TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN
PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM
DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6
SYAMSIDAH RAHMAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen
OsHox6 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Januari 2012
Syamsidah Rahmawati
Rhizobium and Agrobacterium and Functional Analysis of OsHox6 Gene. Under direction of SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN
Rice (Oryza sativa) is not only the most important crop in the world, but also a model plant for functional genomic studies. Genetic transformation is a routine technique for transferring important traits into plants including rice genome and for gene function analysis. Agrobacterium transformation technique is the most commonly used for genetic transformation of plants. However, the complexity of patents landscape surrounds this technology restricts its use for agricultural development in developing countries. In this study, the effectiveness of Rhizobium transformation techniques were evaluated in three rice cultivars Ciherang, Nipponbare, and Rojolele, and compared to Agrobacterium. Six-day old callus induced from immature embryos were co-cultivated with Rhizobium leguminosarum ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288 both carrying the plasmid pCAMBIA 5106. pCAMBIA 5106 is a cointegrative vector. The T-DNA contained an hpt gene and a GUSPlus each controlled by the CaMV 35S promoter. This study showed that the Rhizobium could transfer genes into rice genome as efficient as that of Agrobacterium based on evaluation on transformation efficiency, transgene expression, copy number, segregation pattern, and plant growth and fertility. Drought is one of abiotic factors that inhibit rice growth and production. A number of genes responsible for drought tolerance have been identified, isolated and tested in different plant species. However, none of these genes was effective in the fields. In this study, a drought inducible gene, OsHox6, was selected to be studied further. Bioinformatics analysis of OsHox6 promoter sequences indicated that the OsHox6 promoter contains cis-regulatory elements important to drought and ABA responses. Temporal and spatial expression patterns of GUSPlus gene fused to OsHox6 promoter through histochemical visualization of GUSPlus in transgenic plant of Ciherang and Nipponbare showed that promoter activity was increased during dehydrated condition in vegetative and generative organs, although the expression was relatively low. Promoter activity was higher in meristematic tissues. Transgenic rice plants containing an extra copy of OsHox6 genes controlled by
OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic of IR64 lines (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing an extra copy of OsHox6 gene were more tolerant to drought condition, showing higher survival rate compare to wild type plants. It is anticipated that the increase in the survival rate was associated with the expression level of OsHox6 gene. Thus, the expression of OsHox6 gene will be further evaluated. The growths of transgenic rice plants were similar to its wild type counterpart. Further studies are needed to understand the modulation of drought tolerant by the OsHox6 gene.
Key words: Drought stress, transcription factor,HD-Zip, OsHox6, OsLEA3, rice,
Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Dibimbing oleh SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN
Padi merupakan tanaman yang sangat penting, salah satu makanan pokok penduduk dunia dan tanaman model untuk penelitian functional genomic. Transformasi genetik merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman termasuk padi dan untuk analisis fungsi gen. Teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan karena besar kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan salinan gen tunggal. Namun, teknik ini telah dipatenkan sehingga perlu agen transformasi alternatif yang memiliki kemampuan transfer gen seperti Agrobacterium. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetik memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T-DNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi. Efektifitas teknik transformasi Rhizobium dievaluasi pada tiga kultivar padi, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), dan Rojolele (Javanica), dibandingkan dengan
Agrobacterium. Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) dikokultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pCAMBIA 5106. Plasmid pCAMBIA 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen
GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05% dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen, dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetik pada tanaman T0 dan T1
Kekeringan adalah salah satu faktor abiotik yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman padi. Sejumlah gen yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan telah diidentifikasi, namun belum ada dari gen-gen tersebut yang efektif di lapangan. Oleh karena itu, penelitian tentang analisis fungsi gen yang diduga terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan dan bagaimana mekanisme kerjanya pada level molekul aktif diteliti saat ini. Di dalam penelitian ini, fungsi gen OsHox6 yang diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi dipelajari. OsHox6 merupakan anggota famili protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip) sub-famili I yang menyandikan faktor transkripsi unik pada tumbuhan. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi gen OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Analisis bioinformatik sekuen promoter OsHox6 , menunjukkan bahwa efektifitas
mengindikasikan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen responsif terhadap ABA dan elemen cis-regulatory responsif terhadap kekeringan. TATA box yang umum dijumpai di derah promoter tanaman, berdasarkan hasil analisis sekuen promoter OsHox6, tidak ditemukan. Hasil analisis pola ekspressi temporal dan spasial promoter gen OsHox6 melalui visualisasi gen GUSPlus secara histokimia pada jaringan tanaman transgenik Ciherang dan Nipponbare menunjukkan bahwa aktivitas promoter ini meningkat saat kekeringan pada organ vegetatif (batang, daun, dan akar) dan generatif (bunga). Aktivitas promoter lebih kuat pada daerah dimana terdapat jaringan meristem yang aktif membelah.
Untuk mempelajari peranan gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6. Empat galur padi transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 (IR64 I.19, I.23, I.33, dan I.40) lebih tahan pada kondisi kekeringan pada fase vegetatif, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya (IR64). Diduga peningkatan persentase recovery berhubungan dengan tingkat ekspresi gen OsHox6. Oleh karena itu konfirmasi ekspresi gen OsHox6 akan dilakukan. Penampilan morfologi (tinggi tanaman) padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya. Karena aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada daerah akar lateral, maka diduga OsHox6 penting dalam pembentukan akar lateral. Oleh karena itu penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengamati morfologi akar tanaman transgenik yang mengoverekspresikan OsHox6.
