IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.7 Uji Imunogenisitas SGB
Sepuluh kelompok mencit betina bunting divaksinasi masing-masing dengan 1 strain isolat SGB yang telah dilemahkan dengan pemanasan. Satu kelompok kontrol diberikan injeksi NaCl fisiologis. Pengambilan darah dilakukan pada hari ke-1, 3 dan 5 pascavaksinasi. Serum yang diperoleh dari hasil sentrifugasi darah dikoleksi dan disimpan pada suhu –200C sebelum digunakan untuk uji ELISA.
Antigen yang digunakan untuk coating ELISA adalah antigen bakteri yang telah dilemahkan dengan pemanasan. Dari konsentrasi awal suspensi bakteri 109 sel/ml diencerkan secara bertingkat mulai dari pengenceran ½, ¼, 1/8, 1/16 hingga 1/1024. Hasil optimisasi konsentrasi antigen tersebut yang dijerap pada pelat polistirena diperoleh konsentrasi terbaik adalah pada tingkat pengenceran ¼. Pada tingkat pengenceran tersebut menghasilkan konsentrasi IgG yang cukup tinggi. Pada tingkat pengenceran yang lebih rendah menghasilkan absorbansi yang lebih rendah namun pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi juga menghasilkan absorbansi yang lebih rendah pula. Hal ini dapat disebabkan oleh karena terlalu rapatnya antigen yang dijerap pada pelat dapat mengakibatkan berubahnya bentuk sisi penangkap antibodi sehingga antibodi yang terikat menjadi lebih sedikit.
Perbedaan teknik yang digunakan untuk coating antigen sangat mempengaruhi hasil ELISA. Penggunaan konyugat dalam antigen coating akan memperoleh hasil ELISA yang optimal. Antigen coating yang menggunakan free
polisakarida SGB tanpa konyugat untuk mengukur konsentrasi IgG dalam serum wanita hamil yang diimunisasi dengan kapsul polisakarida SGB tipe III-TT adalah 31.0 µg/ml. Setelah penambahan konyugat pada antigen coating, konsentrasi IgG
naik menjadi 81.0 µg/ml dan 83.0 µg/ml masing-masing dengan menggunakan polisakarida-biotin conjugate dan polisakarida-human serum albumin conjugate (Bhushan et al. 1998).
Hasil pengukuran absorbansi IgG mouse standar yang diencerkan secara bertingkat sebanyak 6 kali yaitu 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 dan 1:3200 diperoleh kurva standar seperti tertera pada Gambar 14 di bawah. Persamaan linier yang diperoleh pada kurva tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi IgG sampel (µg/ml) dengan memasukkan nilai absorbansi pada sumbu y. Kurva Standar y = 60.457x + 1.1156 R2 = 0.9751 0 0.5 1 1.5 2 0 0.005 0.01 0.015 Konsentrasi OD OD Linear (OD)
Gambar 14. Kurva strandar IgG mouse standar
Hasil analisis konsentrasi IgG dalam serum sampel dengan metode indirect-ELISA diperlihatkan pada Tabel 10. Hasil uji anova konsentrasi IgG pascavaksinasi baik hari-1, hari-3 maupun hari-5 menunjukkan adanya perbedaan yang nyata dibanding konsentrasi IgG kontrol (Lampiran 1). Hasil tersebut menunjukkan bahwa vaksin SGB yang dilemahkan dengan pemanasan secara umum dapat meningkatkan konsentrasi antibodi IgG dalam serum mencit bunting secara signifikan dibanding kontrol.
