PERSILANGANNYA DENGAN METODE PCR-SSCP
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Kambing
Kambing diklasifikasikan kedalam kingdom Animalia; phylum Chordata; subphylum Vertebrata; class Mamalia; ordo Artiodactyla; sub-ordo Ruminantia; family Bovidae; sub family Caprinae dan genus Capra (Mileski, 2004). Kambing (Capra hircus) memiliki 60 kromosom (30 pasang kromosom) yang terdiri dari 29 pasang kromosom autosom dan sepasang kromosom kelamin (Gall, 1981).
Penyebaran kambing sangat luas dan hampir menyebar di seluruh dunia. Hal ini disebabkan, kambing memiliki daya adaptasi yang baik terhadap berbagai iklim dan kemampuannya bertahan hidup pada daerah dengan hijauan terbatas (Gall, 1981). Kambing merupakan ternak yang dapat hidup di daerah kering dan daerah dengan hijauan pakan yang mungkin tidak disukai oleh ternak lain, serta dapat memanfaatkan hijauan pakan secara efisien (Devendra dan Burns, 1994).
Kambing Lokal Indonesia
Kambing Marica yang terdapat di Propinsi Sulawesi Selatan merupakan salah satu genotipe kambing asli Indonesia yang menurut laporan FAO sudah termasuk kategori langka dan hampir punah (endangered). Kambing Marica mempunyai potensi genetik yang mampu beradaptasi baik di daerah agro-ekosistem lahan kering, yaitu daerah dengan curah hujan sepanjang tahun sangat rendah. Kambing Marica dapat bertahan hidup pada musim kemarau walau hanya memakan rumput-rumput kering di daerah tanah berbatu-batu (Pamungkas et al., 2009).
Kambing Samosir dipelihara penduduk setempat secara turun temurun di Pulau Samosir, di tengah Danau Toba, Kabupaten Samosir, Propinsi Sumatera Utara. Bobot badan kambing Samosir ini lebih besar jika dibandingkan dengan kambing Marica, atau hampir sama besarnya dengan kambing Kacang, tetapi ciri khas yang paling menonjol adalah warna rambut putihnya sangat dominan. Warna tanduk dan kukunya juga agak keputihan. Kambing Samosir ini bisa menyesuaikan diri dengan kondisi ekosistem lahan kering dan berbatu-batu, walaupun pada musim kemarau biasanya rumput sangat sulit dan kering. Kondisi pulau Samosir yang topografinya berbukit, ternyata kambing ini dapat beradaptasi dan berkembangbiak dengan baik (Pamungkaset al., 2009).
Kambing Muara dijumpai di daerah Kecamatan Muara, Kabupaten Tapanuli Utara di Propinsi Sumatera Utara. Penampilan kambing ini gagah, tubuh kompak dan sebaran warna rambut bervariasi antara warna rambut coklat kemerahan, putih dan ada juga yang berwarna rambut hitam. Bobot kambing Muara lebih besar dibandingkan dengan kambing Kacang dan diduga kambing prolifik (Pamungkas et al., 2009).
Kambing Kosta terdapat di sekitar Jakarta dan Propinsi Banten (Setiadi dan Sutama, 1987). Kambing ini dilaporkan mempunyai bentuk tubuh sedang, hidung rata dan kadang-kadang ada yang melengkung, tanduk pendek dan berambut pendek. Kambing ini diduga terbentuk dari persilangan kambing Kacang dengan salah satu rumpun kambing impor (Khasmir/Angora/Etawah) (Pamungkaset al., 2009).
Kambing Gembrong terdapat di daerah kawasan Timur Pulau Bali terutama di Kabupaten Karangasem. Ciri khas dari kambing ini adalah berambut panjang. Panjang rambut berkisar 15-25 cm, bahkan rambut pada bagian kepala sampai menutupi muka dan telinga. Rambut panjang terdapat pada kambing jantan, sedangkan kambing Gembrong betina berambut pendek berkisar 2-3 cm (Pamungkas
et al., 2009).