Kata Kunci: Cekaman kekeringan, faktor transkripsi, HD-Zip, OsHox6,
OsLEA3, padi, Rhizobium leguminosarum ANU845,
Hak cipta milik IPB, tahun 2012 Hak dilindungi undang-undang
Dilarang mengutip sebahagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6
SYAMSIDAH RAHMAWATI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Departemen Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Penguji pada ujian tertutup : 1. Dr. Ir. Miftahuddin, M.Si
2. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Sc
Penguji pada ujian terbuka : 1. Prof. Dr. Ir. Sudirman Yahya, M.Sc
Nama Mahasiswa : Syamsidah Rahmawati
NRP : G361060111
Program Studi : Biologi
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Ketua
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dr. Ir. Inez Hortense Slamet-Loedin
Anggota Anggota
Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr
Diketahui,
Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
banyak serta kemudahan-kemudahan, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi ini. Penulis sangat beruntung mendapat kesempatan untuk melakukan penelitian Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan
Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Penelitian ini merupakan penelitian yang sangat menarik bagi penulis karena memberikan wawasan baru tentang adanya teknik transformasi alternatif bagi tanaman dengan menggunakan bakteri selain Agrobacterium dan bagaimana mempelajari fungsi suatu gen. Penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk mendukung karier penulis sebagai peneliti di masa mendatang.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Suharsono, Prof. Didy Sopandie, dan Dr. Inez Hortense Slamet-Loedin atas kesediannya membimbing penulis dalam melakukan penelitian ini. Ucapan terimakasih disampaikan kepada Kepala Puslit Bioteknologi LIPI yang telah memberikan izin untuk melanjutkan studi pada program S3, kepada Kementrian Riset dan Teknologi dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama pendidikan berlangsung, kepada Dekan Sekolah Pascasarjana dan Ketua Departemen Biologi IPB yang telah memberi kesempatan untuk mengikuti pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana Departemen Biologi IPB. Kepada Dr. Satya Nugroho dan Dr. Amy Estiati atas izin peggunaan fasilitas di Lab. Biologi Molekuler Puslit Bioteknologi LIPI. Kepada keluarga besar di Bogor dan di Medan saya ucapkan terimakasih atas semua dukungan dan doa sehingga penulis tetap bersemangat dalam menyelesaikan disertasi ini. Juga kepada semua teman dari lab “Padi” Puslit Bioteknologi LIPI, angkatan 2006 Pascasarjana IPB atas semua dukungan, bantuan, serta doanya saya ucapkan terimakasih.
Semoga Disertasi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi.
Bogor, Januari 2012
Bapak Saman dan Ibu Amijah Porman Marpaung. Pendidikan Sarjana ditempuh di Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara Medan, lulus pada tahun 1992. Pada tahun 1997 penulis mendapatkan kesempatan mengikuti program S2 LINK Institut Teknologi Bandung dengan University of New South Wales Australia melalui program Beasiswa STAID yang dikoordinir oleh Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), lulus tahun 1999. Pada tahun 2006, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana IPB, Departemen Biologi dengan beasiswa dari Kementrian Riset dan Teknologi pada tahun pertama dan kedua, dan kemudian Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia pada tahun ke tiga dan ke empat.
Penulis bekerja sebagai staf peneliti di Pusat Penelitian Bioteknologi sejak tahun 1993 pada bidang konservasi benih, kemudian sejak tahun 1996 pindah ke bidang biologi molekuler hingga sekarang. Penulis terlibat dalam kegiatan penelitian padi sejak tahun 1999 hingga sekarang terutama untuk transformasi genetika padi untuk memperbaiki sifat toleran padi terhadap cekaman biotik dan abiotik.
Selama mengikuti program S3, penulis mendapat kesempatan untuk mengikuti training mengenai “Rice:Research to Production” di International Rice Research Institute (IRRI) Filipina selama 3 minggu pada tahun 2008. Topik penelitian untuk Disertasi adalah Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Comparative analysis of rice transformation using Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum yang merupakan bagian dari Disertasi ini telah dipublikasi di Indonesian Journal of Biotechnology Volume 15 No. 1 Juni 2010.
Daftar Tabel ... iii
Daftar Gambar ... v
Daftar Lampiran ... . vii
I. PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1
Tujuan Penelitian ... 5
Manfaat Penelitian ... 5
Ruang Lingkup Penelitian ... 6
II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting ... 9
Cekaman Kekeringan ... 10
Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman ... 11
Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan ... 12
Faktor Transkripsi ... 13
HD-Zip ... 16
Analisis Fungsi Gen ... 18
Transformasi Genetika Tanaman ... 21
III. ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIK PADI MENGGUNAKAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS DAN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM Abstrak ... 27
Abstract ... 27
Pendahuluan ... 28
Bahan dan Metode ... 29
Hasil ... 33
Pembahasan ... 38
ii
IV. ANALSIS REGULASI PROMOTER OsHox6 PADA
TANAMAN PADI
Abstrak ... 41
Abstract ... 41
Pendahuluan ... 42
Bahan dan Metode ... 43
Hasil ... 48
Pembahasan ... 56
Simpulan ... 58
V. OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak ... 59
Abstract ... 59
Pendahuluan ... 60
Bahan dan Metode ... 62
Hasil ... 65
Pembahasan ... 70
Simpulan ... 72
VI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetik Alternatif... 73
Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Fungsi Gen OsHox6... 75
Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi... 77
VII. SIMPULAN UMUM DAN SARAN SIMPULAN UMUM... 79
SARAN ... 79
DAFTAR PUSTAKA ... 81
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan
dan fungsinya... 14 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon
kekeringan... 15 3 Subfamili HD-Zip dan fungsinya... 18 4 Media yang digunakan untuk transformasi tiga varietas padi
(Ciherang, Nipponbare, dan Rojolele)... 32 5 Efisiensi transformasi tiga varietas padi hasil transformasi
dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium
tumefaciens... 34 6 Ekspresi GUS dan HPT pada tiga varietas padi hasil
transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens berdasarkan uji GUS dan
higromisin pada daun... 35 7 Prakiraan jumlah gen hpt pada galur tanaman transgenik
terpilih hasil transformasi dengan Agrobacterium (A) dan
Rhizobium (R)... 37 8 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T1 galur terpilih... 37 9 Pertumbuhan dan fertilitas beberapa galur transgenik terpilih
hasil transformasi dengan Rhizobium dan Agrobacterium... 38 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA
pada 1 kb daerah promoter OsHox6... 50 11 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T1 Ciherang dan IR64
yang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3... 67 12 Tingkat recovery tanaman transgenik pada kondisi
kekeringan... 69 13 Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A.
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Diagram alur penelitian... 7 2 Skema struktur protein unik dari setiap subfamili HD-Zip... 18 3 T-DNA di dalam pCAMBIA 5106... 31 4 Amplifikasi fragmen gen hpt tanaman transgenik terpilih hasil
transformasi dengan A. tumefaciens atau R. leguminosarum
pembawa plasmid pCAMBIA 5106... 34 5 Daun tanaman padi transgenik yang mengekspresikan β
-glucuronidase dan higromisin fosfotransferase ... 35 6 Contoh hasil hibridisasi Southern... 36 7 Penampilan morfologi Niponbare, Ciherang, dan Rojolele hasil
transformasi dengan A. tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106)
and R. leguminosarum (pCAMBIA5106)... 38 8 Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6
dengan gen pelapor GUSPlus ... 46 9 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter
OsHox6... 50 10 Hasil pensejajaran sekuen kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi
dari padi Ciherang dengan sekuen acuan dari Nipponbare... 51 11 Contoh hasil PCR menggunakan primer spesifik untuk gen hpt... 52 12 Ekspresi GUSPlus pada berbagai organ tanaman padi cv Ciherang
dan Nipponbarehasil transformasi dengan gen GUSPlus yang
dikontrol oleh promoter terinduksi kekeringan OsHOx6 dan promoter konstitutif CaMV 35S pada saat ada atau tidak ada induksi
kekeringan... 54 13 Pola ekspresi GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6 pada
berbagai organ tanaman... 55 14 Penampang melintang dan membujur bagian buku batang padi yang
telah di uji GUS... 56 15 T-DNA di dalam pCAMBIA 1301H OsHox6... 65 16 Tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman padi varietas
Ciherang atau IR64 yang mengandung OsLEA3::OsHox6 ... 68 17 Hasil hibridisasi Southern DNA tanaman IR64 yang ditransformasi
dengan gen OsHox6... 69 18 Recovery tanaman transgenik galur IR64 tahan higromisin
mengandung 1 salinan gen hasil transformasi dengan gen OsHox6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
I. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi (Oryza sativa L.) merupakan komoditas strategis, makanan pokok penduduk Indonesia dan penduduk di berbagai belahan dunia terutama Asia, Timur Tengah dan Amerika Latin. Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil, karena dibandingkan dengan tanaman lain dari kelompok monokotil, padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (430 Mb), umur relatif singkat, menyerbuk sendiri, diploid sehingga
memudahkan dalam melakukan analisis genom (http://www.patentlens.
