POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS (PAGE)
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Kuda
Kuda digolongkan ke dalam hewan dalam filum Chordata yaitu hewan yang bertulang belakang, kelas Mammalia yaitu hewan yang menyusui anaknya, ordo Perissodactyla yaitu hewan berteracak tak memamahbiak, famili Equidae, dan spesies Equus caballus. Para pakar percaya bahwa dahulu kala terdapat hewan prakuda dengan jari teracak jari kaki sebanyak lima buah disebut Paleohippus. Hewan tersebut kemudian berkembang dengan empat jari teracak dan satu penunjang (split), sedangkan kaki belakangnya terdiri atas tiga jari teracak dan satu split (Ehippus). Evolusi berlanjut dengan terbentuknya Mesohippus dan Meryhippus yang memiliki teracak kaki depan dan belakang sebanyak tiga buah. Pliohippus menjadi hewan teracak tunggal pertama yang selanjutnya berkembang menjadi kuda saat ini (Equus caballus) (Blakely dan Blade, 1991).
Populasi kuda di seluruh dunia mencapai 62 juta ekor, yang terdiri dari 500 ratus bangsa, tipe dan varietas. Bangsa kuda pada awalnya dianggap sebagai hewan yang berkaitan dengan lokasi geografis tempatnya dikembangbiakkan untuk memenuhi kebutuhan manusia secara spesifik. Kini bangsa kuda seringkali ditentukan oleh komunitas atau lembaga yang melakukan pencatatan keturunan dan membuat buku silsilah kuda hasil seleksi berdasar pada daerah asal, fungsi dan ciri fenotipik (Bowling dan Ruvinsky, 2004).
Kuda dapat diklasifikasikan menjadi kuda tipe ringan, tipe berat maupun kuda poni sesuai dengan ukuran bentuk tubuh dan kegunaannya. Kuda tipe ringan mempunyai tinggi 1,45-1,7 m saat berdiri, bobot badan 450-700 kg dan sering digunakan sebagai kuda tunggang, kuda tarik atau kuda pacu. Kuda tipe ringan secara umum lebih aktif dan lebih cepat dibanding kuda tipe berat. Kuda tipe berat mempunyai tinggi 1,45-1,75 m saat berdiri, dengan bobot badan lebih dari 700 kg dan biasa digunakan untuk kuda pekerja. Kuda poni memiliki tinggi kurang dari 1,45 m jika berdiri dan bobot badan 250-450 kg, beberapa kuda berukuran kecil biasanya juga berbentuk dari keturunan kuda tipe ringan (Ensminger, 1962). Pada Tabel 1 dapat dilihat tipe, kegunaan, jenis, tinggi, bobot badan dan habitat asli kuda dari yang ada di dunia.
4 Tabel 1. Tipe, Kegunaan, Jenis, Tinggi, Bobot Badan dan Habitat Asli Kuda
Tipe Kegunaan Jenis Tinggi
(m) Bobot Badan (kg) Habitat Asli Kuda Tunggang Kuda tunggang berlari cepat
Kuda Albino Amerika 1,45-1,7 450-700 Amerika Serikat
Tiga Kuda Sadel Amerika Amerika Serikat
Kuda Arab Arab Saudi
Kuda Appalossa Amerika Serikat
Kuda Morgan Amerika Serikat
Kuda Spotted Maroko Amerika Serikat
Kuda Palomino Amerika Serikat
Kuda Thoroughbred Inggris
Kuda tunggang berlari cepat
Kuda Sadel Amerika 1,45-1,7 450-700 Amerika Serikat Lima
Kuda untuk berjalan
Kuda Tennese Walking 1,5-1,6 500-600 Amerika Serikat Stock horse Tingkatan pesilangan atau
hasil biak dalam dari:
Kuda Appalossa 1,55-1,6 500-550 Amerika Serikat
Kuda Arab Arab Saudi
Kuda Morgan Amerika Serikat
Kuda Spotted Maroko Amerika Serikat
