Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Pengaruh Pemberian
Tepung Kedelai Kaya Isoflavon, Seng dan Vitamin E terhadap Fertilitas Tikus Jantan sebagai Hewan Model adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2009
Sussi Astuti
NRP. F261020051
SUSSI ASTUTI. The Effects of Isoflavone-riched Soybean Flour, Zinc (Zn) and Vitamin E on Fertility of Male Rats as Animal Model. Under direction of DEDDY MUCHTADI as chairman and MADE ASTAWAN, BAMBANG PURWANTARA, and TUTIK WRESDIYATI as members.
The objectives of this research were to (1) evaluate the effects of isoflavone-riched soybean flour, zinc (Zn) and vitamin E on fertility of male rats, (2) evaluate the effects of isoflavone-riched soybean flour with different levels of isoflavone on fertility of male rats.
Prior the in vivo experiment, isoflavone-riched soybean flour was defatted using n-hexane. Quantitative analysis of isoflavone on the defatted-soybean flour was conducted by HPLC, while antioxidant activity on the defatted-soybean flour was conducted by DPPH method. Total isoflavone on the defatted-soybean flour (TKI-RL) was considered as the basic concentration that used to calculate isoflavone dosages for the in vivo experiment.
Male and female weaning Sprague Dawley rats (21 days old) were used as the animal model in the experiment. On the 1st stage of the experiment, the male rats were given basic diets containing isonitrogen and isocalories with 15% of dietary protein from casein. Thirty male Sprague Dawley weaning rats (21 days old) were divided into six groups and treated with isoflavone-riched soybean flour, Zn and vitamin E in different combination. Isoflavone-riched soybean flour (3mg/day) was given by oral administration, whereas Zn and vitamin E were mixed with the basic diet. The treatment was conducted for 2 month. On the other hand, thirty female Sprague Dawley rats were only given the basic diets containing 15% of dietary protein from casein to observe the fertility of malerats. After 2 months, both male and female rats were mixed (1:1). Vagina swabs on the female rats were taken every morning to evaluate the conception rate and to detect spermatozoa by Giemsa dyes. Once the spermatozoa detected on the female rats (the 1st day of pregnancy, D1), the male rats were sacrificed by dislocation of cervical bones (dislocasio cervicalis), then all the parameters were tested. On the day 15th of pregnancy, the female rats were sacrificed (D15), the conception rates and total fetus were counted.
On the 2nd stage of the experiment, male rats were given basic diets containing isonitrogen and isocalories with 10% dietary protein from casein. Twenty five male of Sprague Dawley rats were divided into five groups and treated with isoflavone-riched soybean flour by oral administration with different levels (dosage). The treatment was conducted for 2 months. On the other hand, twenty five female Sprague Dawley rats were only given the basic diets containing 10% of dietary protein from casein for 2 months to observe the fertility of male rats. After 2 months, both male and female rats were mixed (1:1). Vagina swabs on the female rats were taken every morning to evaluate the conception rate and to detect spermatozoa by Giemsa dyes. Once the spermatozoa detected on the female rats (the 1st day of pregnancy, D1), the male rats were sacrificed by dislocation of cervical bones (dislocasio cervicalis), then all the parameters were tested. On the day 15th of pregnancy, the female rats were sacrificed (D15), the conception rates and total fetus were counted.
The data were tested by analysis of variance (ANOVA) using Completely Randomized Design (RAL) to evaluate the effects of the treatments on the tested-parameters. To observe the difference between experiments, the data were then continued for Duncan Multiple Range Test (DMRT).
indicated that total concentration of isoflavone (daidzein, genistein, and glisitein) was 2.35 g/100g dried-matter, and the IC50 was 51.96 μg/ml. The result of the 1st
stage of the experiment revealed the synergisms effects between isoflavone- riched soybean flour with Zn and vitamin E on the male rats. The effects observed were the reduction of testical MDA level, recovery of testical SOD activities, stability the content of Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) in spermatocytes and early spermatids cells of seminiferous tubules by immunohistochemical technique, increasing of sperm concentration and rate of motility, increasing of serum testosterone and total spermatogenic cells in the seminiferous tubules of testes. In general, complete treatment of isoflavone- riched soybean flour, Zn and vitamin E on male rats resulted in better fertility in comparison with single treatment and the other combination. However, combination the three components did not affect significantly on relative weight of testes, as well as to the conception rate and the number of fetus on female rats. The best fertility of male rats was on the group given isoflavone 3 mg/day, Zn 6.14 mg/kg diet and vitamin E 100 mg/kg diet.