net/daisy/RiceGenome/3649/3593.html
Kekeringan adalah salah satu faktor utama penghambat produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menurunkan produksi tanaman dengan menghambat pertumbuhan dan fotosintesis (Shou et al. 2004). Menurunnya produksi akibat kekeringan berdampak pada peningkatan harga produk pertanian dan
memperburuk kemiskinan
). Meskipun variasi ukuran genom dan ploidi pada tanaman monokotil sangat besar, genom padi dan tanaman monokotil lainnya sangat konservatif baik dalam hal sekuen dari gen yang ada, juga dalam urutan gen atau “synteni”. Sehingga informasi yang ada pada genom tanaman padi dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari genom tanaman monokotil lainnya.
Sifat toleran kekeringan sangat kompleks, dikendalikan oleh banyak gen (multigenik) yang tersebar di banyak lokus dan diwariskan secara kuantitatif (Valliyodan & Nguyen 2006; Fleury et al. 2010; Lang & Buu 2010). Selain itu tanaman memiliki mekanisme yang berbeda (escape, penghindaran atau avoidance, atau toleran) dalam merespon kekeringan (Levit 1972). Tanaman escape kekeringan dengan mempersingkat siklus hidupnya. Sebahagian tanaman menghindari kekeringan dengan meningkatkan penyerapan air dan meminimalkan kehilangan air. Tanaman toleran kekeringan melibatkan mekanisme osmotic adjustment, antioksidan, dan ketahanan desikasi. Namun bagaimana mekanisme molekuler tanaman dalam merespon dan beradaptasi terhadap kekeringan belum sepenuhnya dimengerti.
Berbagai pendekatan telah diupayakan untuk mempercepat pengungkapan mekanisme toleran kekeringan pada level molekuler. Sejumlah gen terinduksi kekeringan telah berhasil diidentifikasi pada level transkripsi menggunakan analisis microarray pada tanaman model Arabidopsis dan padi (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Zhou et al. 2007), namun belum semua fungsi gen berhasil diungkapkan. Analisis fungsional genomik sangat penting dilakukan untuk memahami lebih lanjut fungsi gen terkait dan bagaimana mekanisme pengaturannya pada level molekuler.
3
Oleh karena kompleksnya sifat toleran kekeringan, penyisipan satu gen yang memiliki fungsi tunggal tidak cukup untuk mengembalikan fungsi sel dan membuat tanaman lebih toleran kekeringan (Bohnert et al. 1995; Mitra 2001).
Untuk mengatasi hal tersebut akhir-akhir ini penelitian lebih diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan. Faktor transkripsi berperan dalam mengatur ekspresi gen-gen lain melalui pengikatan spesifik antara protein faktor transkripsi dengan elemen cis-acting promoter gen target. Sejumlah faktor transkripsi terinduksi kekeringan pada tanaman telah berhasil diungkap. Secara umum faktor transkripsi yang responsif terhadap kekeringan tersebut dikelompokkan ke dalam beberapa famili seperti AP2/ERF, bZIP, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 zinc finger dan WRKY (Vinocur & Altman 2005; Bartels & Sunkar 2005; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007).
Setelah sekuen genom padi dan Arabidopsis berhasil diungkap, faktor transkripsi yang ada pada tanaman padi dan Arabidopsis dapat diidentifikasi (Seki et al. 2002; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007; Agalou et al. 2008). Berbagai teknik reverse genetik telah dikembangkan untuk mempelajari fungsi faktor transkripsi. Secara umum teknik reverse genetik ini dibagi ke dalam 2 pendekatan, yaitu overekspresi dan knockout (Zhang 2003). Selain itu analisis promoter yang difusikan dengan gen pelapor digunakan untuk mempelajari mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler dan aktivitas promoter secara spasial dan temporal (Hiwatashi & Fukuda 2000; Xiao & Xue 2001; Johannesson et al. 2003; Itoh et al. 2008).
perkembangan tanaman pada saat terjadi cekaman (Olsson et al. 2004; Dezar et al. 2005a; Agalou et al. 2008). Faktor transkripsi HD-Zip di tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini. Informasi tentang fungsi dan mekanisme regulasinya masih sangat terbatas. Dari 31 gen HD-Zip sub-famili I,II, dan III yang ada pada padi, baru 2 yang dipelajari fungsinya, yaitu OsHox1 dan OsHox4. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000), sedangkan OsHox4 berperan dalam pemanjangan dan pembesaran sel pembuluh (Agalou et al. 2008).
Pada penelitian ini fungsi gen faktor transkripsi OsHox6 yang diisolasi dari tanaman padi dipelajari. Gen OsHox6, merupakan anggota HD-Zip sub-famili I, dilaporkan meningkat ekspresinya pada saat kekeringan (Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008), sehingga diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Untuk mempelajari lebih lanjut fungsi gen OsHox6 dalam adaptasi toleran kekeringan, aktivitas native promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus diamati pada tanaman padi saat kekeringan. Kekeringan meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada berbagai organ (batang, akar, daun, dan bunga) tanaman padi, namun ekspresinya rendah. Oleh karena itu pada percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 padi pada kondisi kekeringan. Sebelumnya, Xiao et al. (2007) melaporkan bahwa OsLEA3 menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekurangan air. Selanjutnya toleransi tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi.
5
dipatenkan yang mana dapat menjadi ganjalan bila produk akan dipasarkan. Oleh karena itu perlu diupayakan teknik transformasi alternatif.
