BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman krokot belanda dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu, kabupaten Karang Anyar, Jawa Tengah. 2. Pengumpulan bahan
Akar tanaman krokot belanda diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu, kabupaten Karang Anyar, Jawa Tengah. Akar krokot belanda yang diperoleh berupa serbuk kering.
3. Pembuatan ekstrak etanol akar krokot belanda
Metode pembuatan ekstrak ini adalah dengan metode perkolasi. Serbuk akar krokot belanda sebanyak 150 serbuk dimasukkan ke dalam perkolator, kemudian direndam dengan etanol 70% sampai mencapai ketinggian 1,5 cm diatas permukaan serbuk selama 24 jam. Keran perkolator dibuka dengan kecepatan alir 20 tetes per menit. Selama proses perkolasi berlangsung tinggi etanol diatas permukaan serbuk harus tetap 1-1,5 cm. Perkolat ditampung dalam erlenmeyer. Ekstraksi dihentikan jika perkolat yang keluar berwarna bening. Pengentalan perkolat dilakukan dengan bantuan rotary evaporator dan waterbath. Ekstrak pekat kemudian disimpan di dalam lemari pendingin (kulkas).
4. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian adalah mencit betina, galur Swiss, usia 2-3 bulan, dengan berat badan 20-30 gram. Hewan uji dibagi secara acak menjadi 2 kelompok. Kelompok untuk orientasi sebanyak 40 ekor dan kelompok perlakuan sebanyak 63 ekor. Sebelum digunakan, mencit dipuasakan 18-24 jam dan tetap diberi minum. Kelompok perlakuan terdiri dari 9 kelompok yaitu kontrol negatif karagenin 1 %, kontrol negatif CMC-Na 1%, kontrol positif natrium diklofenak dalam 3 peringkat dosis (9,75; 10,795; dan 11,95 mg/kg BB) dan kelompok perlakuan ekstrak etanol akar krokot belanda dalam 4 peringkat dosis (1674,49; 2411,26; 3472,22; dan 5000 mg/kgBB).
5. Pembuatan suspensi karagenin 1%
Timbang 100 mg karagenin, larutkan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% dalam labu takar 10 ml.
6. Pembuatan CMC-Na 1%
Larutan CMC-Na 1% dibuat dengan cara menimbang secara seksama CMC-Na sebanyak 1 gram kemudian dilarutkan ke dalam sejumlah air panas sambil terus diaduk-aduk sampai semuanya terlarut dan menjadi jernih. Larutan dituang ke dalam labu ukur 100 ml dan tambahkan air panas sampai diperoleh volume 100 ml.
7. Pembuatan larutan natrium diklofenak
Timbang seksama sejumlah natrium diklofenak dan dilarutkan dalam CMC-Na 1% sampai diperoleh konsentrasi 0,5%. CMC-Na 1% dalam kondisi masih hangat sangat membantu kelarutan natrium diklofenak.
8. Pembuatan suspensi ekstrak etanol akar krokot belanda
Timbang ekstrak etanol akar krokot belanda dan suspensikan ke dalam larutan CMC-Na sampai diperoleh konsentrasi tertentu berdasarkan orientasi 9. Penetapan dosis
a. karagenin 1 %
Dosis karagenin ditetapkan berdasarkan penelitian Williamson, Okpako, dan Evans (1996) dengan konsentrasi karagenin yang digunakan adalah 1% dengan volume 0,05 ml. 0,05 ml karagenin 1% adalah volume pemberian untuk mencit dengan berat 20 gram sehingga dosis bisa dicari dengan cara :
Dosis karagenin = kgBB ml mg ml 02 , 0 10 / 100 05 , 0 × = 25 mg/kg BB b. Natrium Diklofenak
Dosis natrium diklofenak yang digunakan sebagai dosis orientasi adalah 9,75 mg/kg BB; 10,795 mg/kg BB; 11, 95 mg/kg BB. Dosis ini diperoleh berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Novita (2003).
Dosis I : untuk manusia 70 kgBB = 75 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 75 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,195 mg/20 gBB
= 9,75 mg/kgBB Dosis II : untuk manusia 70 kgBB = 83,0385 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 83,0385 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,2195 mg/20 gBB
= 10,795 mg/kgBB Dosis III: untuk manusia 70 kgBB = 91,923 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 91,923 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,239 mg/20 gBB
= 11,95 mg/kgBB c. CMC 1%
Sebagai kontrol negatif CMC 1% diberikan secara per oral, dan volume pemberian maksimal pada mencit adalah 1 ml, diketahui berat mencit maksimal dalam penelitian ini adalah 30 g sehingga bisa dihitung dengan rumus: V ml = ml mg C kg BB X kgBB mg D / / 1 ml = ml mg kg X kgBB mg D / 10 03 , 0 / D = 333,3 mg/kg BB dan V = {33,3 x BB kg} ml d. ekstrak etanol akar krokot belanda
Dosis tertinggi ekstrak etanol akar krokot belanda ditetapkan berdasarkan konsentrasi maksimal yang diperoleh saat orientasi sebesar 15%.