Kambing Kacang merupakan kambing asli Indonesia juga didapati di Malaysia dan Filipina. Kambing Kacang sangat cepat berkembangbiak, pada umur 15-18 bulan sudah bisa menghasilkan keturunan. Kambing ini cocok sebagai penghasil daging dan kulit, bersifat prolifik, tahan terhadap berbagai kondisi dan mampu beradaptasi dengan baik di berbagai lingkungan yang berbeda termasuk dalam kondisi pemeliharaan yang sangat sederhana. Ciri-ciri kambing Kacang adalah antara lain rambut pendek dan berwarna tunggal (putih, hitam dan coklat) (Pamungkaset al., 2009).
Kambing Benggala secara umum lebih besar daripada kambing Kacang, umumnya didominasi warna hitam dan yang sedikit berwarna kecoklatan. Ciri khas dari kambing ini antara lain: Bentuk telinga sedang, lurus ke samping dan kira-kira sepertiga bagian ujung telinga jatuh seperti patah di ujung, garis muka lurus tidak cembung seperti Peranakan Etawah (PE), garis punggung lurus, rambut sedang menutup semua permukaan kulit tetapi tidak panjang atau tebal, penampilan sedang,
5
Kambing Peranakan Etawah (PE)
Salah satu jenis kambing perah di daerah tropis khususnya di Indonesia adalah kambing Peranakan Etawah. Kambing PE merupakan hasil persilangan antara kambing Etawah dan kambing lokal Indonesia. Disamping sebagai ternak penghasil susu, pejantan kambing PE juga dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan potensi produksi susu kambing lokal Indonesia lainnya dengan inseminasi buatan (IB) (Souhokaet al., 2009). Diharapkan dengan persilangan tersebut akan dihasilkan kambing yang mampu memproduksi susu dan daging cukup tinggi (dual purpose).
Kambing PE dapat menghasilkan daging dan susu (kambing tipe dwiguna). Kambing PE betina memiliki kemampuan menghasilkan susu yang cukup baik. Menurut Atabanyet al. (2001), produksi susu kambing PE adalah 0,99 kg/ekor/hari. Rataan bobot lahir kambing PE kelahiran tunggal betina 3,2 kg, jantan 3,7 kg (Setiadi dan Sutama, 1997).
Ciri khas kambing PE antara lain bentuk muka cembung melengkung dan dagu berjanggut, terdapat gelambir di bawah leher yang tumbuh berawal dari sudut janggut, telinga panjang, lembek menggantung dan ujungnya agak berlipat, ujung tanduk agak melengkung, tubuh tinggi, pipih, bentuk garis punggung mengombak ke belakang, rambut tumbuh panjang di bagian leher, pundak, punggung dan paha, bulu paha panjang dan tebal. Warna rambut ada yang tunggal; putih, hitam dan coklat, tetapi jarang ditemukan. Kebanyakan terdiri dari dua atau tiga pola warna, yaitu belang hitam, belang coklat dan putih bertotol hitam (Pamungkaset al., 2009).
Kambing Saanen
Kambing Saanen berasal dari Swiss Barat. Kambing ini berwarna putih, krem pucat atau coklat muda dengan bercak hitam pada hidung, telinga dan ambing. Kambing ini berambut pendek dan telinganya agak tegak serta mengarah ke depan. Kambing Saanen memiliki rataan produksi susu tertinggi dibanding bangsa kambing lainnya (Devendra dan Burns, 1994). Kambing Saanen memiliki rataan produksi susu 216 kg dengan panjang laktasi 275 hari (Gall, 1981). Menurut Devendra dan Burns (1994), kambing Saanen memiliki rataan hasil susu harian sebanyak 1,06 kg/ekor/hari. Kambing Saanen biasanya dipelihara dan diberi pakan dalam kandang.
