Reactive oxygen species (ROS) dan radikal lainnya terlibat dalam berbagai peristiwa biologi (mutasi, karsinogenesis, proses degenerasi, inflamasi, penuaan dan perkembangan). Reactive oxygen species dapat berperan menguntungkan dan merugikan (Kohen dan Nyska, 2002).
Radikal bebas dalam kimia diketahui sejak awal abad ke-20 dan digunakan untuk menggambarkan senyawa intermedia kimia organik dan anorganik. Daniel Gilbert dan Rebecca Gersham pada tahun 1954 mempublikasikan tentang pentingnya peranan radikal bebas ini dalam lingkungan biologis dan bertanggung jawab terhadap proses kerusakan sel. Harman Denham (1956) menyatakan bahwa
Senyawa yang dapat menerima elektron disebut oksidan atau bahan yang mengoksidasi. Bahan yang memberikan elektron disebut reduktan atau bahan yang mereduksi (Prior dan Cao, 1999). Reaksi kimia dimana suatu bahan mendapatkan elektron disebut reduksi. Oksidasi adalah suatu proses dimana suatu bahan mengalami kehilangan elektron. Jika reduktan mendonasikan elektronnya, maka menyebabkan bahan lain mengalami reduksi, dan jika oksidan menerima elektron, maka menyebabkan bahan lain mengalami oksidasi. Suatu bahan yang mereduksi bertindak sebagai donasi elektron, biasanya dengan mendonorkan hidrogen atau melepas oksigen. Suatu proses oksidasi selalu ditemani oleh proses reduksi. Pada proses reduksi biasanya terjadi kehilangan oksigen, sementara pada proses oksidasi akan mendapatkan oksigen. Reaksi ini disebut reaksi redox. Reduktan dan oksidan merupakan istilah kimia, pada lingkungan biologi disebut dengan istilah antioksidan dan prooksidan (Kohen dan Nyska, 2002).
Prooksidan disebut juga reactive oxygen species (ROS). Reactive oxygen species dibagi menjadi 2 kelompok senyawa yaitu radikal dan nonradikal. Kelompok radikal seringkali diberikan sebutan yang tidak tepat yaitu radikal bebas (istilah yang tidak akurat, karena radikal adalah selalu bebas), mengandung senyawa nitric oxide radical (NO.), superoxide ion radical (O.2-), hydroxyl radical
(OH.), peroxyl radical (ROO.) dan alkoxyl radicals (RO.), dan suatu bentuk oksigen tunggal (1O2). Spesies ini radikal karena mengandung
sekurang-karena afinitasnya mendonasikan atau mendapatkan elektron lain untuk mendapatkan stabilitas.
Molekul oksigen sendiri jika berdasarkan definisi tersebut juga dapat dikatakan radikal, karena mengandung dua elektron yang tidak berpasangan dalam dua orbit yang berbeda, sehingga dikatakan biradikal. Radikal oksigen tidak reaktif, meskipun demikian karena restriksi putaran yang tidak memungkinkan terjadinya donasi atau menerima elektron sebelum dilakukan pengaturan kembali arah putaran sekitar atom.
Kelompok senyawa nonradikal terdiri dari berbagai macam jenis bahan, dimana beberapa sangat reaktif meskipun tidak radikal perdefinisi. Senyawa-senyawa yang diproduksi dalam konsentrasi tinggi pada sel hidup adalah
hypochlorous acid (HClO), hydrogen peroxide (H2O2), organic peroxides,
aldehydes, ozon (O3), dan O2. Istilah ROS, oxygen-derived species (ODS), oksidan, reactive nitrogen species (RNS), dan pro-oxidant species sering digunakan satu sama lain untuk dalam literatur ilmiah. Radikal ditulis dalam literatur berupa superskrip titik (R.), yang membedakannya dengan metabolit oksigen reaktif lainnya. Antioksidan (reduktan atau bahan yang mereduksi) dapat diklasifikasikan sebagai senyawa yang dapat mencegah proses prooksidasi atau kerusakan oksidatif biologi. Antioksidan merupakan suatu bahan yang dalam konsentrasi rendah dapat mencegah atau memperlambat secara bermakna oksidasi
Keseimbangan antara prooksidan dan antioksidan sangat ketat dan penting untuk mempertahankan fungsi sel dan biokimia yang vital (Hrbac dan Kohen, 2000). Keseimbangan ini sering disebut sebagai potensial redox. Potensial redox ini spesifik untuk setiap organela dan tempat biologis, dan setiap gangguan pada keseimbangan ini akan menimbulkan kerusakan sel dan organisme. Perubahan keseimbangan ke arah peningkatan prooksidan di atas kapasitas antioksidan disebut stres oksidatif dan dapat menimbulkan kerusakan oksidatif. Perubahan keseimbangan ke arah peningkatan kekuatan yang mereduksi, atau antioksidan, juga akan menimbulkan kerusakan dan disebut sebagai stres reduktif (Kohen dan Nyska, 2002).