Broothaerts et al. (2005) melaporkan bahwa sejumlah bakteri yang berasosiasi dengan tumbuhan, jika dilengkapi dengan gen-gen virulen dan T-DNA dari plasmid Ti mampu mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. Bakteri Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp dan Mesorhizobium loti mengandung plasmid Ti dari Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom padi, tembakau dan Arabidopsis dengan efisiensi transformasi yang bervariasi antara 1-40% tergantung pada spesies dan pengujian yang digunakan. Evaluasi efektititas bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens belum pernah dilakukan. Informasi ini penting sebagai langkah awal dalam upaya pengembangan transformasi genetik menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Selanjutnya perubahan faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi diharapkan dapat meningkatkan efisiensi transformasi di masa mendatang.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk;
1. Mengevaluasi efektifitas sistem transformasi Rhizobium pada tanaman padi dibandingkan dengan sistem transformasi Agrobacterium,
2. Menjelaskan regulasi gen OsHox6 melalui studi bioinformatik promoter gen OsHox6 serta analisis pola ekspresinya pada tanaman padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen penyandi β-glucuronidase, dan
3. Menjelaskan peranan faktor transkripsi OsHox6 pada tanaman transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 pada kondisi kekeringan.
Manfaat Penelitian
2. Informasi tentang peranan gen OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan tanaman padi penting untuk diketahui dalam upaya mencari gen-gen potensial untuk toleran kekeringan.
3. Promoter terinduksi kekeringan dapat digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen-gen penting terkait toleran kekeringan.
4. Padi toleran kekeringan sangat diperlukan untuk antisipasi fluktuasi iklim ekstrim (kemarau panjang) yang semakin sering terjadi akibat pemanasan global yang mengakibatkan gagal panen di daerah utama padi sawah yang rawan kekeringan.
Ruang Lingkup Penelitian
Untuk mencapai tujuan penelitian di atas, maka penelitian ini dibagi dalam 3 tahap percobaan. Pada tahap awal dilakukan penelitian pendahuluan dengan
topik “Analisis komparatif transformasi genetik padi menggunakan
Agrobacterium tumefaciens dan Rhizobium leguminosarum”. Untuk mengevaluasi keefektifan teknik transformasi Rhizobium dibandingkan dengan transformasi Agrobacterium pada tanaman padi, maka pengamatan difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masing-masing sistem, ekspresi gen, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan pertumbuhan dan kesuburan (fertilitas) tanaman yang dihasilkan oleh kedua sistem transformasi ini. Pada tahap berikutnya dilakukan isolasi dan konstruksi vektor yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus. Selanjutnya vector ini ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi. Aktivitas promoter OsHox6 diamati pada tanaman padi yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus pada kondisi air terbatas (kekeringan) atau tidak kekurangan air (normal). Selanjutnya, pengamatan dilakukan pada organ vegetatif (batang, akar, daun) dan generatif (bunga). Untuk mengamati jaringan yang mengakumulasikan GUSPlus dilakukan irisan secara melintang dan membujur.
7
ketahanan tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Seluruh kegiatan penelitian dalam disertasi ini dirangkum dalam alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Diagram alur penelitian
Pembentukan populasi tanaman mengandung OsHox6P:: GUSPlus
Pembentukan populasi tanaman mengandung OsLEA3P:: OsHox6 Isolasi Promoter OsHox6 dan konstruksi vektor pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus
Studi transformasi padi Ciherang, Rojolele dan
Nipponbare dengan
Rhizobium dan
Agrobacterium
Evaluasi efektifitas transformasi
Analisis ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6
Evaluasi tingkat toleransi tanaman padi mengandung ekstra gen
II. TINJAUAN PUSTAKA
Padi Sebagai Tanaman Penting
Padi tergolong ke dalam genus Oryza, sub-famili Oryzoideae, famili Poaceae kelas monocotyledoneae. Padi yang dibudidayakan tergolong ke dalam 2 spesies, yaitu Oryza sativa L. umum ditanam di Asia dan Oryza glaberrima Steud atau disebut juga padi Afrika. Dari kedua spesies tersebut O. sativa adalah yang paling banyak dibudidayakan. O. sativa diperkirakan terdiri dari sedikitnya 140,000 varietas dan secara umum dikelompokkan ke dalam 3 grup atau sub-spesies; yaitu Indica, Japonica dan Javanica (Tropical Japonica).
Padi merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi sangat penting, makanan pokok lebih dari separuh penduduk dunia. Berdasarkan nilai ekonomi tanaman pangan secara global tahun 2005-2009, padi menempati urutan teratas dibandingkan dengan tanaman pangan penting lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong dan sorghum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT urutan pertama dari 7 komoditas pangan utama baik dari segi produksi maupun nilai ekonomi (FAOSTAT 2009; B
Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil. Sebagai tanaman model padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (∼430 Mb), umur relatif singkat, dan jumlah set kromosom sederhana
(diploid)
sehingga memudahkan dalam analisis sekuen genom. Selanjutnya tersedianya protokol transformasi genetika tanaman padi dengan efisiensi tinggi (Hiei et al. 1994; Hiei & Komari 2006), peta fisik dan genetika dengan kepadatan tinggi (Harushima et al. 1998; Temnykh et al. 2001; McCouch et al. 2002), dan kenyataan bahwa antara tanaman sereal memiliki derajat ‘synteni’ yang tinggi, menjadikan padi sebagai organisme yang unik untuk mempelajari fisiologi, biologi pertumbuhan dan perkembangan, serta genetika dan evolusi tumbuhan.
memprediksi padi mengandung ∼32.000 gen. Jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan prediksi sebelumnya (30-50 ribu gen) oleh Goff et al. (2002). Sebanyak 28.469 cDNA utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86% diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data (Rice Full-Length cDNA Consortium 2003). Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut.
Cekaman Kekeringan
Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata (Kalsim 2007). Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan (Setter et al. 1995). Fase generatif merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan (Yue et al. 2006). Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso.
Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan (Naylor et al. 2007). Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim.
11
tanaman sereal lainnya. Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas (Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010). Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya (Fukai & Cooper 1995) atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002).
Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman
Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. Oleh karena itu untuk mengatasi cekaman lingkungan yang tidak menguntungkan, tanaman mengembangkan suatu mekanisme toleransi (Levit 1980; Mundree et al. 2002). Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman.
Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein (Takahashi et al. 2000). Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mRNA, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino (Foyer et al. 1998).
Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan
Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization (Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011), differential display RT-PCR (Medini et al. 2009), cDNA AFLP (Gao et al. 2009), dan DNA microarray (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011).
Seki et al. (2001) mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cDNA microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya (rd29A/cor78, cor15a, kin1, kin2, rd17/cor47, erd10, dan rd20), sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. (2002) mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan. Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. (2003) mengamati 1700 cDNA tanaman padi menggunakan cDNA microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. (2009) membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah.