Kambing Saanen sangat peka terhadap sinar matahari sehingga menyebabkan kambing ini sulit berkembang secara baik di daerah tropis. Kambing Saanen
merupakan kambing yang tidak memiliki tanduk. Kambing Saanen memiliki tubuh dengan konformasi tipe perah yang baik dan ambing yang berkembang baik pula. Jumlah anak lahir seperindukan 1,80 ekor (Devendra dan Burns, 1994). Rataan berat badan kambing betina dan jantan Saanen adalah 65 dan 75 kg (Devendra dan McLeroy, 1982).
Kambing PESA (Persilangan Peranakan Etawah dengan Saanen)
Kambing PESA merupakan kambing hasil persilangan antara kambing Peranakan Etawah (PE) betina dengan kambing Saanen jantan. Kambing PESA memiliki produksi susu harian yang lebih baik daripada Peranakan Etawah tetapi produksinya lebih rendah daripada kambing Saanen. Hal ini dibuktikan dengan produksi susu harian dari kambing Saanen (F1) dan PESA di PT. Taurus Dairy Farm masing-masing sebanyak 1,19 dan 1,12 kg/ekor/hari (Ruhimat, 2003).
Protein Susu
Susu merupakan sumber makanan alami bagi hewan mamalia yang baru dilahirkan. Produksi susu merupakan salah satu dari sifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak pasangan gen yang aksinya bersifat aditif (Velmalaet al., 1999). Produksi susu dalam satu spesies sangat dipengaruhi oleh bangsa, umur, nutrisi, kesehatan, musim dan lain-lain (Fox dan Mc Sweeney, 1998). Susu dari ternak terdiri dari sebagian air yang terlarut pada protein, gula susu (laktosa), mineral dan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Protein susu secara umum dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu kasein dan whey (Buckle et al., 1987). Kasein adalah protein yang bermutu tinggi karena mengandung semua asam-asam amino esensial. Kasein terdapat dalam bentuk partikel koloid yang disebut casein micelle. Kasein merupakan jenis protein terpenting dalam susu dan terdapat dalam bentuk kalsium kaseinat (Rahman et al., 1992). Rasio antara kasein dan whey dalam susu sapi, kerbau, kambing dan domba adalah 80:20 (Fox dan Mc Sweeney, 1998). Kasein dalam susu terdiri dari tiga fraksi yang berbeda yaitu α-kasein, β-kasein dan κ-kasein. Tiap fraksi mengambil bagian berturut-turut sekitar 75, 22 dan 3% (Rahman et al., 1992). Konsentrasi protein pada susu ternak ruminansia disajikan dalam Tabel 1.
7 Tabel 1. Komposisi Protein Susu Ternak Ruminansia
Jenis Protein Sapi Domba Kambing
Kasein ---g/l--- αs1-kasein 10 7 7 αs2-kasein 3,7 7 4 β-kasein 3,5 3,5 6 κ-kasein 10 8 10 Whey α-lactalbumin 1,2 0,8-2,4 1,2 β-lactoglobulin 3,3 2.8-5 2,3 Serum Albumin 0,4
Lysozyme Trace Trace
Lactoferin 0,1 0,1
Immunoglobulin 0,7 0,5
Sumber: Martin dan Grosclaude (1993)
β-Kasein
β-kasein adalah bagian yang paling hidrofobik dari kasein dan mengandung sejumlah besar prolin residu, memiliki ujung terminal hidrofilik C dan akhir terminal hidrofobik N (Creamer, 2003). β-kasein terdiri dari 209 asam amino (Martin et al., 2003), dan memiliki massa molekul 24,0 kDa (kilo Dalton) (Creamer, 2003); mengandung lima kelompok phosphoseryl. β-kasein terkandung sekitar 60% dari total kasein dalam susu kambing (Trujilloet al., 1997).