Kebanyakan spesies memiliki masa aktif yang pendek, sehingga bereaksi dengan cepat dengan molekul lainnya. Beberapa radikal turunan oksigen sangat reaktif dengan waktu paruh yang pendek, misal OH. memiliki masa aktif 10-10 detik dalam sistem biologi. Konstanta laju reaksinya (m-1s-1) untuk komponen biologi sangat tinggi (107-109 m-1s-1) dan dalam banyak kasus difusi yang terkontrol. Masa hidup radikal lain juga pendek tetapi tergantung dari media lingkungannya, misalnya waktu paruh NO. dalam larutan tersaturasi oleh udara adalah beberapa menit. Survival RO. mencapai sekitar 10-6 detik, waktu paruh ROO. adalah sekitar 17 detik.
besar terhadap waktu paruh ROS.
Toksisitas tidak berkorelasi dengan reaktifitas. Semakin panjang waktu paruh suatu spesies menunjukkan semakin toksik senyawa tersebut karena memiliki waktu yang cukup untuk berdifusi dan mencapai lokasi yang sensitif sehingga dapat berinteraksi dan menimbulkan kerusakan dalam perjalanannya dari tempat produksinya. Radikal superoksid yang memiliki waktu paruh yang relatif panjang memiliki waktu untuk berpindah lokasi dimana radikal tersebut dapat berinteraksi dengan molekul lainnya. Radikal ini dapat diproduksi dari membran mitokondria, berdifusi ke arah genome mitokondria, dan mengurangi transisi ikatan logam ke
genome. Spesies yang sangat reaktif dengan waktu paruh yang sangat pendek, seperti OH. diproduksi pada lokasi yang biasa menimbulkan kerusakan dengan berinteraksi segera dengan sekitarnya. Jika tidak terdapat target perlekatan biologi yang penting pada tempat produksinya, radikal tersebut tidak menimbulkan kerusakan oksidatif. Antioksidan harus ada pada lokasi tempat radikal diproduksi untuk mencegah interaksi antara radikal dan target biologinya sebagai kompetitor dengan radikal untuk substrat biologinya. Informasi ini harus menjadi pedoman dalam menentukan terapi antioksidan yang sesuai (Kohen dan Nyska, 2002). Paparan kontinyu dari berbagai tipe stres oksidatif dari berbagai sumber akan menimbulkan sel dan keseluruhan organisme mengembangkan suatu mekanisme pertahanan untuk melindungi dari metabolit reaktif tersebut. Mekanisme
metabolit oksigen. Salah satu enzim tersebut adalah xanthine oxidase. Sistem perbaikan yang efisien merupakan salah satu metode yang paling penting pada organisme untuk menanggulangi kerusakan oksidatif, terdiri dari enzim dan molekul-molekul kecil yang secara efisien memperbaiki tempat kerusakan oksidatif pada makromolekul. Sistem perbaikan DNA dapat mengidentifikasi
DNA-oxidized adduct (8-hydroxy-2-deoxyguanosine), thiamine glycol, dan tempat
apurinic dan apyramidenic, memindahkannya, dan menggabungkannya dengan basa yang tidak rusak. Molekul yang dapat mendonasikan atom hidrogen ke molekul yang rusak juga dapat memperbaiki senyawa, salah satu contohnya adalah donasi atom hidrogen askorbat atau tocopherol ke radikal asam lemak yang sebelumnya diserang oleh radikal dan mengalami kehilangan hidrogen. Pertahanan fisik pada tempat biologis misalnya membran juga merupakan mekanisme penting yang dapat menanggulangi sel terhadap stres oksidatif. Senyawa seperti tocopherol dapat menstabilkan membran sel, dan steric interference dapat mencegah ROS mendekati target. Antioksidan merupakan mekanisme pertahanan yang sangat penting karena kemampuannya menghilangkan secara langsung prooksidan dan memiliki efek proteksi maksimal terhadap tempat biologis. Sistem ini terbentuk melalui suatu proses evolusi, kemungkinan terhadap respon yang mengubah konsentrasi oksigen atmosfer.