13
makromolekul, (LEA protein dan Chaperon), dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit (prolin, gula). Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA. Menurut Cushman dan Bohnert (2000) setidaknya ada 8 kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1.
Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial.
Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan (Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008). Oleh karena itu akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa genetika diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan (Bhatnagar-Mathur et al. 2008).
Faktor Transkripsi
Tabel 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan
•Asam amino (prolin, ektoin)
•Senyawa dimetil sulfonium (glisin betain, DMSP)
•Polyol (mannitol, D-ononitol, sorbitol)
•Gula (sucrose, trehalose, fruktan)
•Dadc (Capel et al. 2004), 1997), IMT1 (Sheveleva
et al. 1997)
• Enzim (catalase, Fe/Mn superoxide dismutase, askorbat
• Non enzim (askorbat, flavon, karotenoid, antosianin)
chlCU/ZN SOD (Chatzidimitriadou et al. 2009), PpAPX (Li et al. 2009), SOD, APX (Lu et al. 2010), Eltayeb et al. 2007)
Protein stres Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon
Protein LEA (late embryogenesis abundant ); mis. dehidrin
HaDhn1,2 (Cellier et al. 1998), OsLEA3-1 (Xiao
et al. 2007) Status air Tingkah laku stomata,
pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma
Aquaporin atau lubang (channel) air (AtRR1/2), MAP kinase (PsMAPK, HOG), Ca /
fosforilasi
2+
SNF1/kinase, protein fosfatase (ABI1/2), system sinyal CAN/B,Ca
dependent protein kinase,
2+
inositol kinase sensor (SOS3),
OsMPK5 (Xiong & Yang 2003), OsSIK1 (Ouyang
Faktor transkripsi famili: APETELA2 (AP2), bZIP, zinc-finger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip
•OsDREB1 (Ito et al.
Mengubah jalur biosintesis atau level konjugat ABA, sitokinin dan/atau brassinosteroid
ARR4 and ARR5 (Miyata
et al. 1998)
15
bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya (binding domain) (Zhang et al. 2011). Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2/ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bZip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masing-masing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan protein LEA, & pengaturan pertumbuhan
Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air (WUE) Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin
Ito et al. 2006;
Lopato & Langridge 2011 Haake et al. 2002 WRKY BhWRKY1 Signaling oligosakarida famili
rafinosa HD-Zip Hahb4 Pengaturan perpanjangan sel
atau pertumbuhan
HD-Zip
HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain (HD) dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA. Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut (Sakakibara et al. 2001), paku (Aso et al. 1999), hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar (Populus tricocarpa) (Robischon et al. 2011), dari kelas monokotil seperti padi (Agalou et al. 2008) dan jagung (Whipple et al. 2011), maupun dikotil misalnya Arabidopsis (Henriksson et al. 2005), bunga matahari (Manavella et al. 2008), dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum (Deng et al. 2002), tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung.
Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi (http://planttfdb.cbi. pku.edu.cn/
17
toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip (CpHB3, 4, 5, 6, 7) responsif kekeringan (Deng et al. 2002). Sebelumnya, Frank et al. (1998) telah mengisolasi 2 gen HD-Zip (CpHB1 & 2) responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi. Empat (AtHB5, 6, 7, dan 12) diantaranya responsif terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 (Ariel et al. 2007). Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004), namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. (2005a) menggunakan gen Hahb-4 (HD-Zip sub-famili I) bunga matahari. Overekspresi
Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran
kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya. Hal ini menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang.
Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. (2008) berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan (yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27) dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 (padi sawah sensitif kekeringan) dan IRAT109 (padi gogo toleran kekeringan) berdasarkan hasil
analisis ekspresi menggunakan real-time PCR. Overekspresi OsHox4
menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi
Gambar 2 Skema struktur protein unik dari setiap sub-famili HD-Zip. HD
homeodomain, LZ leucin zipper, CPSCE asam amino konservatif Cys, Pro, Ser, Cys, Glu dengan sandi satu huruf, domain
MEKHLA asam amino konservatif Met, Glu, Lys, His, Leu, Ala ,
N-term consensus ujung-N, SAD START-adjacent domain, START (steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer ( Ariel et al. 2007).
Tabel 3 Sub-famili HD-Zip dan fungsinya
Sub-famili Fungsi
HD-Zip I Respon terhadap cekaman abiotik , respon terdap ABA, de-etiolasi, sinyal cahaya biru
HD-Zip II Respon terhadap keadaan pencahayaan,toleran naungan (Shade avoidance), respon terhadap auxin
HD-Zip III Embriogenesis, pengaturan meristem, inisiasi organ lateral, polaritas daun, perkembangan jaringan pembuluh, transport auxin
HD-Zip IV Differensiasi sel epidermis, akumulasi antosianin, perkembangan akar, pembentukan trikom
Sumber: Ariel et al. 2007
Analisis Fungsi Gen
19
Forward genetic secara umum dilakukan untuk mengindentifikasi gen atau mutasi gen yang menentukan fenotipe mutan yang spesifik. Fenotipe mutan yang spesifik menjadi bahan dasar kajian dari forward genetic. Tanaman mutan diperoleh dari hasil mutasi alam atau mutasi buatan. Mutasi alam terjadi sangat jarang dan kemungkinannya sangat kecil sehingga untuk mendapatkan populasi mutan yang besar diperlukan induksi mutasi. Ada beberapa pendekatan yang digunakan untuk menginduksi mutasi pada tanaman, yaitu dengan menggunakan senyawa kimia (mis. EMS, NaN3
Secara ringkas tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen menggunakan teknik map-based cloning atau disebut juga positional cloning adalah; (1) membuat populasi mapping yang besar dengan menyilangkan tanaman mutan dengan tipe liarnya, (2) mengidentifikasi marka yang bertautan (linkage) erat dengan gen target, (3) mengidentifikasi pustaka YAC (yeast artificial chromosom) atau BAC (bacterial artificial chromosom) yang berhibridisasi dengan pelacak marka, (4) membuat atau mencari marker baru dari YAC atau BAC (biasanya sekuen dari ujung klon) yang berkosegregasi dengan gen target, (5) skrining ulang (jika diperlukan) dari klon YAC atau BAC yang berbeda untuk memperoleh marker yang berkosegregasi dengan gen target, (6) mengidentifikasi kandidat gen dari klon BAC atau YAC yang berkosegregasi dengan gen target, (7) melakukan komplementasi genetika, dengan transformasi kandidat gen ke
tanaman mutan, untuk memulihkan fenotipe tipe liar, dan terakhir (8) menyekuen gen dan mengidentifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya (McClean 1998).