Keragaman Genβ-Kasein
Gen β-kasein merupakan gen yang berpengaruh terhadap produksi susu, persentase protein dan hasil protein (Bovenhuis et al., 1992). Gen β-kasein secara langsung berkaitan dengan kualitas dan sifat susu (Sztankóováet al., 2005). Namun, dalam penelitian Moatsouet al. (2008), genotipeβ-kasein tidak berhubungan dengan kandunganβ-kasein dalam susu.
Gen kasein pada sapi terdiri atas empat kelompok gen, yaituαS1-kasein, αS2- kasein, β-kasein dan κ-kasein (Braunschweig, 2008). Menurut Kucerova et al.
(2006), gen protein susu terdiri αs1-kasein (CSN1S1), β-kasein (CSN2), κ-kasein (CSN3) dan β-lactoglobulin (LGB). Polimorfisme gen-gen kasein yang tinggi berpengaruh langsung terhadap produksi dan komposisi susu sapi perah (Ng-Kwai- Hanget al., 1986).
Menurut Bovenhuiset al. (1992), genotipeβ-kasein sapi adalah A1A1, A1A2, A2 A2, A1 B, B B, A1 A3, A2 A3, dan A3 B. Selanjutnya Chessa et al. (2005) mengemukakan bahwa variasi genetik β-kasein kambing pada ekson 7 adalah
CSN2*A, CSN2*C dan CSN2*0’. Hasil frekuensi alel gen CSN2 menurut Chessa et al. (2005) disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Frekuensi Alel GenCSN2dengan Metode SSCP
Jenis N Alel Gen CSN2
A C 0’ Saanen 76 0,507 0,493 ….. Camosciata 112 0,317 0,683 ….. Jonica 70 0,207 0,700 0,093 Garganica 33 0,242 0,712 0,046 Maltese 58 0,129 0,819 0,052 Cilentana 43 0,035 0,872 0,093 Orobica 81 0,025 0,975 ….. Sumber: Chessaet al. (2005)
Gen adalah bagian segmen DNA termasuk semua nukleotida yang ditranskripsi kedalam mRNA yang akan ditranslasi menjadi protein (Nicholas, 1996; Brown; 1999; Muladno, 2002). Bagian gen yang mengkode asam amino dan menghasilkan protein disebut daerah penyandi (coding sequence) (CDS). Selain itu terdapat pula bagian segmen depan (leader segment) dan segmen belakang (trailer segment) yang mengapit daerah CDS. Beberapa gen pada eukaryot bersifat tidak kontinyu karena adanya exon (pengkode protein) dan intron (space internal antara pengkode protein). Pada saat transkripsi, bagian intron hilang (splicing), sehingga proses translasi berjalan baik (Brown, 1999). Gen β-kasein memiliki kode yang terdiri dari delapan intron dan sembilan ekson pada semua spesies (Wang et al., 2001). Struktur genβ-kasein disajikan pada Gambar 1.
