak mengandung sampel Asampel = Absorbansi sampel
3.8.5.4 Analisis nilai IC50
Nilai aktivitas peredaman radikal bebas yang dinyatakan dengan nilai IC50
(inhibitory concentration) didefinisikan sebagai besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat meredam radikal bebas sebanyak 50%. Semakin kecil nilai IC50 maka aktivitas peredaman radikal bebas semakin tinggi. Prinsip kerja dari pengukuran ini adalah adanya radikal bebas stabil yaitu DPPH yang dicampurkan dengan senyawa antioksidan yang memiliki kemampuan mendonorkan hidrogen, sehingga radikal bebas dapat diredam. Koefisien y pada persamaan ini adalah sebagai IC50, sedangkan koefisien x adalah konsentrasi dari ekstrak yang akan dicari nilainya, dimana nilai dari x yang didapat merupakan besarnya konsentrasi yang diperlukan untuk dapat meredam 50% aktivitas radikal DPPH (Al Ridho
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Karakterisasi Simplisia 4.1.1 Hasil pemeriksaan makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia buah kemloko menunjukkan buah kemloko berbentuk bulat dengan diameter kira-kira 2 cm. Berwarna kuning kehijauan, berbau khas dan berasa masam (kecut) agak getir. Gambar makroskopik simplisia buah kemlokodapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 48.
4.1.2 Hasil pemeriksaan mikroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia buah kemloko menunjukkan terdapat jaringan parenkim, tetes minyak, jaringan gabus dan serat. Hasil mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 50.
4.1.3 Hasil karakterisasi simplisia buah kemloko
Hasil karakteristik simplisia buah kemloko dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 51.
Tabel 4.1 Hasil karakteristik simplisia buah kemloko (Phylanthus emblica L.)
No Pengujian Hasil Pemeriksaan (%)
1 Kadar air 8,0
2 Kadar sari larut air 23,33
3 Kadar sari larut etanol 30
4 Kadar abu total 6,66
5 Kadar abu tidak larut asam 3,33
Tabel 4.1 menunjukkan kadar air simplisia buah kemloko sebesar 8%
untukmenjaga kualitas ekstrakyaitu untukmenghindari pertumbuhan jamur dalam
untukmenjaga kualitas ekstrakyaitu untukmenghindari pertumbuhan jamur dalam