Kuda Palomino Amerika Serikat
Kuda Quarter Amerika Serikat
Kuda Thoroughbred Inggris
Pendaki Tingkatan, persilangan 1,45-1,55 500-626 Pemburu dan
Pelompat
atau hasil biak dalam dari semua jenis juda tetapi dominasi oleh keturunan
Thoroughbred
1,55-1,65 500-625
Kuda Poni
untuk ditunggangi
Kuda Shetland dan Welsh 0,9-1,45 250-450 Shertlond Isles Inggris
Kuda Pacu
Pelari
kuda Thoroughbred 1,55-1,65 450-600 Inggris
Kuda Pacu
berpakaian
Kuda Standardbred 1,45-1,55 450-600 Amerika Serikat
Kuda Quarter Kuda Quarter 1,45-1,55 500-600 Amerika Serikat
Kuda Tarik
Kuda
Berpakaian Tipe Berat
Kuda Cleveland Bay 1,45-1,65 450-650 Inggris
Kuda Frech Coach Perancis
Kuda Jerman Coach Jerman
Kuda Hackney Inggris
Kuda Yorkshire Coach Inggris
Kuda
Berpakaian Tipe Sedang
Didominasi oleh Kuda Sadel Amerika
1,45-1,7 450-700 Amerika Serikat
Kuda Transportasi
Kuda Morgan & Kuda
Standardbred
1,45-1,55 450-600 Amerika Serikat
Kuda Poni
untuk menarik
Kuda Hackney, Kuda Shetland dan Ewish
0,9-1,45 250-450 Inggris Shertland Isles
5 Bangsa Kuda di Indonesia
Indonesia memiliki beberapa kelompok populasi kuda yang berasal dari kuda jenis Thoroughbred untuk digunakan sebagai pacuan atau disilangkan dengan kuda lokal. Populasi kuda lokal silangan dan kuda asli Sumba dikenal dengan sebutan kuda Sandel. Karakteristik masing-masing kuda lokal di Indonesia dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik Kuda Lokal Indonesia Jenis Kuda
Tinggi Badan (m)
Karakteristik
Kuda Sumba 1,27 Bentuk kepala terlihat lebih besar dibanding kaki. Sifatnya jinak dan cerdas, punggung kuat, namun konformasi badan kurang sempurna. Kuda Timor 1,22 Bentuk badan dan punggung lurus, leher pendek, bahu dan ekor yang
tinggi, bagian tengkuk dan ekor penuh bulu.
Kuda Sandel 1,35 Ukuran tubuh kecil, bentuk kepala kecil, mata besar, bulu lembut dan berkilauan dan mempunyai kecepatan yang baik dan sangat efektif dengan kuku kaki yang keras dan kuat.
Kuda Batak 1,32 Bentuk kepala bagus dengan bagian muka yang lurus, leher pendek dan lemah. Memiliki bagian punggung yang panjang dan sempit dengan kaki belakang ramping.
Kuda Jawa 1,27 Memiliki stamina yang baik dan tahan terhadap panas, ukuran tubuh relatif lebih besar.
Kuda Padang 1,27 Kuku kaki keras dan bentuknya bagus, bagian tumit lemah, konformasi baik tetapi pertulangannya kecil.
Kuda Sulawesi 1,25 Daya tahan tubuh kuat, kaki tegap dan kuat, dan bertempramen stabil. Kuda Flores 1,24 Bentuk badan kecil dan jinak.
Kuda Bima - Bentuk badan kecil, memiliki pinggang yang pendek dengan daya tahan tubuh baik dan memiliki langkah yang cepat.
Sumber : Edward (1994); Soehardjono (1990)
Kuda Sulawesi
Kuda Sulawesi mirip dengan kuda Makassar. Kuda ini berasal dari pulau Jawa, bertempramen stabil serta berdaya tahan kenyal. Hewan ini bisa digunakan sebagai kuda tunggang atau kuda beban. Perangkat tubuhnya sempurna, berkaki tegap, dan kuat. Jenis kuda ini berukuran tinggi 1,25 m, berotot kaki kuat, persendian kuku jarang sakit (Soehardjono, 1990). Populasi kuda di Sulawesi Utara sebanyak 8.543 ekor (BPS, 2005).