9
I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9
Flanking region 5’ flanking region 3’
Keterangan : Lokus = AF409096 Panjang = 13671 bp Gen = 4546-4593, 6588-6650, 7384-7410, 7523-7549, 9896-9919, 10016-10057, 11387 -11881, 12464-12505, 13233-13555 Sekuen depan = 4545 = 4545 bp
Ekson 1 (E1) = 4546-4593 = 47 bp Intron 1 (I1) = 4594 -6587 = 1993 bp Ekson 2 (E2) = 6588-6650 = 62 bp Intron 2 (I2) = 6651 -7383 = 732 bp Ekson 3 (E3) = 7384-7410 = 26 bp Intron 3 (I3) = 7411 -7522 = 111 bp Ekson 4 (E4) = 7523-7549 = 26 bp Intron 4 (I4) = 7550 -9895 = 2345 bp Ekson 5 (E5) = 9896-9919 = 23 bp Intron 5 (I5) = 9920 -10015 = 95 bp Ekson 6 (E6) = 10016-10057 = 41 bp Intron 6 (I6) = 10058 -11386 = 1328 bp Ekson 7 (E7) = 11387-11881 = 484 bp Intron 7 (I7) = 11882 -12463 = 581 bp Ekson 8 (E8) = 12464-12505 = 41 bp Intron 8 (I8) = 12506 -13232 = 726 bp
Ekson 9 (E9) = 13233-13555 = 322 bp
Gambar 1. Rekonstruksi Struktur Genβ-Kasein Berdasarkan Sekuens Genβ-Kasein diGenBank (Kode Akses AF409096)
Sumber: Wanget al. (2001)
Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism
(PCR-SSCP)
Metode ini merupakan pemisahan asam nukleat rantai tunggal (single stranded nucleic acids) hasil amplifikasi PCR dengan elektroforesis melalui gel poliakrilamid dan berdasarkan pada perbedaan berat model pasangan basa, sehingga dapat menghasilkan perbedaan struktur sekunder gen. Suatu metode sederhana yang dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi DNA yang disebut dengan PCR-SSCP (Oritaet al., 1989).
Prinsip yang mendasari metode analisis SSCP adalah perubahan asam nukleotida yang akan mempengaruhi bentuk dari fragmen DNA untai tunggal (Bastos et al., 2001) akan menyebabkan pola migrasi pada saat elektroforesis dalam gel poliakrilamida (Baroso et al., 1999) walaupun perbedaannya hanya satu nukleotida saja (Nataraj et al., 1999). Metode analisis SSCP meliputi beberapa tahapan yaitu amplifikasi DNA target menggunakan primer melalui PCR, tahap denaturasi DNA produk PCR pada suhu 94 oC yang diikuti pendinginan untuk mencegah pre-annealing dari untaian DNA, penambahanformamida dye dan tahap
elektroforesis dalam gel poliakrilamida nondenaturasi (Natarajet al., 1999 ; Hidayat
et al., 2010).
Faktor-faktor yang mempengaruhi sensitivitas SSCP yaitu: (1) Komposisi gel, ukuran fragmen DNA, konsentrasi DNA, dan kandungan basa G dan C dalam fragmen DNA (Nataraj et al., 1999); (2) Komposisi buffer (termasuk kekuatan ion dan derajat keasaman,bufferaditif seperti gliserol dan suhu pada saat elektroforesis (Sheffieldet al., 1993 dan Natarajet al., 1999); (3) Persentase Akrilamida dan rasio
bis (Sheffield et al., 1993); (4) Lokasi mutasi pada fragmen DNA (Baroso et al., 1999); dan (5) Kelebihan dNTP dan primer dalam reaksi PCR.
Kelebihan metode PCR-SSCP dibanding metode lain yaitu: (1) sederhana dan tidak memerlukan peralatan yang rumit dan khusus (Bastos et al., 2001; Nataraj et al., 1999), (2) dapat mendeteksi adanya mutasi pada fragmen DNA (Baroso et al., 1999) sehingga dapat dibedakan dengan yang normal (Nataraj et al., 1999), (3) visualisasi tidak perlu menggunakan bahan radioaktif (Nataraj et al., 1999), dan (4) dapat dikerjakan di laboratorium biasa dan tidak terlalu mahal (Bastoset al.,2001).
Kekurangan PCR-SSCP yaitu ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis terbatas, butuh kondisi yang beragam untuk mendeteksi semua kemungkinan mutasi, kadang-kadang sulit untuk menginterpretasikan pita-pita yang dihasilkan dan tidak efisien untuk fragmen DNA yang tidak diketahui urutan nukloetidanya (Nataraj et al., 1999).
Menurut Gasser et al. (2006), konformasi dalam metode SSCP dipengaruhi oleh panjang fragmen, urutan, lokasi, dan jumlah wilayah pasangan basa. Oleh karena itu, mutasi pada posisi nukleotida tertentu dalam urutan primer dapat mengubah konformasi molekul. Ketika dipisahkan dalam gel non-denaturing, molekul berbeda dengan nukleotida tunggal bisa dilihat, mengingat perubahan dalam mobilitas.