The results of the 2nd stage of the experiment showed that the treatment of TKI-RL on the male rats given isoflavone with dosage of 0 mg/day, 1.5 mg/day, 3 mg/day, 4.5 mg/day, and 6 mg/day did not affect significantly on spermatozoa abnormality. Treatment of isoflavone 6 mg/day resulted in infertility (copulation rate and conception rate on female rats were 100% and 0%, respectively). The higher dosage of isoflavone caused the increasing of concentration of the serum testosterone and Leydig cells of the male rats. The best treatment resulted in the best fertility was on the group given isoflavone 1.5 mg/day indicated by the increasing of relative weight of testes, rate of motility, sperm concentration and total spermatogenic cells in the seminiferous tubules of testes, inhibiting the formation of lipid peroxide which was indicated by decreasing the testical MDA level, recovery of testical SOD activities, and stability the content of Cu,Zn-SOD in the spermatocyte and early spermatid cells as indicated by immunohistochemical technique.
Key words : isoflavone-riched soybean flour, Zn, vitamin E, fertility, male rats
SUSSI ASTUTI. Pengaruh Pemberian Tepung Kedelai Kaya Isoflavon, Seng dan Vitamin E terhadap Fertilitas Tikus Jantan sebagai Hewan Model. Di
bawah bimbingan DEDDY MUCHTADI sebagai Ketua Komisi, serta MADE
ASTAWAN, BAMBANG PURWANTARA, dan TUTIK WRESDIYATI sebagai Anggota Komisi.
Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengevaluasi pengaruh pemberian kombinasi tepung kedelai kaya isoflavon, Zn dan vitamin E terhadap fertilitas tikus jantan sebagai hewan model, (2) mengevaluasi pengaruh tepung kedelai kaya isoflavon pada berbagai tingkatan dosis isoflavon terhadap fertilitas tikus jantan sebagai hewan model.
Pada penelitian pendahuluan dilakukan pengurangan lemak terhadap tepung kedelai kaya isoflavon menggunakan pelarut n-heksana. Selanjutnya, dilakukan analisis kuantitatif senyawa isoflavon (HPLC) dan pengujian aktivitas antioksidan terhadap tepung kedelai kaya isoflavon rendah lemak (TKI-RL) yang diperoleh. Kandungan total isoflavon pada TKI-RL dijadikan sebagai dasar perhitungan untuk perlakuan pemberian TKI-RL sesuai dengan dosis isoflavon yang telah ditetapkan.
Uji in vivo menggunakan tikus putih jantan dan betina strain Sprague Dawley umur sapih (21 hari). Pada uji in vivo Tahap I, tikus jantan mendapat ransum basal kasein yang disusun secara isonitrogen dan isokalori dengan kadar protein ransum sebesar 15%. Tiga puluh ekor tikus jantan strain Sprague Dawley dibagi dalam enam kelompok, yaitu : (1) Kontrol negatif / K-, tanpa cekok TKI-RL, Zn dan vitamin E ; (2) Cekok aquades, tanpa TKI-RL, dengan Zn dan vitamin E (ZE); (3) Cekok TKI-RL (I); (4) Cekok TKI-RL dan Zn (IZ); (5) Cekok TKI- RL dan vitamin E (IE); dan (6) Cekok TKI-RL, Zn dan vitamin E (IZE). Tepung kedelai kaya isoflavon dengan dosis isoflavon 3 mg/ekor/hari diberikan secara oral, sedangkan Zn 6.14 mg/kg ransum dan vitamin E 100 mg/kg ransum dicampur dalam ransum basal kasein. Perlakuan diberikan selama dua bulan. Tiga puluh ekor tikus betina strain Sprague Dawley umur sapih (21 hari) diberi ransum basal kasein selama dua bulan dengan kadar protein ransum 15%, untuk mengobservasi fertilitas tikus jantan. Setelah dua bulan perlakuan, tikus jantan digabung dengan tikus betina (1:1). Setiap pagi terhadap tikus betina dilakukan usap vagina dengan pewarnaan Giemsa untuk mengetahui kondisi estrus dan mendeteksi ada tidaknya spermatozoa. Setelah terdeteksi adanya spermatozoa pada vagina tikus betina (dihitung sebagai H1 kebuntingan), tikus jantan dikorbankan dengan dipatahkan tulang leher (dislocasio cervicalis), kemudian dilakukan pengamatan terhadap berbagai parameter yang diuji. Tikus betina dikorbankan pada umur kebuntingan 15 hari (H15) untuk pengamatan terhadap angka konsepsi dan jumlah fetus.