Saat ini banyak teknik yang dikembangkan untuk memudahkan identifikasi gen pada tanaman menggunakan pendekatan insertional mutagenesis. Beberapa dari teknik tersebut adalah T-DNA tagging, transposon tagging, retrotransposon tagging, activation tagging, dan entrapmen tagging. Masing-masing memiliki keunggulan dan kelemahan (Jeon & An 2001; Ramachandran & Sundaresan 2001). DNA tagging atau gene tagging secara sederhana dapat diartikan sebagai penandaan atau pelabelan gen sehingga mudah dilacak. Pada dasarnya tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen pada mutan hasil insertional mutagenesis adalah sama meskipun teknik insertional mutagenesis yang dipilih berbeda. Tahapan yang dilakukan meliputi (1) pembentukan populasi mutan yang besar menggunakan teknik transformasi tanaman, (2) karakterisasi molekuler mutan untuk mencari galur-galur dengan satu salinan, (3) penapisan galur mutan stabil dengan teknik PCR, (4) penapisan galur stabil dengan fenotipe yang diharapkan, (5) isolasi sekuen DNA yang mengapit daerah yang diberi label (mis. dengan thermal asymmetric interlaced (TAIL) PCR, adapter-ligated PCR, inverse PCR, atau plasmid rescue), (6) Sekuensing DNA yang mengapit daerah yang diberi label dan identifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya dengan studi bioinformatik (Vandenbusschea et al. 2003).
Pendekatan reverse genetic memanfaatkan data yang ada di pangkalan data hasil proyek sekuen genom, EST, atau transcript profiling. Reverse genetic dimulai dengan pemilihan gen target kemudian melihat pengaruh yang ditimbulkan terhadap fenotipenya akibat perubahan yang dibuat pada gennya. Secara umum pendekatan yang digunakan untuk mempelajari fungsi gen secara reverse genetika terdiri dari beberapa percobaan; (1) menghilangkan fungsi (loss of function) gen target, (2) meningkatkan fungsi (gain of function) gen target, (3)
tracking dan (4) kajian ekspresi
21
knockout dan silencing gen. Knockout gen menghilangkan fungsi gen dengan mengubah suatu sekuen gen menjadi tidak aktif sedangkan silencing gen menghilangkan fungsi gen dengan menghambat proses transkripsinya (Thorneycroft et al. 2001). Knockout dapat dilakukan diantaranya dengan insersi T-DNA atau transposon (Thorneycroft et al. 2001), sedangkan silencing dapat dilakukan dengan teknik RNAi (Kusaba 2004). Konstruk gen dari hasil modifikasi ditransformasikan kembali ke dalam genom tanaman untuk melihat pengaruhnya pada fenotipe yang dikendalikan.
Kegiatan meningkatkan fungsi (gain of function) suatu gen adalah kebalikan dari loss of function. Kegiatan ini biasanya diparalelkan dengan loss of function untuk mendapatkan data atau hasil yang lebih komprehensif. Prosesnya sama seperti loss of function hanya konstruknya dirancang untuk meningkatkan fungsi gen. Umumnya dengan menambah ekstra salinan gen disertai dengan penggunakan promoter yang lebih kuat (Lloyd 2003; Cho & Hong 2006)
Tracking dilakukan untuk menggali informasi tentang lokalisasi dan interaksi protein terkait. Salah satu cara untuk melakukan ini adalah menggabungkan sekuen gen aslinya dengan gen pelapor misalnya green fluorescent protein (GFP) yang memudahkan visualisasi produk modifikasi genetika dalam sel atau jaringan tanaman (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007).
Kajian ekspresi bertujuan mengetahui dimana dan kapan protein tertentu dihasilkan. Dalam melakukan penelitian ekspressi gen, promoter gen target difusikan dengan suatu gen pelapor (mis. gus, atau GFP) dan ditransformasikan kembali ke dalam sistem tanaman. Expresi gen kemudian diamati pada berbagai sel atau jaringan, pada tahap pertumbuhan tertentu, atau pada kondisi lingkungan tertentu (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007).
Transformasi Genetika Tanaman
Transformasi genetika tanaman adalah salah satu teknik yang sangat penting
dalam penelitian biologi molekuler dan pemuliaan tanaman. Transformasi
genetika memungkinkan pemindahan dan penyisipan satu atau beberapa DNA/gen
dari berbagai sumber (bakteri, fungi, hewan dan tumbuhan) ke dalam suatu genom
dalam 2 kelompok, yaitu teknik transformasi langsung (penembakan DNA,
elektroporasi, mikroinjeksi, dan PEG), dan dengan bantuan bakteri Agrobacterium
(Jahne et al. 1995; Komari et al. 1998; Tzfira & Citovsky 2006). Teknik transformasi secara langsung dapat diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman,
namun cenderung menyisipkan gen dengan jumlah salinan banyak pada satu lokus
(Dai et al. 2001). Hal ini menyebabkan tingginya DNA rearrangement (penyusunan kembali) atau pembungkaman gen, sehingga dapat menimbulkan kesalahan dalam interpretasi data (Kohli et al. 1998; Reddy et al. 2003). Transformasi Agrobacterium merupakan teknik yang paling umum digunakan saat ini, karena memiliki kelebihan antara lain tidak memerlukan peralatan yang
mahal, dapat diaplikasikan secara luas baik pada kelompok tanaman dikotil
maupun monokotil, pola integrasi DNA lebih mudah diprediksi dan yang paling
penting adalah kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan satu salinan
gen sangat tinggi (Roy et al. 2000; Dai et al. 2001). Tanaman homozigot dengan satu salinan gen sangat penting didalam pemuliaan tanaman dan kajian fungsi gen
karena tanaman dianggap sudah stabil dan lebih mudah dalam interpretasi
datanya.
Secara alami Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor pada tumbuhan dari kelas
dikotiledoneae. Dalam sistematika mikroorganisme Agrobacterium
diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom
Phylum
Class
Ordo
Famili
Genus : Agrobacterium
23
untuk mengangkut T-DNA dari sel bakteri dan menyisipkannya ke dalam genom tanaman. T-DNA mengandung gen penyandi senyawa opine (octopin, nopalin, atau leucinopin) yang diperlukan oleh Agrobacterium dan gen penyandi hormon pertumbuhan tanaman yang mengakibatkan pertumbuhan sel tidak terkendali dan membentuk tumor. Proses transfer gen oleh Agrobacterium sudah banyak diulas sebelumnya diantaranya oleh Sheng dan Citovsky (1996) dan Tinland (1996).