6 Kota Manado
Kota Manado terletak di ujung jazirah utara pulau Sulawesi, pada posisi geografis 124°40'-124°50' Bujur Timur (BT) dan 1°30'-1°40' Lintang Utara (LU). Iklim di kota ini adalah iklim tropis dengan rataan suhu 29,4-32,2 °C pada siang hari sedangkan suhu pada malam hari berkisar antara 21,6-23,2 oC (Hardjono, 2004). Rataan curah hujan 3.187 mm/tahun dengan iklim terkering disekitar bulan Agustus dan terbasah pada bulan Januari. Intensitas penyinaran matahari rata-rata 53% dan kelembaban ±84%. Jumlah populasi kuda di Kota Manado sebanyak 163 ekor (manadokota.go.id).
Kota Tomohon
Kota Tomohon berada pada 1°15' LU dan 124°50' BT. Luas Kota Tomohon berdasarkan keputusan UU RI Nomor 10 Tahun 2003 sekitar 11.420 ha dengan jumlah penduduk mencapai 87.719 jiwa. Wilayah Kota Tomohon memiliki karakteristik topografi yang bergunung dan berbukit yang membentang dari utara ke selatan. Akibat kondisi topografi tersebut maka pengembangan wilayah kota menjadi terbatas. Rataan curah hujan 1.422–2.364 mm (Hardjono, 2004). Rataan suhu hanya berfluktuasi antara 22,02 °C sampai 22,8 °C dengan kelembaban berkisar antara 85%-91%. Jumlah populasi kuda di Kota Tomohon sebanyak 267 ekor (tomohonkota.go.id).
Kabupaten Minahasa
Kabupaten Minahasa adalah salah satu kabupaten di provinsi Sulawesi Utara, Indonesia. Ibu kota kabupaten ini adalah Tondano. Kabupaten ini memiliki luas wilayah 872,32 km² (Hardjono, 2004). Minahasa dahulu disebut Tanah Malesung adalah kawasan didalam provinsi di semenanjung Sulawesi Utara di Indonesia. Jumlah populasi kuda di Kabupaten Minahasa sebanyak 3.439 ekor. Kabupaten ini memiliki rataan suhu 21,9-22,6 oC (minahasa.go.id).
Kabupaten Minahasa Selatan
Kabupaten Minahasa Selatan adalah salah satu Kabupaten di Provinsi Sulawesi Utara. Ibukota Kabupaten Minahasa Selatan adalah Amurang, berjarak sekitar 64 km dari Manado. Kabupaten ini memiliki luas wilayah 1.429,7 km2. Rataan kelembaban berkisar antara 60%-90% sedangkan rataan suhu bulanan adalah
7 23,5 oC. Rataan curah hujan per tahun adalah 1.282 mm (Hardjono, 2004). Jumlah populasi kuda di Kabupaten Minahasa Selatan sebanyak 170 ekor (minsel.go.id).
Protein Darah
Protein merupakan kompleks makromolekul yang terdiri dari asam amino dan tersusun dengan adanya ikatan peptida dalam bentuk linear dan tidak bercabang. Stuktur protein terbagi menjadi empat bentuk, yaitu struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener (Rosenberg, 2005). Persentase protein dalam tubuh berkisar antara 15%-18% dari bobot tubuh, sedangkan kandungan protein dalam plasma berkisar antara 2%-3% dari bobot tubuh (Riis, 1983).
Protein darah merupakan salah satu bentuk makromolekul disamping asam nukleat dan polisakarida, biokatalisator, hormon reseptor, dan tempat penyimpanan informasi genetik. Makro molekul tersebut adalah biopolimer yang dibentuk dari unit monomer. Unit monomer untuk asam nukleat adalah nukleotida, sedangkan monomer untuk kompleks polisakarida adalah devirat gula dan monomer untuk protein adalah asam amino (Rodwell, 1983).
Darah adalah jaringan yang beredar dalam sistem pembuluh darah yang tertutup. Darah terdiri dari unsur-unsur sel darah merah/putih dan trombosit yang terdapat dalam medium cair yang disebut plasma, campuran yang sangat kompleks tidak hanya terdiri dari protein sederhana tetapi juga protein campuran seperti glikoprotein dan berbagai jenis lipo-protein. Protein plasma dibagi dalam tiga bagian, yakni fibrinogen, albumin, dan globulin, dimana albumin merupakan bahan yang paling tinggi konsentrasinya dan mempunyai berat molekul paling rendah dibandingkan molekul protein utama plasma.