Pewarnaan Perak (Silver Staining)
Pewarnaan perak protein dalam gel poliakrilamida telah digunakan untuk berbagai macam analisis fisik dan biologis. Baru-baru ini, telah diterapkan untuk mendeteksi asam nukleat dalam gel poliakrilamida sebagai pengikat ion perak ke dasar dan kemudian secara selektif dikurangi dalam formaldehida dalam kondisi
11 alkali. Pewarnaan perak terhadap asam nukleat secara luas digunakan untuk mendeteksi DNA dalam metode PCR-SSCP (Byunet al., 2009).
Hukum Keseimbangan Hardy-Weinberg
Hukum Hardy-Weinberg menyatakan bahwa frekuensi genotipe suatu populasi yang cukup besar tidak akan berubah dari satu generasi ke generasi lainnya jika tidak ada seleksi, migrasi, mutasi, dan genetic drift (Noor, 2008). Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa populasi dinilai beragam jika memiliki dua atau lebih alel dalam satu lokus dengan frekuensi yang cukup (biasanya lebih dari 1%). Tingkat keragaman dalam populasi dapat digambarkan dari frekuensi alel. Frekuensi alel merupakan rasio relatif suatu alel terhadap keseluruhan alel yang ditemukan dalam suatu populasi (Nei dan Kumar, 2000).
MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan, yaitu mulai bulan November 2010 sampai April 2011. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi
Sampel Darah dan Bahan Ekstraksi DNA
Sampel darah kambing betina yang digunakan berjumlah 173 sampel terdiri dari kambing Saanen (77 sampel), kambing PE (67 sampel) dan kambing PESA (Persilangan kambing PE dan Saanen) (29 sampel). Sampel tersebut merupakan sampel darah koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengekstraksi DNA adalah TE (Tris EDTA), STE (Sodium Tris- EDTA), NaCl, SDS, CIAA (kloroform isoamil alkohol) dan etanol. Identitas sampel darah serta rincian sampel per lokasi disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Identitas Sampel Darah
Jenis Kambing Lokasi Jumlah Sampel
Peranakan Etawah Ciapus 16
Cariu 21
Sukajaya/ Elang 45 40
Saanen Cijeruk 19
Cariu 23
PT Taurus Dairy Farm 25
PESA Cariu 14
Balitnak 15
Polymerase Chain Reaction(PCR)
Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi genβ-kasein adalah primer forward: 5’-CCC AAA GTG AAG GAG ACT ATG-3’ dan primer reverse: 5’-CAT CAG AAG TTA AAC AGC ACA G-3’ (Chessa et al., 2005). Panjang
13 (Gambar 2). Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan mesinthermocycler, tabung PCR, mikropipet, vortex dan alat sentrifugasi.
11521 ccttcagcct gaaataatgg gagtccccaa agtgaaggag actatggttc ctaagcacaa 11581 agaaatgccc ttccctaaat atccagttga gccctttact gaaagccaga gcctgactct 11641 cactgatgtt gaaaagctgc accttcctct gcctctggtc cagtcttgga tgcaccagcc 11701 tccccagcct ctttctccaa ccgtcatgtt tcctcctcag tccgtgctgt ccctttctca 11761 gcccaaagtt ctgcctgttc cccagaaagt agtgccccag agagatatgc ccatccaggc 11821 ctttctgctg taccaggagc ctgtacttgg tcctgtccgg ggacccttcc ctattcttgt 11881 aagtctaaat ttactaactg tgctgtttaa cttctgatgt ttgtatgata tttgagtaat Keterangan: huruf tebal dan garis bawah merupakan situs primer
Gambar 2. Sekuens Primer GenCSN2pada Kambing Sumber: Wanget al. (2001)
Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism
(PCR-SSCP)
Bahan-bahan yang diperlukan dalam Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) adalah produk PCR dan
formamida dye. Alat yang digunakan adalah water bath, ice bath, refrigerator, Bio- Rad dan sentrifuse .