Pada uji in vivo Tahap II, tikus jantan mendapat ransum basal kasein yang disusun secara isonitrogen dan isokalori dengan kadar protein ransum sebesar 10%. Dua puluh lima ekor tikus jantan strain Sprague Dawley dibagi dalam lima kelompok, yaitu : (1) Kontrol, cekok aquades; (2) Cekok TKI-RL dosis isoflavon (IF) 1.5 mg/ekor/hari; (3) Cekok TKI-RL dosis IF 3 mg/ekor/hari; (4) Cekok TKI-RL dosis IF 4.5 mg/ekor/hari; dan (5) Cekok TKI-RL dosis IF 6 mg/ekor/hari. Tepung kedelai kaya isoflavon diberikan secara oral. Perlakuan diberikan selama dua bulan. Dua puluh lima ekor tikus betina strain Sprague Dawley umur sapih (21 hari) diberi ransum basal kasein selama dua bulan
Setelah dua bulan perlakuan, tikus jantan digabung dengan tikus betina (1:1). Setiap pagi terhadap tikus betina dilakukan usap vagina dengan pewarnaan Giemsa untuk mengetahui kondisi estrus dan mendeteksi ada tidaknya spermatozoa. Setelah terdeteksi adanya spermatozoa pada vagina tikus betina (dihitung sebagai H1 kebuntingan), tikus jantan dikorbankan dengan dipatahkan tulang leher (dislocasio cervicalis), kemudian dilakukan pengamatan terhadap berbagai parameter yang diuji. Tikus betina dikorbankan pada umur kebuntingan 15 hari (H15) untuk pengamatan terhadap angka konsepsi dan jumlah fetus.
Data diolah dengan sidik ragam menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap parameter yang diuji. Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan, data yang menunjukkan pengaruh nyata selanjutnya diuji dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT).
Hasil analisis kuantitatif senyawa isoflavon pada TKI-RL dengan HPLC menunjukkan kadar total isoflavon (daidzein, genistein, dan glisitein) sebesar 2.35g/100g(bk), sedangkan nilai IC50 TKI-RL sebesar 51.96 μg/ml. Hasil uji in
vivo Tahap I menunjukkan bahwa terjadi interaksi secara sinergis antara tepung kedelai kaya isoflavon, Zn dan vitamin E pada tikus jantan yang menyebabkan : menurunnya kadar MDA testis, aktivitas SOD testis dipertahankan tetap tinggi, kandungan Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn- SOD) tubuli seminiferi testis pada sel spermatosit dan spermatid awal melalui deteksi secara imunohistokimia dipertahankan tetap tinggi; meningkatnya motilitas spermatozoa, konsentrasi spermatozoa, kadar hormon testostreron serum, serta jumlah sel spermatogenik pada tubuli seminiferi testis.
Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon, Zn dan vitamin E pada tikus jantan secara lengkap memberikan fertilitas yang paling baik dibanding pemberian tunggal atau dua kombinasi diantaranya. Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon, Zn dan vitamin E pada tikus jantan tidak berpengaruh terhadap berat testis, serta angka kebuntingan dan jumlah fetus pada tikus betina. Perlakuan yang menunjukkan fertilitas tikus jantan terbaik adalah pemberian secara lengkap : tepung kedelai kaya isoflavon dengan dosis isoflavon 3 mg/ekor/hari, Zn 6.14 mg/kg ransum, dan vitamin E 100 mg/kg ransum, yang menghasilkanberat testis relatif 0.55±0.03%, motilitas spermatozoa 79.5±1.12%, konsentrasi spermatozoa 1636.90 ±87.95 juta/ml, abnormalitas spermatozoa 9.00±0.70%, serta kadar hormon testosteron serum 3.49±0.31 ng/ml. Hasil pengamatan terhadap sel spermatogenik menghasilkan : jumlah sel spermatogonia, spermatosit, spermatid awal, spermatid akhir dan total sel spermatogenik masing-masing sebesar 37.56±4.48, 67±4.72, 287.11±31.75, 227.22±29.78, dan 618.89±47.38. Pengukuran terhadap kadar MDA testis sebesar 1.89± 0.06 nmol/g, sedangkan aktivitas SOD testis sebesar 882.4±19.24 U/g. Profil Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) tubuli seminiferi testis pada sel spermatosit dan spermatid awal yaitu positif kuat (+++) sebesar 194.78±15.79, positif sedang/ lemah (++/+) 115.22±9.24 dan negatif (-) 41.89±7.44. Angka konsepsi dan jumlah fetus pada tikus betina masing- masing sebesar 100% dan 11±0.71 ekor.
Hasil penelitian uji in vivo Tahap II menunjukkan bahwa pemberian TKI- RL pada tikus jantan dengan dosis isoflavon 0 mg/ekor/hari, 1.5 mg/ekor/hari, 3 mg/ekor/hari, 4.5 mg/ekor/hari dan 6 mg/ekor/hari tidak berpengaruh terhadap abnormalitas spermatozoa. Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon pada dosis isoflavon 6 mg/ekor/hari pada tikus jantan menyebabkan kasus infertilitas, namun tidak mempengaruhi libido (Angka kopulasi pada tikus betina sebesar 100%, namun angka konsepsi sebesar 0%). Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon
hormon testosteron serum dan jumlah sel Leydig pada tikus jantan.
Perlakuan yang menunjukkan fertilitas tikus jantan terbaik adalah pemberian tepung kedelai kaya isoflavon pada dosis isoflavon 1.5 mg/ekor/hari, yang mengakibatkan : meningkatnya beberapa parameter seperti berat testis, motilitas spermatozoa, konsentrasi spermatozoa, dan jumlah sel spermatogenik pada tubuli seminiferi testis; terhambatnya pembentukan peroksidasi lipid yang diperlihatkan dengan menurunnya kadar MDA testis; aktivitas enzim SOD testis dipertahankan tetap tinggi; kandungan Cu,Zn-SOD tubuli seminiferi testis pada sel spermatosit dan spermatid awal melalui deteksi secara imunohistokimia dipertahankan tetap tinggi.
Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon dengan dosis isoflavon 1.5 mg/ekor/hari menghasilkan : berat relatif testis 0.5894±0.03%, motilitas spermatozoa 77.5±2.50%, konsentrasi spermatozoa 1393.75±30.62 juta/ml, abnormalitas spermatozoa 8.99±1.29, butiran sitoplasma 8.92±1.08%, kadar hormon testosteron serum 2.96±0.45 ng/ml; jumlah sel Leydig 70.22±9.34; jumlah sel spermatogonia, spermatosit, spermatid primer, spermatid sekunder dan total sel spermatogenik masing-masing sebesar 48.44±4.82, 60.00±3.43, 221.56± 16.12, 164.33±17.94, dan 494.33±32.94; kadar MDA testis 2.29±0.05 nmol/g serta aktivitas enzim SOD testis 729.4±23.73 U/g. Profil Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) tubuli seminiferi testis pada sel spermatosit dan spermatid awal yaitu, positif kuat (+++) sebesar 166.78±6.92, positif sedang/ lemah (++/+) 85.22±9.24 dan negatif (-) 32.33±5.27. Angka konsepsi dan jumlah fetus pada tikus betina masing-masing sebesar 100% dan 10.2±0.45 ekor.
Kata kunci : tepung kedelai kaya isoflavon, seng (Zn), vitamin E, fertilitas, tikus jantan
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.