Perbedaan bentuk setiap protein darah menurut Nicholas (1987) dapat dideteksi dengan membedakan kecepatan geraknya dalam sel elektroforesis. Individu homozigot menampilkan pita pada gel elektroforesis berbeda dibandingkan dengan individu heterozigot. Cara ini sering dipakai pula untuk menelusuri hubungan kekerabatan antara individu dengan melihat persamaan dan perbedaan protein darah yang dimilikinya (Tabel 3).
8 Tabel 3. Jumlah Alel pada Lokus Kuda
Nama Lokus Simbol Lokus Jumlah Alel Biasa Jarang
A1B-Glycoprotein A1B 3 (4)
Aspartate aminotransferase AAT 2
Albumin ALB 3 Acid phosphatase AP 2 Complement component 3 C3 4 Carbonic anhydrase CA 6 Catalase CAT 2 (+) Ceruloplasmin CP 2
NADH diaphorase DIA 2
Serum carboxylesterase ES 10 (+)
Fucosidase alpha FUCA 3
Vitamin D-binding protein GC 2 (2)
Glucosephosphate isomerase GPI 4
Haptoglobin HP 2
Haemoglobin alpha HBA 4
Malic enzyme 1 MET 2
Mannosephosphate isomerase MPI 3
Peptidase A PEPA 2
Plasminogen PLG 2
Phosphoglucomutase PGM 3
6-Phosphogluconate dehydrogenase 6-PGD 3 (2)
Protease inhibitor PI 25 (+)
Red cell protein RCP 2
Serum protein 3 SP3 5
Transferrin TF 15 (+)
Lactoglobulin beta II BLG-II 5
Sumber: Sandberg dan Cothran (2000)
Polimorfisme Protein Darah
Polimorfisme adalah suatu keadaan dimana terdapat beberapa bentuk fenotipe yang berbeda yang berhubungan satu sama lainnya. Studi polimorfisme adalah studi tentang karakteristik dari berbagai protein. Polimorfisme suatu protein darah dapat dipelajari melalui struktur protein atau enzim karena perbedaan basa dalam DNA dapat dianggap sebagai sifat biokimia untuk membedakan jenis organisme. Enzim
9 dan protein terdiri dari satu atau lebih rangkaian polipeptida yang dibawa oleh gen pada lokus yang sama atau berbeda sehingga dengan adanya pola pita polimorfisme protein dan enzim dapat dianggap sebagai ciri fenotipe dari suatu individu. Pita-pita yang terbentuk dapat diduga protein atau enzim yang dibawa oleh alel gen dalam lokus yang sama atau lokus yang berbeda (non alel gen) (Selander, 1976; Nicholas, 1987).
Beberapa polimorfisme protein dapat dipelajari dalam darah, telur dan organ tubuh burung puyuh (Maeda et al., 1972). Kimura et al. (1980) menyatakan bahwa protein darah merupakan produk langsung dari gen yang relatif tidak terpengaruh oleh perubahan lingkungan, selain itu pula protein ini terdiri dari satu atau lebih rangkaian polipeptida yang dibawa oleh gen pada lokus yang sama atau lokus yang berbeda, sehingga dengan adanya pola pita yang memiliki karakterisitik tertentu pada polimorfisme protein, dapat dianggap sebagai fenotip dari suatu individu. Lebih lanjut Maeda et al. (1980) menyatakan bahwa untuk melakukan studi polimorfisme dapat digunakan teknik elektroforesis sebagai proses analisisnya, dan eletroforesis tidak hanya digunakan untuk mendeteksi variasi alel dan gen dari suatu individu tetapi dapat juga digunakan untuk menduga variasi genetik dalam populasi.
Nicholas (1987) menyatakan perbedaan bentuk setiap protein darah dapat dideteksi dengan membedakan kecepatan gerakannya dalam elektroforesis gel. Selanjutnya dinyatakan bahwa molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan lebih jauh dalam satuan waktu yang sama. Banyaknya kelompok keragaman bentuk protein darah menunjukkan karakteristik protein darah tertentu. Setiap kelompok protein darah akan diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Protein tersebut merupakan penampilan bentuk alel pada lokusnya. Harper et al. (1980) menyatakan bahwa jika arus listrik dialirkan pada suatu media penyangga yang telah berisi protein plasma, maka proses migrasi terhadap komponen-komponen protein tersebut dimulai. Protein albumin mengalami proses migrasi yang lebih cepat dibandingkan dengan protein lainnya (protein globulin).