Hasil penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa T-DNA dapat dipisahkan secara fisik dari gen virulen menjadi dua plasmid yang terpisah yang kemudian dikenal dengan sistim biner (Hoekema et al. 1984). Sifat onkogenik tetap terpelihara selama kedua plasmid berada di dalam Agrobacterium yang sama. Selanjutnya setiap DNA asing yang disisipkan ke dalam T-DNA dapat ditransfer ke dalam sel tanaman. Hal ini sangat menguntungkan karena plasmid lebih kecil dan mudah dimanipulasi. Selanjutnya onkogen dapat dihilangkan dari T-DNA agar tanaman tumbuh normal, dan situs restriksi unik ditambahkan untuk memudahkan penyisipan gen asing (Riva et al. 1998; Lee & Gelvin 2008).
dipelajari, diantaranya pengaruh genotipe tanaman, strain Agrobacterium, plasmid, senyawa penginduksi gen virulen (vir), komposisi media, dan jaringan yang digunakan (Opabode 2006). Faktor lain yang juga penting menentukan keberhasilan transformasi tanaman adalah perlakuan osmotik pada eksplan, lama ko-kultivasi, kerapatan A. tumefaciens, pengeringan eksplan, perlakuan antinekrotik, suhu selama ko-kultivasi, penambahan surfaktan, media inokulasi dan ko-kultur, antibiotik dan agen penyeleksi yang digunakan. Saat ini transformasi tanaman padi Japonica sangat mudah dilakukan dengan efisiensi transformasi yang tinggi. Selanjutnya protokol transformasi untuk tanaman padi Indica juga sudah tersedia (Toki 1997; Saharan et al. 2004; Lin & Zhang 2005; Hiei & Komari 2006). Sejumlah sifat agronomi penting telah ditransformasi ke dalam genom tanaman padi dengan bantuan Agrobacterium untuk meningkatkan ketahanan cekaman biotik dan abiotik, dan meningkatkan kualitas nutrisinya (Roy et al. 2000).
Higga saat ini Agrobacterium masih dianggap sebagai satu-satunya genus bakteri yang mampu melakukan transfer gen ke dalam genom tanaman dan digunakan secara luas pada tanaman termasuk padi. Namun, kebanyakan teknologi yang terlibat di dalamnya dilindungi oleh paten di berbagai belahan dunia, yang kebanyakan dipegang oleh perusahaan multi nasional. Hal ini dapat menjadi kendala dalam pemanfaatan teknik ini untuk pemuliaan tanaman (Jambresic 2005), sehingga ada upaya untuk mencari bakteri alternatif selain Agrobacterium.
25
Ensifer/Shinorhizobium, dan Bradyrhizobium. Semua masuk dalam famili Rhizobiaceae.
Proses transfer gen yang terjadi pada Rhizobia hasil rekayasa adalah dengan melibatkan gen virulen dan T-DNA dari Agrobacterium (Broothaerts et al. 2005). Ti plasmid dimodifikasi sehingga lebih mudah dimobilisasikan ke
berbagai genus Rhizobia termasuk Rhizobium, Sinorhizobium dan
Mesorhizobium. Bakteri ini kemudian diuji dengan mentransformasikannya ke tiga tanaman model dari latar belakang genetika yang berbeda, yaitu padi, tembakau dan Arabidopsis. Ketiga spesies ini mampu melakukan transfer gen pada ketiga tanaman model meskipun dengan efisiensi yang rendah. Efisiensi transformasi padi dengan S. meliloti hanya 0.6% berdasarkan uji GUS
dibandingkan dengan 50-80% menggunakan Agrobacterium. Optimasi
TUMEFACIENS DAN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan teknik transformasi Rhizobium dengan teknik transformasi yang paling banyak digunakan saat ini, yaitu transformasi Agrobacterium, pada tiga kultivar padi Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), and Rojolele (Javanica). Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) diko-kultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pCAMBIA 5106. Plasmid pCAMBIA 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Hasil penelitian menunjukkan bahwa efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05%
dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R.
leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetika pada tanaman T0 dan T1.
Kata Kunci: Rhizobium leguminosarum, padi, embrio padi masak susu, Agrobacterium tumefaciens
Abstract
This study was aimed to study the effectiveness of Rhizobium
transformation system compared to the most widely used Agrobacterium mediated transformation system on three rice cultivars, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), and Rojolele (Javanica). Six day old calli induced from immature embryos were inoculated with Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288that harbored with pCAMBIA 5106. pCAMBIA 5106 is a cointegrate plasmid that contains a minimum set of transfer machinery genes and had a GUSPlus and an hpt gene driven by 35S CaMV promoter in the T-DNA. The results showed that the transformation frequencies (number of PCR positive plants per number of calli inoculated) ranging from 1,14 to 12.05 % depend on the genotype and transfer agent used. The highest transformation and regeneration frequency (12.05% and 59.38% respectively) was obtained in Ciherang transformed with R. leguminosarum. Most of the transgenic rice obtained by Rhizobium transformation were normal in
morphology and fertile similar to those obtained by Agrobacterium
transformation. Integration, expression and inheritance of transgenes were demonstrated by molecular and genetic analysis in T0 and T1 generations.
28
Pendahuluan
Transformasi Agrobacterium adalah teknik yang paling banyak digunakan saat ini karena memberikan peluang yang tinggi untuk memperoleh tanaman dengan salinan gen tunggal. Tanaman transgenik yang memiliki satu salinan gen sangat penting untuk memudahkan analisis fungsi gen. Namun, metode transformasi dengan Agrobacterium pada tanaman dilindungi oleh ratusan paten di berbagai belahan dunia (Rodriguez & Nottenburg 2003; Chilton 2005; Nottenburg & Rodriguez 2007). Paten-paten ini umumnya dipegang oleh perusahaan multinasional, sehingga menghambat pemanfaatan teknologi ini untuk pengembangan pertanian terutama bagi negara-negara berkembang. Oleh karena itu, untuk menghindari paten pada metode transformasi Agrobacterium, penggunaan bakteri selain Agrobacterium akan sangat membantu upaya perbaikan genetika tanaman di masa mendatang.