Gambar 2.1 Klasifikasi mekanisme pertahanan seluler antioksidan (Kohen dan Nyska, 2002)
Sistem ini terdiri dari dua kelompok utama yaitu enzim antioksidan dan antioksidan berat molekul ringan (LMWA) (Gambar 2.1). Kelompok enzim terdiri dari direct-acting proteins, misalnya SOD. Protein dari keluarga ini berbeda dalam struktur dan kofaktornya. Cu-Zn SOD merupakan enzim dengan berat molekul sekitar 32.000, terdiri dari dua subunit, dimana salah satunya memiliki
Mekanisme perbaikan (enzim perbaikan DNA)
Mekanisme pencegahan (pencegahan produksi ROS oleh chelation logam)
Pencegahan fisik (stabilisasi lokasi biologi, steric interference)
Mekanisme pertahanan melawan stres oksidasi
Pertahanan antioksidan
Enzim antioksidan Enzim yang bereaksi langsung (SOD, katalase, peroksidase), enzim penyokong (G6PD, xanthine oxidase) Low-Molecular-Weight Antioxidants (LMWA) (scavengers) Indirect-acting LMWA Produk sampah (asam urat)
Disintesis oleh sel (dipeptide histidin, carnosine,
homocarnosine,glutathione)
Sumber bahan makanan: tokoferol, karotin, asam askorbat)
Nyska, 2002).
Tipe SOD lainnya yang ada antara lain extracellular SOD (EC-SOD) dan Fe-SOD pada tanaman. Enzim ini memiliki struktur, berat molekul dan konstanta laju reaksi yang berbeda. Aktivitas enzim itu sendiri mampu untuk meningkatkan
dismutase spontan radikal superoksida terhadap H2O2. Perubahan yang bermakna terhadap konstanta laju reaksi dari berbagai macam SOD tergantung pada pH dan tempat aktivitasnya. Produk akhir reaksi dismutase yaitu H2O2, dapat dipindahkan dengan aktivitas enzim katalase dan anggota keluarga peroxidase termasuk
glutathione peroxidase (Chance, dkk., 1979).
Katalase merupakan suatu enzim yang unik dengan KM yang sangat tinggi untuk substratnya dan dapat memindahkan H2O2 yang ada dalam konsentrasi tinggi. Enzim ini mengandung empat subunit protein, dimana masing-masingnya mengandung ion ferri dari kelompok heme yang mengalami oksidasi setelah interaksi dengan molekul pertama H2O2 untuk menghasilkan Fe+4 dalam struktur yang disebut senyawa 1. Molekul ke dua dari H2O2 berlaku sebagai donor elektron dan menghasilkan kerusakan dari dua molekul H2O2 yang terlibat untuk menghasilkan molekul oksigen. Peroksidase memiliki afinitas yang tinggi untuk memindahkan H2O2 walaupun ada dalam konsentrasi yang rendah. Donor elektron pada reaksi ini adalah molekul kecil, seperti misalnya glutathione atau askorbat (dari tanaman). Pembersihan H2O2 oleh sel merupakan suatu reaksi yang “mahal”,
membedakannya antara reaksi oleh peroxidase dan katalase.
Enzim-enzim lainnya dalam lingkungan sel mendukung aktivitas antioksidan.
Glucose-6-phosphate dehydrogenase menyediakan bahan yang mereduksi (NADPH) yang diperlukan untuk fungsi sel dan penting untuk regenerasi oxidized antioxidants. Regenerasi oxidized glutathione (GSSG) dalam bentuk tereduksi (GSH) dilakukan oleh reduced nicotinamide dinucleotide (NADH) (Chance, dkk., 1979). Beberapa enzim pendukung dapat mengeliminasi oksidan seperti misalnya xanthine dehydrogenase yang menghasilkan uric acid (antioksidan endogen yang efektif) (Gul, dkk., 2000).