Warwick et al. (1990) menyatakan bahwa sejumlah besar perbedaan- perbedaan yang diatur secara genetis telah ditemukan dalam globulin (Transferrin), Albumin, enzim-enzim darah dan Hemoglobin. Perbedaan-perbedaan tersebut ditentukan dengan prosedur biokimia, antara lain dengan elektroforesis. Lebih lanjut
10 dikemukakan bahwa polimorfisme biokimia yang diatur secara genetis sangat berguna untuk membantu penentuan asal-usul, menyusun hubungan filogenetis antara spesies, bangsa dan atau kelompok-kelompok dalam spesies yang merupakan hasil utama dari produk gen.
Nozawa et al. (1981) menyatakan bahwa studi keragaman genetik 26 lokus protein darah pada kuda lokal Indonesia memiliki proporsi keragaman 23%-24% dengan rataan nilai heterozigositasnya sebesar 8%-11%.
Analisis Keragaman Genetik
Keragaman genetik dalam suatu populasi digunakan untuk mengetahui dan melestarikan bangsa-bangsa dalam populasi terkait dengan penciri suatu sifat khusus. Pengetahuan akan keragaman genetik suatu bangsa akan sangat bermanfaat bagi keamanan dan ketersediaan bahan pangan yang berkesinambungan (Blott et al., 2003). Hukum Hardy-Weinberg menyatakan bahwa frekuensi genotipe suatu populasi yang cukup besar akan selalu dalam keadaan seimbang bila tidak ada seleksi, migrasi, mutasi dan genetic drift (Noor, 2008). Hal tersebut menunjukkan bahwa suatu populasi jika berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg maka genotipe pengamatan dalam populasi tersebut mendekati atau hampir sama dengan nilai harapannya atau sebaliknya.
Ada atau tidaknya polimorfime pada gen atau lokus yang diamati dapat diketahui dari nilai frekuensi alel. Gen dikatakan bersifat polimorfik yaitu apabila salah satu alelnya mempunyai frekuensi kurang dari 99% (Nei & Kumar, 2000) atau 95% (Hartl, 1988). Sebaliknya, gen dikatakan monomorfik apabila tidak memenuhi kriteria polimorfik diatas. Keragaman genetik digunakan untuk menginvestigasi hubungan genetik suatu spesies antar subpopulasi. Prinsipnya adalah kemungkinan adanya alel bersama yang dimiliki antar subpopulasi yang disebabkan oleh migrasi. Alel bersama ini juga mengindikasikan adanya asal-usul atau tetua yang sama (Hartl, 1988). Keragaman genetik dapat dihitung secara kuantitatif dengan menggunakan nilai frekuensi alel. Frekuensi alel adalah proporsi jumlah suatu alel terhadap jumlah total alel dalam suatu populasi pada lokus yang sama (Nei dan Kumar 2000). Berdasarkan nilai frekuensi alel, maka selanjutnya dapat dibandingkan perbedaan antar gen, baik didalam maupun antar populasi.
11 Heterozigositas menggambarkan adanya variasi genetik pada suatu populasi. Semakin tinggi nilai heterozigositas pada suatu populasi maka tinggi pula variasi genetik pada populasi tersebut (Ferguson, 1980). Pendugaan nilai heterozigositas dihitung untuk mendapatkan keragaman genetik dalam populasi yang dapat digunakan untuk membantu program seleksi pada ternak yang akan digunakan sebagai sumber genetik pada generasi berikutnya (Marson et al., 2005).
Jarak genetik merupakan tingkat perbedaan gen (perbedaan genom) antara dua populasi, yang biasa dihitung berdasarkan fungsi dari frekuensi alel. Jarak genetik dapat digunakan dalam memperkirakan waktu terjadinya pemisahan antar populasi dan dapat juga digunakan dalam membangun pohon filogenetik (Nei and Kumar, 2000). Semakin kecil nilai jarak genetik yang diperoleh menunjukkan adanya hubungan kekerabatan yang lebih dekat. Pohon filogenetik atau pohon evolusi adalah pohon yang menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies yang diyakini memiliki nenek moyang yang sama. Dalam sebuah pohon filogenetik, setiap node dengan keturunan merupakan nenek moyang terbaru dari keturunan, dan panjang tepi dalam beberapa pohon sesuai dengan perkiraan waktu (Miller, 2009).
PolyacrylamideGelElectrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis merupakan salah satu cara teknik yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi enzim atau protein, yaitu teknik untuk memisahkan molekul kimia menggunakan arus listrik. Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran, berat molekul, dan muatan listrik yang dikandung oleh makromolekul tersebut (Stenesh, 1984).
Westermeier (2005) menyatakan bahwa teknik elektroforesis dapat dibagi dalam dua kategori yaitu elektroforesis tabung (cylindrical gels) dan elektroforesis lembaran (layer gels). Elektroforesis dengan layer gel memiliki keunggulan yaitu proses separasi yang lebih cepat, pita protein yang lebih tegas terlihat, pewarnaan yang singkat, efisien, dan lebih sensitif. Omstein (1964) menyatakan bahwa disc-gel electrophoresis merupakan perbaikan dari elektroforesis layer dimana protein akan dipisahkan menjadi pita-pita yang memiliki resolusi tinggi. Teknik ini dinamakan disc-gel electroforesis karena menggunakan perbedaan pH, kekuatan ionik, komposisi buffer dan komposisi gelnya (Gambar 1). Teknik ini mampu memecahkan dua masalah dalam elektroforesis protein darah yaitu mencegah agregasi dan
12 presipitasi protein selama sampel dimasukkan kedalam gel dan meningkatkan bentuk yang tegas pada pita protein.
Gambar 1. Prinsip Dasar Disc-electrophoresis (Omstein, 1964)
Harper et al. (1980) menyatakan bahwa elektroforesis adalah suatu cara analisis kimia yang didasarkan kepada gerakan molekul bermuatan didalam medan listrik. Pergerakan molekul didalam medan listrik dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Berbagai komponen protein serum pada pH diatas dan dibawah titik isoelektriknya akan bergerak turun dengan kecepatan yang berbeda karena muatan permukaannya berbeda.Contoh pola pita protein untuk beberapa interval berat molekul dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3.
Gambar 2. Contoh Pita Protein Darah dengan Pewarnaan Coomassie Brilliant Blue (Westermier, 2005)
13 Gambar 3. Kurva Berat Molekul Protein (Westermier, 2005)
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Pengambilan sampel darah kuda dilakukan di Sulawesi Utara pada empat Kabupaten/Kota yaitu Kota Manado, Kota Tomohon, Kabupaten Minahasa, dan Kabupaten Minahasa Selatan yang dilaksanakan pada Juni 2010. Identifikasi keragaman protein darah dilaksanakan awal Juli sampai dengan Oktober 2010 di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Sampel Darah
Materi darah kuda lokal yang digunakan dalam penelitian sebanyak 74 sampel yang terdiri dari 28 sampel dari Kota Manado, 10 sampel dari Kota Tomohon, 23 sampel dari Kabupaten Minahasa, dan 13 sampel dari Kabupaten Minahasa Selatan (Gambar 4).
15
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Gel elektroforesis terdiri dari gel pemisah dan gel penggertak. Gel pemisah merupakan gel yang dicampurkan dari beberapa bahan di antaranya bahan IA, IB, IC, dan ID. Masing-masing bahan terdiri dari:
Bahan IA : 39,0 g Acrylamide; 1,0 g Bis Acrylamide; 20,0 ml Glycerol , dan aquadestilata sampai 100 ml.
Bahan IB : 9,15 g Tris; 3 ml HCl, dan aquadestilata sampai 100 ml. Bahan IC : 0,2 g Ammonium persulfat dan aquadestilata sampai 100 ml. Bahan ID : TEMED 400 µl/100 ml aquadestilata
Gel penggertak merupakan gel yang dicampurkan dari beberapa bahan di antaranya bahan IIA, IIB, IIC, dan IID. Masing-masing bahan terdiri dari:
Bahan IIA : 38,0 g Acrylamide; 2,0 g Bis Acrylamide; 20,0 ml Glycerol ; dan aquadestilata sampai 100 ml.
