DAFTAR LAMPIRAN
II. TINJAUAN PUSTAKA
Padi Sebagai Tanaman Penting
Padi tergolong ke dalam genus Oryza, sub-famili Oryzoideae, famili Poaceae kelas monocotyledoneae. Padi yang dibudidayakan tergolong ke dalam 2 spesies, yaitu Oryza sativa L. umum ditanam di Asia dan Oryza glaberrima Steud atau disebut juga padi Afrika. Dari kedua spesies tersebut O. sativa adalah yang paling banyak dibudidayakan. O. sativa diperkirakan terdiri dari sedikitnya 140,000 varietas dan secara umum dikelompokkan ke dalam 3 grup atau sub-spesies; yaitu Indica, Japonica dan Javanica (Tropical Japonica).
Padi merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi sangat penting, makanan pokok lebih dari separuh penduduk dunia. Berdasarkan nilai ekonomi tanaman pangan secara global tahun 2005-2009, padi menempati urutan teratas dibandingkan dengan tanaman pangan penting lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong dan sorghum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT urutan pertama dari 7 komoditas pangan utama baik dari segi produksi maupun nilai ekonomi (FAOSTAT 2009; B
Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil. Sebagai tanaman model padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (∼430 Mb), umur relatif singkat, dan jumlah set kromosom sederhana
(diploid)
sehingga memudahkan dalam analisis sekuen genom. Selanjutnya tersedianya protokol transformasi genetika tanaman padi dengan efisiensi tinggi (Hiei et al. 1994; Hiei & Komari 2006), peta fisik dan genetika dengan kepadatan tinggi (Harushima et al. 1998; Temnykh et al. 2001; McCouch et al. 2002), dan kenyataan bahwa antara tanaman sereal memiliki derajat ‘synteni’ yang tinggi, menjadikan padi sebagai organisme yang unik untuk mempelajari fisiologi, biologi pertumbuhan dan perkembangan, serta genetika dan evolusi tumbuhan.
Tahun 2002 sekuen lengkap genom padi berhasil diungkap dan dipublikasi (Goff et al. 2002; Yu et al. 2002), sebagai langkah awal dari upaya pemahaman tentang biologi padi pada level molekuler. Rice Annotation Project (2007)
memprediksi padi mengandung ∼32.000 gen. Jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan prediksi sebelumnya (30-50 ribu gen) oleh Goff et al. (2002). Sebanyak 28.469 cDNA utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86% diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data (Rice Full-Length cDNA Consortium 2003). Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut.
Cekaman Kekeringan
Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata (Kalsim 2007). Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan (Setter et al. 1995). Fase generatif merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan (Yue et al. 2006). Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso.
Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan (Naylor et al. 2007). Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim.
Untuk dapat merakit padi toleran kekeringan diperlukan pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada tanaman. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada level molekuler sangat penting dilakukan. Data hasil kajian yang telah berhasil diperoleh hingga saat ini dapat dijadikan sebagai dasar di dalam upaya memahami sifat toleran kekeringan pada tanaman padi, dan juga pada
11
tanaman sereal lainnya. Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas (Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010). Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya (Fukai & Cooper 1995) atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002).
Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman
Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. Oleh karena itu untuk mengatasi cekaman lingkungan yang tidak menguntungkan, tanaman mengembangkan suatu mekanisme toleransi (Levit 1980; Mundree et al. 2002). Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman.
Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein (Takahashi et al. 2000). Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mRNA, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino (Foyer et al. 1998).
Secara umum mekanisme yang dikembangkan oleh tumbuhan untuk mengatasi cekaman lingkungan (kekeringan) dikelompokkan ke dalam tiga kelompok (Levit 1980; Chaves et al. 2003), yaitu escape, penghindaran (avoidance), dan toleran. Mekanisme adaptasi tanaman ini tidak saling terpisah. Suatu tanaman dapat menggabungkan berbagai mekanisme yang berbeda untuk proses adaptasi terhadap cekaman (Ludlow 1989, diacu dalam Chavez et al. 2003).
Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan
Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization (Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011), differential display RT-PCR (Medini et al. 2009), cDNA AFLP (Gao et al. 2009), dan DNA microarray (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011).
Seki et al. (2001) mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cDNA microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya (rd29A/cor78, cor15a, kin1, kin2, rd17/cor47, erd10, dan rd20), sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. (2002) mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan. Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. (2003) mengamati 1700 cDNA tanaman padi menggunakan cDNA microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. (2009) membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah.