Formamida Dye
Komponenformamida dyeterdiri dari 80%formamida solution, 10 µl EDTA, 1 mg/mlbromthymol blue dan 1 mg/mlxylene cyanol.
Polyacrilamide Gel Elektroforesis(PAGE) 10%
Komponen Gel Polyakrilamida 10% terdiri dari 8,3 ml larutan 30% akrilamida (acrylamide : bisacrylamide =29 : 1); 2,5 ml larutan 5 x TBE (tris boric acid-EDTA); 15 µl TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine); 150 µl 10% APS (ammonium peroxodisulfat) dan 14 ml air destilasi. Alat-alat yang digunakan adalah plat kaca cetakan gel berukuran 20 x 20 cm2, pipet mikro dan makro.
Pewarnaan Perak (Silver Staining)
Bahan-bahan yang digunakan dalam pewarnaan perak adalah AgNO3, NaOH,
Prosedur
Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah diambil dari kambing pada vena jugularis di leher menggunakan tabungvaccutainer yang mengandung antikoagulan. Sampel tersebut kemudian disimpan dalam termos es dan suhunya dipertahankan sekitar 4oC.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode Sambrooket al. (1989) yang telah dimodifikasi (Lampiran 2).
Amplifikasi DNA
Campuran untuk mengamplifikasi DNA dalam mesin PCR terdiri dari 1 µl sampel DNA; 0,1 μl Primer; 0,1μl dNTP; 1 μl MgCl2; 1,25 μl DreamTaq Buffer;
0,05 μl Taq dan 8,5 μl air destilasi untuk volume akhir 12 µl. Proses amplifikasi terjadi dalam 30 siklus terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94oC selama 5 menit, denaturasi akhir pada suhu 94oC selama 30 detik, penempelan primer (anneling) pada suhu 60 oC selama 45 detik, pemanjangan DNA (ekstensi awal) pada suhu 72 oC selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Hasil amplifikasi DNA dianalisis dengan elektroforesis.
Pendeteksian Keragaman Genβ-Kasein dengan Metode PCR-SSCP
Produk PCR gen β-kasein sebanyak 5 µl disuspensikan dalam larutan
formamida dye sebanyak 5 µl, kemudian diinkubasi dalam water bath pada suhu 95 oC selama 7 menit. Setelah itu, segera didinginkan dengan ice bath selama 2 menit. Konformasi untai DNA dideteksi menggunakan PAGE 10%. Alat elektroforesis diatur pada tegangan 350 V selama 20 jam pada suhu 4oC. Perbedaan konformasi disebabkan oleh adanya mutasi minimal satu basa sehingga terjadi perbedaan migrasi pada pita DNA.
Pewarnaan Perak
Pewarnaan perak dilakukan dengan cara merendam gel dalam larutan A (200 ml air destilasi, 0,20 g AgNO3, 80 µl 10 N NaOH dan 800 µl amonia) selama 8 menit
15 selanjutnya menggunakan larutan B (6 g NaOH, 200 ml air destilasi dan 200 µl formaldehid dipanaskan pada suhu 60 oC) sampai pita muncul. Bila muncul pita, larutan B dibuang kemudian gel direndam dalam larutan asam asetat (100 ml air destilasi dan 100 µl asam asetat) untuk menghentikan reduksi perak.
Penentuan Genotipe
Keragaman genotipe masing-masing individu ditentukan dari migrasi pita- pita DNA yang muncul pada gel poliakrilamida. Penentuan genotipe Kambing PE, Saanen dan PESA berdasarkan Chessa et al. (2005) yang dapat dilihat pada Gambar 3.