Bahan IIB : 1,5 g Tris, 1 ml HCl, dan aquadestilata hingga 100 ml. Bahan IIC : 0,4 g Ammonium persulfat dan aquadestilata sampai 100 ml. Bahan IID : TEMED 200 µl/100 ml aquadestilata
Buffer Elektroda
Buffer elektroda yang digunakan terdiri dari 1,5 g Tris, 7,2 g Glycine dan ditambahkan aquadestilata hingga 1 liter.
Pewarnaan Protein
Bahan-bahan untuk pewarnaan protein terdiri dari bahan pewarna plasma, bahan pewarna sel darah merah, dan bahan pencuci. Bahan larutan pewarna Coomassie Brilliant Blue 250 R (untuk plasma) terdiri dari 1,25 g Coomassie Brilliant Blue; 225 ml methanol; 50 ml asam asetat, dan 225 ml aquadestilata. Bahan larutan pewarna Ponceau-S (untuk sel darah merah) terdiri dari 5 g TCA; 100 ml aquadestilata dan 0,5 g Ponceau-S dalam aquadestilata. Bahan untuk larutan pencuci terdiri dari 800 ml aquadestilata; 150 ml methanol; dan 50 ml asam asetat.
16 Prosedur
Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah kuda sebanyak ±3 ml melalui vena jugularis dengan menggunakan venojact lalu segera dimasukkan kedalam tabung vaccutainer yang dimasukkan kedalam termos es dan disimpan dalam suhu 4 ºC.
Preparasi Sampel
Darah yang didapatkan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 30 menit. Plasma yang terbentuk kemudian dipindahkan ke tabung 1,5 ml dan disimpan pada suhu 4 oC sampai dilakukan pemisahan protein menggunakan metode elektroforesis. Proses preparasi sampel ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Preparasi Sampel Darah Kuda Elektroforesis Protein Darah
Elektroforesis protein plasma darah dilakukan menggunakan perangkat elektroforesis EP-155 (Advantec) pada arus 15-35 mA dengan tegangan 150 V selama 1 jam 45 menit (PS300, Advantec). Gel yang digunakan merupakan stacking PAGE dengan konsentrasi 5% dan 3%. Elektroforesis protein sel darah merah dilakukan pada arus 15-35 mA dengan tegangan 150 V selama 1 jam 30 menit. Gel yang digunakan merupakan stacking PAGE dengan konsentrasi 8% dan 4%.
Visualisasi dan Genotyping
Visualisasi pita protein pada stacking PAGE dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Coomassie Brilliant Blue 2,5%. Selanjutnya, gel dicuci menggunakan methanol sampai muncul pita. Genotyping dilakukan dengan mensejajarkan pita-pita protein pada gel. Protein yang diamati meliputi Albumin (Alb), Post Albumin (PAlb),
17 Transferrin (Tf), Post Transferrin-1 (PTf-1), Post Transferrin-2 (PTf-2), dan Hemoglobin (Hb). Genotyping yang dilakukan mengikuti Nozawa et al. (1981) (Gambar 6).
Gambar 6. Pola Pita Protein Darah (Nozawa et al., 1981)
Analisis Data
Frekuensi Genotipe
Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Model matematika frekuensi genotipe (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
= frekuensi genotipe ke ii = jumlah sampel bergenotipe ii N = jumlah seluruh sampel
18 Frekuensi Alel
Frekuensi alel merupakan rasio relatif suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi. Model matematika frekuensi alel (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
Xi = frekuensi alel ke i
nii = jumlah sampel yang bergenotipe ii
nij = jumlah sampel yang bergenotipe ij
N = jumlah seluruh sampel
Hukum Keseimbangan Hardy-Weinberg
Pengujian nilai genotipe antara hasil pengamatan dan nilai harapan dapat diukur dengan menggunakan uji Chi-Kuadrat (Nei dan Kumar, 2000):
Keterangan:
χ2
= Chi-Kuadrat O = nilai pengamatan E = nilai harapan
∑ = sigma (jumlah dari nilai-nilai)
Suatu popluasi dikatakan seimbang jika nilai χ2 yang didapatkan lebih kecil daripada χ2 tabel pada selang kepercayaan 5% dan derajat bebas tertentu.
Heterozigositas
Ketika frekuensi alel dipelajari di banyak lokus, tingkat keragaman genetik