Berdasarkan pengaturan ekspresinya Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (1997) membagi gen terinduksi kekeringan ke dalam dua kelompok, yaitu yang ekspresinya diinduksi oleh ABA (ABA-dependent) dan tidak diinduksi ABA (ABA-independent). Berdasarkan fungsinya, Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (2007) membagi produk dari gen-gen ini ke dalam 2 grup, yaitu: protein fungsional dan protein regulator. Protein fungsional meliputi protein yang berperan dalam merespon kekeringan misalnya protein yang berperan sebagai protease, water channel atau transporter, enzim detoksifikasi, protein faktor
13
makromolekul, (LEA protein dan Chaperon), dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit (prolin, gula). Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA. Menurut Cushman dan Bohnert (2000) setidaknya ada 8 kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1.
Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial.
Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan (Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008). Oleh karena itu akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa genetika diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan (Bhatnagar-Mathur et al. 2008).
Faktor Transkripsi
Faktor transkripsi, disebut juga faktor pengikat sekuen DNA tertentu (sequence-specific DNA-binding factor), adalah suatu protein yang menempel pada urutan DNA tertentu dan mengatur proses transkripsi satu atau lebih gen. Sejak sekuen lengkap genom beberapa tanaman berhasil diungkap, faktor transkripsi dapat diidentifikasi dengan lebih mudah menggunakan kajian
Tabel 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Kelompok/ Fungsi Kemungkinan mekanisme Produk Gen Osmo protektan Penyesuaian osmotic (osmotic adjustment); perlindungan atau stabilisasi membrane/ protein, pemusnah reactive (OH-)
•Asam amino (prolin, ektoin)
•Senyawa dimetil sulfonium (glisin betain, DMSP)
•Polyol (mannitol, D-ononitol, sorbitol)
•Gula (sucrose, trehalose, fruktan)
•Dadc (Capel et al. 2004),
ectABC (Nakayama et al. 2000), AtP5CS (Yamada et al. 2005) •CMO (Shirasawa et al. 2006) •mtlD (Karakas et al. 1997), IMT1 (Sheveleva et al. 1997)
•OtsA, OtsB (Garg et al. 2002)
Reactive oxygen scavengers
Detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS)
• Enzim (catalase, Fe/Mn superoxide dismutase, askorbat peroksidase, enzim siklus glutation, glutathione S-transferase, glutation peroksidase, gamma-glutamilsistein sintetase, alternative oksidase)
• Non enzim (askorbat, flavon, karotenoid, antosianin)
chlCU/ZN SOD (Chatzidimitriadou et al. 2009), PpAPX (Li et al. 2009), SOD, APX (Lu et al. 2010), Eltayeb et al. 2007)
Protein stres Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon
Protein LEA (late embryogenesis abundant ); mis. dehidrin
HaDhn1,2 (Cellier et al. 1998), OsLEA3-1 (Xiao
et al. 2007) Status air Tingkah laku stomata,
pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma
Aquaporin atau lubang (channel) air OsPIP2-2 (Guo et al. 2006) Komponen sinyal Transduksi sinyal yang dimediasi oleh sensor Ca 2+
Homolog histidin kinase (AtRR1/2), MAP kinase (PsMAPK, HOG), Ca /
fosforilasi
2+
SNF1/kinase, protein fosfatase (ABI1/2), system sinyal CAN/B,Ca
dependent protein kinase,
2+
inositol kinase sensor (SOS3),
OsMPK5 (Xiong & Yang 2003), OsSIK1 (Ouyang et al. 2010). Kontrol transkripsi Pengaktifan transkripsi
Faktor transkripsi famili: APETELA2 (AP2), bZIP, zinc-finger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip
•OsDREB1 (Ito et al. 2006) •OsbZIP23 (Xiang et al. 2008) •WRKY11 (Wu et al. 2009), •OsMyb4 (Mattana et al. 2005) •SNAC1 (Hu et al. 2006) •Hahb4 (Dezar et al. 2005a) Pengatur pertumbuh an Perubahan homeostasis hormon
Mengubah jalur biosintesis atau level konjugat ABA, sitokinin dan/atau brassinosteroid
ARR4 and ARR5 (Miyata
et al. 1998)
15
bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya (binding domain) (Zhang et al. 2011). Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2/ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bZip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masing-masing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan
Family Gen Mekanisme Pustaka
AP2/ERF DREB CBF4 HARDY GmERF3 SHN1/WIN1 Biosintesa osmoprotectan, protein LEA, & pengaturan pertumbuhan
Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air (WUE) Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin
Ito et al. 2006;
Lopato & Langridge 2011 Haake et al. 2002 Karaba et al. 2007 Zhang et al. 2009 Aharoni et al. 2004 C2H2 Zinc Finger
dst Pengaturan stomata Huang et al. 2009 WRKY BhWRKY1 Signaling oligosakarida famili
rafinosa
Wang et al. 2009 NF-YA NFYA5 Pengaturan stomata Li et al. 2008,
Cominelli et al. 2010
MYB MYB96
AtMYB60
Pengaturan lapisan lilin kutikula Pengaturan stomata Seo et al. 2011 Cominelli et al. 2005 NAC SNAC ONAC045
Pengaturan stomata Hu et al. 2006 Zheng et al. 2009 bZip PtrABF Scavenging ROS Huang et al. 2010 HD-Zip Hahb4 Pengaturan perpanjangan sel
atau pertumbuhan
HD-Zip
HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain (HD) dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA. Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut (Sakakibara et al. 2001), paku (Aso et al. 1999), hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar (Populus tricocarpa) (Robischon et al. 2011), dari kelas monokotil seperti padi (Agalou et al. 2008) dan jagung (Whipple et al. 2011), maupun dikotil misalnya Arabidopsis (Henriksson et al. 2005), bunga matahari (Manavella et al. 2008), dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum (Deng et al. 2002), tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung.
Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi (http://planttfdb.cbi. pku.edu.cn/
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya pada berbagai tanaman menunjukkan gen HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam (Tabel 3). Beberapa protein HD-Zip yang terkenal adalah GLABRA dari sub-famili IV dan PHABULOSA, CORONA dan REVOLUTA dari sub-famili III. Gen GLABRA penting dalam pembentukan trikoma (Rerie et al. 1994), sedangkan gen REVOLUTA, PHABULOSA dan CORONA berperan dalam perkembangan daun, jaringan pembuluh dan inisiasi jaringan meristem (Prigge et al. 2005). Akhir-akhir ini gen dari faktor transkripsi HD-Zip khususnya sub-famili I dan II banyak dipelajari terkait respon kekeringan. Pada tanaman gurun yang sangat ). Pada Arabidopsis thaliana, misalnya, terdapat 56 gen HD-Zip, kemudian pada bunga matahari ada 15, sedangkan pada padi Indica dan pada padi Japonica secara berturut-turut adalah 46 dan 61 (Zhang et al. 2011). Gen HD-Zip ini dibagi kedalam empat sub-famili (I-IV) berdasarkan empat kriteria, yaitu; (1) konservasi domain HD-Zip yang menggambarkan spesifisitas pengikatan DNA, (2) struktur gen, (3) motif conserved tambahan, dan (4) berdasarkan fungsinya (Ariel et al. 2007). Perbedaan struktur protein dari masing-masing sub-famili diilustrasikan pada Gambar 2.
17
toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip (CpHB3, 4, 5, 6, 7) responsif kekeringan (Deng et al. 2002). Sebelumnya, Frank et al. (1998) telah mengisolasi 2 gen HD-Zip (CpHB1 & 2) responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi. Empat (AtHB5, 6, 7, dan 12) diantaranya responsif terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 (Ariel et al. 2007). Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004), namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. (2005a) menggunakan gen Hahb-4 (HD-Zip sub-famili I) bunga matahari. Overekspresi
Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran
kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya. Hal ini menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang.
Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. (2008) berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan (yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27) dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 (padi sawah sensitif kekeringan) dan IRAT109 (padi gogo toleran kekeringan) berdasarkan hasil
analisis ekspresi menggunakan real-time PCR. Overekspresi OsHox4
menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Namun, tanaman menjadi kerdil akibat ukuran sel yang pendek dan steril (Agalou et al. 2008). Hal ini mengindikasikan bahwa OsHox4 berperan dalam pemanjangan sel. Fungsi gen responsif kekeringan OsHox lainnya belum diketahui, sehingga analisis fungsi gen OsHox masih perlu dilakukan.
Gambar 2 Skema struktur protein unik dari setiap sub-famili HD-Zip. HD
homeodomain, LZ leucin zipper, CPSCE asam amino konservatif Cys, Pro, Ser, Cys, Glu dengan sandi satu huruf, domain
MEKHLA asam amino konservatif Met, Glu, Lys, His, Leu, Ala ,
N-term consensus ujung-N, SAD START-adjacent domain,