Tabel 10. Konsentrasi IgG dalam serum sampel pascavaksinasi Rata-rata konsentrasi IgG pascavaksinasi (µg/ml) Vaksin
SV-1 12.942bcd 16.233bc 12.809c SV-2 9.410d 16.117bc 10.039d SR-6 14.422bc 19.938ab 18.640ab SR-7 11.155cd 15.919bc 19.897a SV-14 19.500a 19.508ab 17.846ab SV-17 12.694bcd 19.723ab 18.309ab SR-21 13.579bcd 17.937ab 16.362b SR-22 15.961ab 24.024a 18.620ab SV-24 18.814a 18.764ab 18.689ab SR-30 19.789a 20.087ab 18.747ab Kontrol 9.410d 10.502c 11.836cd
Ket: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% dengan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)
Hasil uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) menunjukkan bahwa konsentrasi IgG pada hari ke-1 pascavaksinasi dengan vaksin SR-6, SV-14, SR- 22, SV-24 dan SR-30 berbeda nyata dibanding kontrol (Lampiran 2). Konsentrasi IgG tertinggi hari ke-1 pascavaksinasi diperlihatkan oleh SR-30 yaitu sebesar 19.789 µg/ml. Pada hari ke-3 pascavaksinasi, selain kelima vaksin tersebut, vaksin SV-17 dan SR-21 juga dapat meningkatkan konsentrasi IgG yang berbeda nyata dengan kontrol. Konsentrasi IgG tertinggi hari ke-3 pascavaksinasi diperlihatkan oleh SR-22 yaitu 24.024 µg/ml. Sedangkan pada hari ke-5 pascavaksinasi hampir semua vaksin menunjukkan perbedaan yang nyata dibanding kontrol kecuali SV-1 dan SV-2. Konsentrasi IgG tertinggi hari ke-5 pascavaksinasi diperlihatkan oleh SR-7 yaitu 19.897 µg/ml. Sebaliknya vaksin SV-2 memperlihatkan konsentrasi IgG berada dibawah kontrol. Vaksin SV-1 dan SV-2 tidak mampu meningkatkan konsentrasi IgG baik pada hari ke-1, ke-3 maupun hari ke-5. Hal ini ditunjukkan oleh tidak adanya perbedaan nyata dari konsentrasi IgG pascavaksinasi vaksin SV-1 dan SV-2 dibanding kontrol. Hasil tersebut menunjukkan bahwa adanya keragaman dari vaksin bakteri SGB dalam imunogenisitasnya. Pola peningkatan konsentrasi IgG pascavaksinasi hari ke-1, 3 dan 5 diperlihatkan pada Gambar 15.
7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
hari-1 hari-3 hari-5
Pascavaksinasi hari ke-
Konsentrasi IgG SV-1 SV-2 SR-6 SR-7 SV-14 SV-17 SR-21 SR-22 SV-24 SR-30 Kontrol
Gambar 15. Pola peningkatan konsentrasi IgG pascavaksinasi
Puncak tertinggi konsentrasi IgG umumnya berada pada hari ke-3 namun hampir semua vaksin menunjukkan penurunan konsentrasi IgG dengan cepat pada hari ke-5. Sebaliknya yang diperlihatkan oleh vaksin SR-7, konsentrasi IgG terus meningkat dari hari ke-1, ke-3 sampai hari ke-5 pascavaksinasi. Hal ini mengindikasikan bahwa vaksin SR-7 merupakan vaksin yang paling imunogenik. Vaksin konyugat SGB tipe III-TT yang diberikan pada ibu hamil, aktif secara fungsional melawan SGB tipe III hingga anaknya berusia 2 bulan (Baker et al. 2003a). Sementara itu puncak tertinggi konsentrasi IgG wanita sehat tidak hamil dicapai 2 minggu pascavaksinasi dengan vaksin konyugat SGB tipe II-TT (Baker
et al. 2000).
Guttormsen et al. (1996) melaporkan konsentrasi antibodi IgG spesifik kapsul polisakarida tipe III yang diperoleh secara alamiah pada 35 orang wanita sehat tidak hamil berkisar antara 0.05-33.0 µg/ml. Sementara itu Anthony et al. (1994) melaporkan konsentrasi antibodi IgG spesifik terhadap kapsul polisakarida SGB tipe III dalam serum ibu hamil sehat kelompok umur 31-35 tahun pada saat melahirkan rata-rata adalah 0.20 µg/ml, sedangkan pada kelompok umur 16-20, 21-25, 26-30 tahun masing-masing adalah 0.09, 0.23 dan 0.19 µg/ml. Pada penelitian ini didapat konsentrasi IgG pada kelompok kontrol hari ke-1, ke-3 dan ke-5 pascavaksinasi masing-masing 9.41, 10.50 dan 11.84 µg/ml, hasil ini lebih
tinggi dari konsentrasi IgG dalam serum ibu hamil sehat. Hal ini mungkin disebabkan karena hewan coba yang digunakan bukan merupakan hewan spesified pathogenic free (SPF) sehingga keterpaparan dengan bakteri SGB yang ada di alam sangatlah memungkinkan.