Kelompok low-molecular-weight antioxidant (LMWA) terdiri dari sejumlah senyawa yang dapat mencegah kerusakan oksidatif secara langsung dan tidak langsung terhadap ROS (Kohen dan Gati, 2000). Mekanisme tidak langsung melibatkan chelation of transition metals yang mencegahnya untuk berpartisipasi dalam metal-mediated Haber-Weiss reaction (Beckman dan Koppenol, 1996). Molekul dengan aktivitas langsung memberikan turunan kimia serupa sehingga dapat memberikan elektronnya kepada radikal oksigen, sehingga dapat mengatasi radikal tersebut dan mencegahnya menyerang target biologinya. Scavengers
memiliki banyak manfaat di atas Kelompok Antioksidan enzimatik, karena
scavengers merupakan molekul kecil, sehingga dapat berpenetrasi pada membran sel dan dapat terlokasi pada jarak yang dekat dengan target biologi. Sel dapat
berkompetisi dengan target biologi pada spesies yang merusak tersebut (Kohen dan Gati, 2000). Aksi LMWA adalah sinergis dan interrelasi di antara LMWA adalah penting untuk perkembangan pedoman terapi antioksidan. Scavengers
yang berasal dari sumber endogen seperti proses biosintesis dan generasi produk sampah dari sel dan sumber eksogen dari diet. Sejumlah LMWA yang disintesis oleh sel hidup atau yang berasal dari produk sampah adalah sedikit saja (misalnya
histidine dipeptides, glutathione, uric acid, lipoic acid, dan bilirubin). Kebanyakan LMWA berasal dari sumber diet (Kohen dan Nyska, 2002).
Karakteristik scavenger adalah aktivitasnya yang bereaksi secara langsung dengan radikal dan menghilangkannya dengan memberikan elektron kepada spesies reaktif tersebut. Reaksi ini menghasilkan konversi dari scavenger itu sendiri menjadi radikal, meskipun tidak reaktif (Gambar 2.2).
Gambar 2.2 Mekanisme aktivitas scavenger (Kohen dan Nyska, 2002)
Oksidasi lebih lanjut dari scavenger
Regenerasi (kimia atau enzimatik)
kembali menjadi bentuk tereduksinya (ascorbic acid) dengan bantuan glutathione.
Ascorbic acid sendiri akan menjadi radikal, yang dapat menerima elektron dari donor lainnya, misalnya NADH. Proses regenerasi dapat merupakan murni kimiawi atau suatu enzim dapat terlibat dalam transfer elektron (Gambar 2.3). Aktivitas kooperatif ini menjelaskan sinergisitas yang didapatkan saat beberapa
scavenger terlibat dan dapat dipergunakan untuk mendapatkan manfaat dari kombinasi LMWA dalam terapi antioksidan.
Glutathione merupakan suatu massa dengan berat molekul rendah.
Glutathione merupakan suatu tripeptide yang mengandung thiol, dengan bentuk tereduksinya glutamic acid-cysteine-glycine (GSH) dan bentuk teroksidasinya berupa GSSG (dimana 2 molekul GSH bergabung melalui oksidasi grup SH dari residu cysteine untuk membentuk jembatan disulphide (Kohen dan Nyska, 2002). Glutathione terdapat pada manusia, hewan, tumbuh-tumbuhan, dan bakteri aerob dengan konsentrasi tinggi mencapai milimolar. Glutathione berlaku sebagai suatu kofaktor dari enzim peroksidase, jadi sebagai antioksidan tidak langsung mendonasikan elektron yang diperlukan untuk mendekomposisikan H2O2. Senyawa ini juga terlibat dalam berbagai jalur biokimia dan fungsi sel lainnya (Barhoumi, dkk., 1993).
Glutathione mencegah oksidasi kelompok protein -SH dan untuk transportasi copper (Gul, dkk., 2000). Glutathione dapat berlaku chelating agent untuk ion
secara langsung. Glutathione berinteraksi dengan radikal OH., ROO., dan RO.
seperti juga HCLO dan „O2 saat bereaksi dengan ROS, yang menghasilkan radikal
glutathione, sehingga dapat meregerasikannya menjadi bentuk tereduksi dari
glutathione (Gul, dkk., 2000).