BAB III. METODE PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Determinasi dilakukan dengan mencocokkan kesamaan ciri-ciri buah pisang ambon dengan ciri-ciri yang ada pada website www.plantamor.com.
2. Pengumpulan Bahan
Buah pisang ambon (Musa paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.) yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah yang masih segar dan masih setengah matang (waktu panen 4 bulan) yang berasal dari tanaman Musa paradisiaca var.
sapientum (L.) Kunt. dari pasar Pakem Yogyakarta.
3. Pembuatan Jus Buah Pisang Ambon (Musa paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.)
Satu buah pisang ambon setengah matang (100 gram) dibuang kulitnya, kemudian dipotong kecil-kecil. Jus buah pisang ambon dibuat dengan jus ekstraktor sehingga didapatkan sari buah pisang ambon (40 ml). Sari buah pisang ambon yang didapat adalah konsentrasi 100% (tanpa pengenceran).
4. Perhitungan Dosis Pemberian Jus Buah Pisang Ambon (Musa paradisiaca
var. sapientum (L.) Kunt.)
Buah pisang ambon dijus menggunakan jus ekstraktor. Hasil sari buah pisang yang didapat ditentukan peringkat dosis berdasarkan volume maksimal yang dapat diberikan untuk tikus dan menjadi dosis yang tertinggi yaitu 5 ml. Penentuan dosis jus pisang ambon (Musa paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.) adalah 5 ml/kgBB (dosis I); 10 ml/kgBB (dosis II); dan 20 ml/kgBB (dosis III).
5. Preparasi Bahan
a. Pembuatan larutan stok glukosa p.a. 15,0 % b/v. Glukosa monohidrat p.a. ditimbang sebanyak 3,75 gram dan dilarutkan dengan aquadest panas dalam labu takar 25,0 ml sampai tanda.
b. Pembuatan larutan CMC 1% b/v. CMC ditimbang sebanyak 1 gram dan dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 100 ml sampai tanda.
c. Penentuan dosis Glibenklamida. Dosis Glibenklamida yaitu 5 mg pada manusia dengan berat badan 50 kg.
Untuk manusia 70 kg :
= = 7 mg dikonversikan ke tikus 200 gram dengan faktor konversi 0,018.
7 mg glibenklamida x 0,018 = 0,126 mg/ 200 gram
= 0,64 mg glibenklamida/kgBB
Berdasarkan perhitungan maka besarnya dosis glibenklamida pada hewan uji tikus yaitu 0,64 mg/kgBB.
d. Penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida. Penentuan keseragaman bobot kaplet glibenklamida mengacu pada Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI (1979). Timbang 20 tablet, hitung bobot tablet. Saat ditimbang satu-satu, tidak boleh lebih dari 2 tablet yang masing-masing bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari harga yang ditetapkan kolom A, dan tidak satu tabletpun menyimpang dari bobot rata-ratanya lebih dari harga yang ditetapkan kolom B. Nilai penyimpangan bobot rata-rata kolom A dan B dapat dilihat pada Tabel VII:
Tabel VII.Keseragaman Bobot Tablet
Bobot rata-rata Penyimpangan bobot
rata-rata dalam % A B 25 mg atau kurang 15% 30% 26 mg sampai dengan 150 mg 10% 20% 151 mg sampai dengan 300 mg 7,5% 15% Lebih dari 300 mg 5% 20%
(Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979). e. Pembuatan larutan glibenklamida 0,1125 mg/ml
Timbang serbuk glibenklamida setara dengan 25 mg glibenklamida murni, larutkan dengan CMC 1% dalam labu takar 10 ml sampai tanda sebagai larutan induk glibenklamida. Buat dengan konsentrasi 0,1125 mg/ml yaitu mengambil 0,45 ml larutan induk add aquadest dalam labu ukur 10 ml hingga tanda. Perhitungan volumenya yaitu:
C1 = 25 mg/10 ml = 2,5 mg/ml ; C2 = 0,1125 mg/ml 2,5 mg/ml x V1 = 10,0 ml x 0,1125 mg/ml
6. Percobaan Pendahuluan
1) Penetapan waktu pemberian Glibenklamida
Tujuan dari penetapan pemberian Glibenklamida adalah untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek hipoglikemik Glibenklamida, agar pada saat Uji Toleransi Glukosa Oral (UTGO), Glibenklamida sudah memberikan efek penurunan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan enam ekor tikus yang terbagi dalam 3 kelompok. Perlakuan tersebut dilakukan terhadap masing-masing kelompok yaitu pada menit ke-15 sebelum UTGO untuk kelompok kesatu, menit ke-30 sebelum UTGO untuk kelompok kedua, dan menit ke-45 sebelum UTGO untuk kelompok ketiga. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0% b/v; 1,75 g/kgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 dan 240. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDKK0-240.