Penetapan dosis tertinggi ekstrak etanol akar krokot belanda sesuai rumus : V (ml)x C (mg/ml) = BB (kg) x D (mg/kg)
Volume pemberian x Konsentrasi = Berat badan x Dosis 1 ml x 150 mg/ml = 0,03 kgBB x Dosis Dosis = kgBB ml ml mg 03 , 0 1 / 150 × = 5000 mg/kgBB
Sesuai orientasi, dosis terendah yang masih dapat memberikan efek anti inflamasi adalah 1666,67 mg/kgBB. Dari dosis terendah dan tertinggi
kemudian dicari peningkatannya untuk menentukan dosis tengah melalui rumus : Peningkatan = 1 terendah tertinggi − n dosis dosis Peningkatan = 4 1 kgBB 1666,67mg/ B 5000mg/kgB − = 1,44 Keterangan :
n = jumlah peringkat dosis
Tiga dosis dibawah dosis tertinggi diperoleh dengan membagi dosis 1,44 kali dari dosis tertinggi sesuai deret ukur. Dari hasil perhitungan diperoleh dosis ekstrak etanol akar krokot belanda sebesar 1674,49 mg/kgBB; 2411,26 mg/kgBB; 3472,22 mg/kgBB; 5000 mg/kgBB.
10. Uji pendahuluan rentang waktu pemotongan kaki setelah injeksi suspensi karagenin 1%
Hewan uji sebanyak dua puluh ekor dibagi dalam 4 kelompok, tiap kelompok terdiri dari lima ekor. Pada kaki kiri bagian belakang hewan uji diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% secara subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang disuntik dengan spuit injeksi subplantar tanpa suspensi karagenin 1%. Kemudian tiap kelompok hewan uji dikorbankan pada selang waktu tertentu yaitu : 1, 2, 3, dan 4 jam setelah injeksi karagenin subplantar, lalu kedua kaki belakang dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang. Waktu pemotongan kaki ditentukan saat kaki mengalami peningkatan udema yang berarti.
11. Uji pendahuluan rentang waktu pemberian ekstrak etanol akar krokot belanda.
Hewan uji sebanyak dua puluh ekor dibagi dalam 4 kelompok. Tiap kelompok terdiri dari lima ekor. Tiap kelompok diberi perlakuan ekstrak etanol akar krokot belanda dengan dosis sesuai hasil orientasi pada selang waktu 15, 30, 45, dan 60 menit sebelum diinjeksi karagenin 0,05 ml secara subplantar. Selang waktu sesuai orientasi waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin, tiap kelompok hewan uji dikorbankan dan kedua kaki belakangnya pada dipotong sendi torsocrural lalu ditimbang. Waktu pemberian ekstrak etanol akar krokot belanda ditentukan saat kaki mengalami penurunan udema yang berarti
12. Perlakuan Hewan Uji
Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak enam puluh tiga ekor yang dibagi secara acak menjadi 9 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari tujuh ekor dengan perlakuan sebagai berikut :
a. kelompok I (kelompok kontrol suspensi karagenin 1%)
Kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan suspensi karagenin 1% dosis 25 mg/kgBB secara subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin. Setelah tiga jam (berdasar uji pendahuluan) kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
b. kelompok II (kelompok kontrol CMC-Na 1%)
CMC-Na 1% diberikan secar per oral pada mencit dan setelah 15 menit, kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan suspensi karagenin
1% dosis 25 mg/kgBB secara subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian setelah 3 jam kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
c. kelompok III, IV, dan V (kontrol positif natrium diklofenak)
Tiga kelompok mencit diberi perlakuan per oral natrium diklofenak dengan masing-masing dosis sebesar 9,75; 10,795 dan 11,95 mg/kgBB, setelah 15 menit kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan suspensi karagenin 1% dosis 25 mg/kgBB secara subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian setelah 3 jam kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
d. kelompok VI, VII, VIII, dan IX (perlakuan ekstrak etanol akar krokot belanda)
Empat kelompok mencit diberi perlakuan per oral ekstrak etanol akar krokot belanda dengan masing-masing dosis sebesar 1674,49; 2411,26; 3472,22; dan 5000 mg/kgBB. Setelah 15 menit, masing-masing kelompok diinjeksi suspensi karagenin 1% dosis 25 mg/kgBB secara subplantar pada kaki kiri belakang sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian setelah 3 jam kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
13. Perhitungan respon daya anti inflamasi
Data penimbangan berat kaki belakang hewan uji digunakan untuk mengetahui efek anti inflamasi . Berdasarkan metode Langford dkk (1972) untuk mengetahui daya anti inflamasi (dalam %), digunakan rumus :
% efek anti inflamasi = ⎥⎦ ⎤ ⎢⎣ ⎡ − × % 100 U D U Keterangan :
U = harga rata-rata berat kelompok karagenin (kaki kiri) dikurangi rata-rata berat kaki normal (kaki kanan).
D = harga rata-rata berat kelompok perlakuan (kaki kiri) dikurangi rata-rata berat kaki normal (kaki kanan).