Keberhasilan penggunaan bakteri selain Agrobacterium (Rhizobium spp NGR234, Shinorhizobium meliloti, dan Mesorhizobium loti) sebagai agen transformasi untuk pertama kalinya dilaporkan oleh Broothaerts et al. (2005) pada tanaman model Arabidopsis thaliana, tembakau, dan padi dengan efisiensi transformasi yang rendah. Wendt et al. (2010) melaporkan keberhasilan ketiga Rhizobia ini melakukan transfer gen pada tanaman kentang dengan efisiensi transformasi bervariasi antara 1,86-5,85%. Rhizobia sudah lama dikenal berinteraksi dengan tanaman. Rhizobia adalah sekelompok bakteri tanah yang membentuk suatu simbiosis mutualisme berupa nodul atau bintil akar untuk mengikat nitrogen (N2) bebas dari udara dan mengubahnya menjadi ammonia (NH4) dan ion nitrat (NO3-)yang berguna untuk tanaman. Bakteri simbiotik ini telah direkayasa untuk membuat mereka mampu melakukan transfer gen.
menggunakan S. meliloti, misalnya, hanya 0,6% (dibandingkan dengan 50-80% dengan Agrobacterium). Perbaikan faktor–faktor yang mempengaruhi keberhasilan transfer dan integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman, seperti: eksplan, vektor-plasmid, strain bakteri, senyawa fenolik sintetik penginduksi gen virulen, komposisi media kultur, eliminasi bakteri pasca infeksi, dan pengeringan eksplan (Roy et al. 2000; Opabode 2006), mungkin dapat meningkatkan efisiensi transformasi. Efisiensi transformasi Agrobacterium yang rendah pada banyak jenis tanaman yang sulit ditransformasi meningkat secara substansial selama 20 tahun terakhir dengan memanipulasi faktor-faktor tersebut (Gelvin 2005).
Pada penelitian ini dua sistim transformasi, yaitu Agrobacterium dan Rhizobium, dibandingkan. Penelitian ini dimaksudkan untuk mengevaluasi efisiensi Rhizobium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman padi dan membandingkannya dengan Agrobacterium tumefaciens. Untuk tujuan tersebut penelitian ini difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masing-masing sistem, ekspresi gen target, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan penampilan morfologi dan fertilitas tanaman.
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman dan Induksi Kalus
30
Strain Bakteri dan Plasmid
Agrobacterium tumefaciens LBA288 (pCAMBIA5106), Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 (pCAMBIA5106), dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 (pCAMBIA0105), diperoleh dari CAMBIA Australia. Agrobacterium tumefaciens strain LBA288 adalah strain avirulen yang tidak memiliki plasmid Ti. Plasmid pCAMBIA0105 adalah plasmid biner yang memiliki gen GUSPlus dan hpt di dalam T-DNA. Agrobacterium tumefaciens LBA288 membawa vektor pCAMBIA0105 digunakan sebagai kontrol negatif untuk transfer DNA. Plasmid pCAMBIA 5106 adalah plasmid cointegratif yang memiliki satu set minimum gen vir dan T-DNA. Pada daerah T-DNA terdapat gen pelapor GUSPlus yang memiliki intron, dan gen penyeleksi hpt (Gambar 3).
Transformasi dan Regenerasi
Transformasi dan regenerasi kalus Ciherang dilakukan mengikuti Hiei dan Komari (2006) dengan beberapa modifikasi. Sedangkan transformasi dan regenerasi Rojolele dan Nipponbare dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Slamet-Loedin et al. (1996) dan Hiei et al. (1994) dengan beberapa modifikasi. Agrobacterium atau Rhizobium dibiakkan selama 3 hari pada media LB atau YM yang mengandung antibiotik rifampisin 20 mgL-1 dan kanamisin 50 mgL-1, pada suhu 28 oC. Bakteri disuspensi dalam media infeksi R2 yang mengandung 0,5 mM acetosyringone hingga mencapai OD600 0,275. Setiap kalus ditetesi 5μl suspensi bakteri selanjutnya disimpan pada kondisi gelap. Enam hari kemudian kalus dipindahkan ke media seleksi yang sesuai mengandung higromisin 50 mgL-1 dan antibiotik cefotaksim 100 mgL-1 dan timentin 150 mgL-1 (Tabel 4). Kalus tahan higromisin diregenerasikan pada media regenerasi yang sesuai (Tabel 4). Planlet dipindahkan ke media ½MS yang diperkaya dengan 1 mgL-1 NAA untuk memperbaiki perakaran.
Uji GUS
Gambar 3 T-DNA di dalam pCAMBIA 5106. Sepasang primer, forward (FP) and reverse (RP), digunakan untuk memperbanyak daerah penyandi gen hpt. Produk PCR (P) digunakan sebagai pelacak pada analisis Southern.
Uji Higromisin
Dari setiap tanaman yang diuji dipilih satu daun hijau dan sehat. Untuk keseragaman dipilih daun yang paling muda yang telah membuka sempurna. Daun ditandai dengan membuat 3 garis menggunakan spidol tahan air. Sebanyak 5 µl larutan higromisin (0,2 mgml-1 higromisin B, 0,5% gelatin, 0,001% triton-X) diteteskan pada setiap garis, dua garis (ulangan) setiap daun. Reaksi tanpa higromisin digunakan sebagai kontrol. Pengamatan dilakukan pada hari keempat setelah penetesan. Daun dengan gejala nekrotik mengindikasikan tanaman tidak mengekspresikan higromisin phosphotransferase, sehingga tidak mampu mendetoksifikasi higromisin B. Daun yang tetap hijau, sebaliknya, mengindikasikan tanaman mengekspresikan higromisin phosphotransferase.
PCR
DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al.
(2000). Sepasang primer, forward 5'-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3 'dan
32
Tabel 4 Media yang digunakan untuk transformasi tiga varietas padi (Ciherang, Nipponbare, dan Rojolele).
Tujuan Varietas Media Komposisi
Induksi kalus
Rojolele LS MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8
Nipponbare NB1 N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,3 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 L-prolin, 0,5 gl-1 L-glutamin, 30
Rojolele LS MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 0,1 mM acetosyringone, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,2
Nipponbare R2-As R2 garam mayor, R2 garam minor, LS vitamin, 10 gl-1 D-glukosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 0,1 mM acetosyringone, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,2
Ciherang NB-As N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 prolin, 20 gl-1 sukrosa, 10 gl-1 D-glukosa, 2 mgl-1 2,4-D, 1 mgl-1 NAA, 1 mgl-1 BAP, 0,1 mM acetosyringone, 5,5 gl-1 agarose type I, pH 5,2
Seleksi Rojolele LS MS garam mayor, MS garam minor, LS vitamin, 30 gl-1 sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 100 mgl-1 higromisin, 100 mgl-1 cefotaxime, 150 mgl-1 timentin, 2,5 gl-1 phytagel, pH 5,8 Nipponbare R2 R2 garam mayor, R2 garam minor, LS vitamin, 30 gl-1
sukrosa, 2,5 mgl-1 2,4-D, 50 mgl-1 higromisin, 100 mgl-1 cefotaxime, 150 mgl-1 timentin, 2.5 gl-1 phytagel, pH 6,0 Ciherang NBM N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1
casamino acids, 0,5 gl-1 prolin, 0,3 gl-1 L-glutamin, 20 gl
-Ciherang NBPR N6 garam mayor, B5 garam minor, B5 vitamin, 0,5 gl-1 casamino acids, 0,5 gl-1 L-prolin, 0,3 gl-1 L-glutamin, 30
