METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Karakterisasi minyak atsiri serai wangi Jawa (Citronella Java Oil)
a. Pemeriksaan organoleptis. Pemeriksaan organoleptis yaitu meliputi pemeriksaan warna dan bentuk minyak atsiri.
b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak atsiri. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan piknometer. Piknometer dibersihkan dengan menggunakan etanol 70% dan kemudian dikeringkan dengan diberi udara kering. Bagian luar piknometer diseka dengan kain kering. Piknometer didiamkan selama 30 menit lalu ditimbang. Kemudian piknometer diisi dengan menggunakan air suling suhu 25oC, lalu mengkondisikannya pada suhu ± 0,2oC dibawah 25oC selama 30 menit. Selanjutnya dibiarkan selama 30 menit lagi hingga suhu 30oC dan timbang. Hasil timbangan dicatat. Piknometer kemudian dikosongkan dan dicuci dengan etanol 70% lalu dikeringkan dengan diberi udara kering. Kemudian diisi dengan minyak atsiri yang bersuhu 25oC dan mengkondisikannya pada suhu ± 0,2oC dibawah 25oC selama 30 menit. Dibiarkan selama 30 menit lagi hingga suhu 30oC. Lalu piknometer ditimbang. Menghitung bobot jenis minyak atsiri serai wangi. Dilakukan sebanyak tiga kali replikasi.
c. Pengukuran indeks bias minyak atsiri. Pengukuran dengan menggunakan alat hand refractometer. Skala diatur 1, 2, atau 3, jarak jangkau dari skala itu yaitu : “1” :1,333-1,404 (skala sebelah kiri); “2” : 1,404-1,468 (skala tengah); “3” : 1,468-1,520 (skala sebelah kanan). Ujung refraktometer setelah prisma ditetesi dengan minyak atsiri diarahkan ke cahaya dan dilihat melalui lensa dengan memutar skala sampai terlihat garis batas gelap dan terang dengan jelas.
Kalibrasi yang ditunjukkan oleh garis batas tersebut memperlihatkan nilai dari indeks bias.
2. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi Jawa (Citronella Java Oil)
terhadap Porphyromonas gingivalis dengan metode difusi sumuran
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi dengan metode sumuran dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut :
a. Pembuatan larutan uji. Minyak atsiri serai wangi Jawa (Citronella Java Oil) dibuat berbagai variasi pengenceran dengan cara dilarutkan dalam parafin cair. Variasi konsentrasi pengenceran yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% dan 10%.
b. Pembuatan stok bakteri. Diambil 1-3 ose dari bakteri Porphyromonas gingivalis yang telah dibiakkan, kemudian diinokulasikan pada TSA yang sudah berada di cawan petri secara streak plate dan diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC di inkubator CO2. Tahap ini digunakan sebagai stok bakteri untuk tahap selanjutnya.
c. Pembuatan suspensi bakteri. Diambil 1-3 ose stok bakteri Porphyromonas gingivalis, diinokulasikan ke dalam 5 mL NaCl 0,9% dan divortex supaya tercampur homogen lalu ditunggu selama beberapa saat. Setelah itu suspensi bakteri uji disetarakan dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/mL atau diukur dengan menggunakan alat densichek hingga konsentrasinya sama dengan larutan standar Mc Farland II.
d. Pembuatan kontrol media. Media TSA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat, kemudian diinkubasi di inkubator CO2 pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu, diamati apakah terdapat bakteri yang tumbuh atau tidak.
e. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji. Media TSA yang telah bersuhu 45-55oC setelah disterilkan, kemudian ditambahkan suspensi bakteri uji Porphyromonas gingivalis dengan kepadatan sesuai dengan standar Mc Farland II lalu dituang ke dalam cawan petri dan digoyang supaya bakteri tersebar merata. Kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu, diamati pertumbuhan bakteri dan dibandingkan dengan perlakuan.
f. Uji daya antibakteri minyak atsiri serai wangi Jawa terhadap Prophyromonas gingivalis dengan difusi sumuran. 30 mL TSA yang telah disiapkan kemudian ditambahkan 1 mL suspensi bakteri, lalu dituang ke dalam cawan petri secara pour plate, digoyang, dan dibiarkan memadat. Setelah memadat, media tersebut dilubangi hingga dasar cawan petri menggunakan pelubang sumuran 6 mm. Lubang tersebut kemudian diberi 30 µL media dan dibiarkan hingga memadat. Lalu lubang-lubang sumuran ini diisi dengan berbagai variasi konsentrasi, kontrol negatif (parafin cair), dan kontrol positif (klorheksidin 0,2%) dengan volume masing-masing sebanyak 50 µL. Kemudian diinkubasikan pada inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 48 jam lalu diamati dan diukur zona jernih yang dihasilkan.
3. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri serai wangi Jawa (Citronella
Java Oil) terhadap Porphyromonas gingivalis dengan metode dilusi padat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Penentuan KHM dan KBM minyak atsiri serai wangi Jawa dengan metode dilusi padat dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut :
a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat. Diambil 1 mL larutan uji kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri secara bersamaan dengan TSA yang telah ditambah dengan suspensi bakteri secara pour plate. Kemudian cawan petri digoyang hingga larutan uji merata di seluruh bagian media. Perlu juga dilakukan pembuatan kontrol negatif, kontrol positif, kontrol tumbuh, dan kontrol media sebagai pembanding. Pembuatan kontrol media yaitu dengan menuang media TSA tanpa ada suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol tumbuh yaitu dengan menuang media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol positif yaitu dengan menuang 1 mL kontrol positif (klorheksidin 0,2%) bersama dengan media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Pembuatan kontrol negatif yaitu dengan menuang 1 mL parafin cair bersama dengan media TSA yang telah diberi tambahan suspensi bakteri secara pour plate di cawan petri. Kemudian semuanya diinkubasi pada inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 48 jam dan dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan kontrol pertumbuhan. Semakin keruh maka diberi tanda (+) lebih banyak dibandingkan dengan yang jernih.
b. Penentuan nilai KHM dan KBM. Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan melakukan streak plate dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Hasil uji yang digunakan adalah semua media yang memberikan kejernihan media secara visual. Konsentrasi terendah hasil streak plate yang sudah tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri maka ditentukan sebagai KBM, dan konsentrasi terkecil yang dapat menghambat bakteri ditandai dengan bakteri masih dapat tumbuh pada hasil streak plate ditentukan sebagai KHM.
4. Identifikasi komponen minyak atsiri serai wangi Jawa (Citronella Java
Oil) menggunakan GC-MS
Identifikasi minyak atsiri serai wangi dilakukan Jawa di Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM Yogyakarta dengan menggunakan GC-MS - QP2010S (Shimadzu). Minyak atsiri serai wangi tanpa menggunakan pelarut dianalisis secara GC-MS dengan kondisi analisis yaitu jenis kolom Rastek stabilwak R-DA dengan diameter 0,25 mm dan panjang 30 meter, suhu injektor 215oC, gas pembawa helium, kecepatan alir fase gerak 0,9 mL/menit, dan tekanan 49,5 kPa. Suhu kolom diprogram 60oC selama 5 menit kemudian dinaikkan perlahan-lahan dengan kecepatan 4oC/menit hingga suhu mencapai 215oC dan ditahan selama 30 menit. Identifikasi komponen-komponen minyak atsiri serai wangi yaitu dengan cara membandingkan spektrum massa sampel dengan spektrum massa yang terdapat dalam data library yang memiliki tingkat kemiripan yang paling tinggi.