2) Orientasi dosis pemberian jus buah pisang ambon (Musa paradisiaca var.
sapientum (L.) Kunt.)
Konsentrasi jus buah pisang ambon yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah konsentrasi maksimal jus buah pisang ambon yang dapat dipejankan pada tikus jantan melalui jalur oral. Berdasarkan orientasi yang
dilakukan jus buah pisang ambon dengan konsentrasi 100% sudah dapat dipejankan pada tikus jantan melalui jarum oral.
7. Tahap Percobaan
1) Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Penelitian ini mengikuti rancangan acak lengkap pola searah, yaitu dua puluh lima ekor tikus dibagi secara acak menjadi 5 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor. Tiap hewan uji diadaptasikan dengan kondisi yang sama, jauh dari kebisingan dan dihindarkan dari stress. Sebelum mendapat perlakuan, masing masing kelompok dipuasakan selama 10-16 jam dengan tetap diberi minum ad libitum, lalu diberi perlakuan sebagai berikut:
1) Kelompok I yaitu pemberian CMC 1% 20 ml/kgBB (kontrol negatif) 2) Kelompok II yaitu pemberian suspensi Glibenklamida 0,64 mg/kgBB
(kontrol positif)
3) Kelompok III yaitu pemberian dosis I yaitu 5 ml/kgBB jus buah Musa
paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.
4) Kelompok IV yaitu pemberian dosis II yaitu 10 ml/kgBB jus buah
Musa paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.
5) Kelompok V yaitu pemberian dosis III 20 ml/kgBB jus buah Musa
paradisiaca var. sapientum (L.) Kunt.
Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO 30 menit setelah perlakuan dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0% b/v; 1,75 g/kgBB . Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat
sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK0-240.
2) Penetapan kadar glukosa darah
Kadar glukosa darah ditetapkan dengan metode GOD-PAP. Pada tiap kelompok dilakukan pengambilan cuplikan darah sebanyak 0,5 ml melalui vena lateralis ekor dan ditampung dalam microtube yang berisi 3 tetes heparin. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 dan 240 setelah UTGO. Kemudian darah geoxalated ini dipusingkan 3000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya diambil 0,01 ml plasma darah, kemudian dilakukan pengukuran seperti dalam Tabel VIII.
Tabel VIII.Volume Pengukuran Kadar Glukosa Darah
Bahan Sampel (ml) Standar (ml) Blangko (ml)
Supernatan 0,01 - - Larutan baku glukosa - 0,01 -
Pereaksi GOD-PAP 1 1 1
Bahan-bahan tersebut dicampur dan diinkubasi selama operating
time. Kemudian kadar glukosa darah ditetapkan dengan alat microvitalab
menggunakan metode GOD-PAP. Kadar glukosa dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran kadar glukosa dilakukan di laboratorium Fisiologi-Biokimia Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.
Selanjutnya dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke 240 dengan metode trapezoid
0-240) dan rumus yang digunakan adalah sebagai berikut: (LDDK = − 2 × + + − 2 × + + − 2 × + + − 2 × + Keterangan: t = waktu (jam-1/menit-1) C = konsentrasi zat dalam darah (mg/ml)
LDDKto-tn = luas daerah di bawah kurva dari waktu ke-0 sampai ke-n