Antibodi terhadap kapsul polisakarida sangat protektif dalam melindungi mencit neonatus dari infeksi SGB, namun kapsul polisakarida merupakan antigen yang kurang imunogenik. Kapsul polisakarida SGB tipe III yang tidak dikonyugat dengan protein hanya mampu meningkatkan respon antibodi spesifik sebesar 60% (Wessels et al 1990). Penurunan konsentrasi IgG yang sangat cepat pada percobaan di atas menunjukkan bahwa vaksin bakteri SGB yang dilemahkan dengan pemanasan kurang imunogenik. Untuk meningkatkan imunogenisitasnya, vaksin SGB harus dibuat dari kapsul polisakarida murni yang dikonyugasi dengan suatu protein karier (Baker et al. 1999). Namun pengikatan polisakarida dengan suatu protein bukanlah hal yang mudah untuk dilakukan. Selain itu kapsul polisakarida SGB terdiri dari beberapa serotipe, sehingga pembuatan vaksin yang efektif adalah vaksin yang multivalen dari serotipe yang paling sering muncul, namun hal ini juga mengalami kendala karena distribusi serotipe dari waktu ke waktu mengalami perubahan dan adanya perbedaan di tiap-tiap wilayah.
Konsentrasi IgG spesifik yang diperoleh setelah vaksinasi dengan kapsul polisakarida yang dikonyugat dengan suatu protein karier, secara signifikan lebih tinggi dibanding dengan vaksin yang tidak dikonyugat. Vaksin kapsul polisakarida (CPS) yang dikonyugat dengan tetanus toksoid (TT) meningkatkan konsentrasi IgG spesifik empat kali lipat dalam serum 90% resipien, sedangkan vaksin CPS yang tidak dikonyugat meningkatkan konsentrasi IgG spesifik dalam serum hanya pada 50% resipien (Baker et al. 1998; Baker dan Edwards 2003). Antibodi kelinci yang dipicu dengan vaksin konyugat SGB tipe V-TT adalah opsonik secara in vitro dan melindungi mencit melawan SGB tipe V. Dengan demikian vaksin konyugat SGB tipe V-TT adalah suatu imunogen yang efektif pada hewan model dan mungkin dapat digunakan sebagai komponen vaksin SGB multivalen untuk manusia (Wessel et al. 1995). Shen et al. (2000) mengatakan bahwa vaksin kapsul polisakarida SGB tipe III (CPS III) yang dikonyugasi dengan sub unit B toksin kolera rekombinan (rCTB) dan vaksin CPS Ia-rCTB dapat
digunakan sebagai bahan vaksin konyugat bivalen atau mungkin juga multivalen yang diberikan melalui mukosa.
Paoletti et al. (1997) membuktikan bahwa antibodi IgG maternal anti kapsul polisakarida SGB berkorelasi dengan imunitas neonatus terhadap penyakit SGB. Pemberian human antisera yang dipicu dengan vaksin SGB tipe Ia-TT, Ib-TT atau III-TT pada mencit neonatal 4 jam setelah inokulasi dengan SGB tipe Ia, Ib atau III dosis letal menghasilkan berturut-turut 63%, 70% dan 75% mencit survive. Kling et al. (1997) melaporkan 98% mencit neonatus yang ditantang dengan SGB A909 survive setelah induknya diberi antiserum kelinci postvaksinasi dengan vaksin konyugat kapsul polisakarida tipe Ia-TT. Sedangkan yang induknya diberi antiserum kelinci postvaksinasi peptida N-terminal protein c SGB A909 menunjukkan 69% mencit neonatus survive, namun induk mencit yang diberi serum prevaksinasi hanya memberi perlindungan sebanyak 15%. Hasil ini menunjukkan bahwa kapsul polisakarida memegang peran penting dalam virulensi bakteri. Hasil tersebut juga membuktikan bahwa pemberian imunisasi pasif sebagai imunoterapi pada maternal dapat melindungi neonatus dari infeksi, artinya antibodi IgG dalam sirkulasi maternal dapat melewati secara transplasental memasuki peredaran darah janin. Kasper et al. (1996) juga membuktikan bahwa antibodi IgG maternal terhadap kapsul polisakarida SGB spesifik-tipe melewati peredaran darah secara transplasental dan dapat melindungi neonatus dari penyakit SGB.