Analisis Data
Keterangan: (lingkaran:CSN2*A; bintang:CSN2*C; segitiga:CSN2*0’)
Gambar 3. Diagram Elektroforesis (Zymogram) untuk Alel CSN2*A, CSN2*C dan
CSN2*0’pada Genβ-Kasein Sumber: Chessaet al. (2005)
Analisis Data
Frekuensi Genotipe
Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari migrasi pita-pita DNA. Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Model matematika frekuensi genotipe (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
= frekuensi genotipe ke ii = jumlah sampel bergenotipe ii N = jumlah seluruh sampel
Frekuensi Alel
Frekuensi alel merupakan rasio relatif suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran (marker) yang sama dan pita-pita DNA hasil SSCP diidentifikasi kemudian hasil identifikasi dihitung frekuensi alelnya dengan merujuk pada rumus (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
Xi = frekuensi alel kei
nii= jumlah sampel yang bergenotipeii
nij= jumlah sampel yang bergenotipeij N = jumlah seluruh sampel
Hukum Keseimbangan Hardy-Weinberg
Pengujian nilai genotipe antara hasil pengamatan dan nilai harapan dapat diukur dengan menggunakan uji Chi-Kuadrat (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
χ2
= chi-kuadrat O = nilai pengamatan E = nilai harapan
∑ = sigma (jumlah dari nilai-nilai)
Suatu populasi dikatakan seimbang jika nilai χ2 yang didapatkan lebih kecil
daripada χ2 tabel pada selang kepercayaan 5% dan derajat bebas tertentu. Derajat bebas dihitung dengan rumus derajat bebas = genotipe – alel (Nei dan Kumar, 2000).
17
Heterozigositas
Tingkat keragaman genetik dalam sebuah populasi biasanya diukur dari rataan keanekaragaman gen, yang sering disebut rataan heterozigositas(Weir, 1996). Keragaman gen pada lokus dapat dilambangkan sebagai berikut:
Keterangan:
H = nilai heterozigositas
N1ij= jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Genβ-Kasein
Amplifikasi gen β-kasein ekson tujuh pada kambing PE, Saanen dan PESA (Persilangan PE dan Saanen) dilakukan menggunakan metode PCR dengan mesin
thermocycler (AB System). Pasangan primer yang digunakan mengikuti Cheesaet al. (2005). Suhu annealing adalah suhu yang memungkinkan terjadinya penempelan primer pada sekuen DNA sampel. Suhu anneling menjadi sangat penting dalam proses amplifikasi, hal itu disebabkan proses perpanjangan DNA baru dimulai dari primer. Suhu anneling yang digunakan dalam penelitian ini adalah 60 oC. Hasil amplifikasi genβ-kasein pada gel poliakrilamida 6% disajikan pada Gambar 4.
374 pb
300 pb
200 pb
100 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 M
Gambar 4. Hasil Amplifikasi Genβ-Kasein Menggunakan Metode PCR pada Gel Poliakrilamida 6% (M: Marker 100 pb)
Panjang fragmen gen β-kasein ekson tujuh hasil amplifikasi adalah 374 pb (Cheesaet al., 2005). Panjang fragmen hasil amplifikasi dapat diketahui dengan cara mencocokkan situs penempelan primer pada sekuen gen β-kasein ekson tujuh (GenBank No. Acc. AF409096).
Keragaman Genβ-Kasein
Keragaman gen β-kasein ekson tujuh dilakukan dengan metode polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). Dalam
19 nukleotida yang akan mempengaruhi bentuk dari fragmen DNA untai tunggal (Bastoset al., 2001) akan menyebabkan pola migrasi pada saat elektroforesis dalam gel poliakrilamida (Baroso et al., 1999) walaupun perbedaannya hanya satu nukleotida saja (Nataraj et al., 1999). Hasil pendeteksian keragaman gen β-kasein menggunakan metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 10% divisualisasikan pada