PEMANFAATAN CELL LINE HepG2 SEBAGAI INANG PARASIT PADA UJI PRA KLINIS VAKSIN MALARIA IRADIASI
IV. VAKSIN TAHAP HATI
Gambar 2. Gambaran sel hepatosit dengan keberadaan sel Kupffer dan sel Stellate (kiri) dan tampilan mikroskopik kultur in vitro HepG2 pasase 15 yang menunjukkan morfologi seperti sel epitel (perbesaran 100 kali) (kanan).
Sistem kultur in vitro telah dikembangkan untuk mempelajari tahapan eksoeritrositik (EE) parasit malaria P.berghei
sebagai model [17]. Sporozoit P. berghei
mampu menginvasi seluruh sel dan seluruh tahapan siklus EE dapat disempurnakan dalam cell line paru dan hepatoma manusia, sel HeLa dan hepatosit mencit [18,19]. Seperti parasit untuk manusia dan primata, sporozoit P. berghei mudah menginfeksi kultur hepatosit primer manusia dan primata dengan perkembangan EE lengkap. Tetapi hepatosit primer tidak tumbuh terus menerus dalam kultur dan perlu diisolasi dari hati. Oleh karena itu perlu dikembangkan sistim model cell line hepatosit manusia. Cell line
yang disebut HepG2-A16 mendukung penuh siklus EE P. berghei dan beberapa strain P. vivax. P. falciparum juga dapat mencapai pematangan sempurna dalam cell line ini. Calvo-Calle et al. [20] mencatat perkembangan P. falciparum tahap hati di luar tahap uninukleat dalam cell lines
hepatoma manusia huH-1 tetapi tidak menemukan pematangan tahap hati.
IV. VAKSIN TAHAP HATI
Kelaziman pengembangan vaksin melawan parasit malaria tahap hati didasarkan pada studi yang menunjukkan bahwa imunitas steril pada hewan dan manusia melawan parasit dapat diperoleh dengan imunisasi sprozoit iradiasi [21,22]. Meskipun sporozoit mampu melewati sel Kupffer sebelum menginfeksi hepatosit [23], sel hepatosit ini merupakan satu-satunya sel yang memungkinkan perkembangan sempurna parasit malaria setelah infeksi. Imunisasi hepatosit terinfeksi P. berghei
(tetapi bukan sel hati non parenkim terinfeksi) memunculkan proteksi melawan tantangan sporozoit [24]. Telah diduga bahwa pada malaria, hepatosit mengekspresi kompleks multiple histocompatibility complex
(MHC) kelas I-peptida pada permukaannya dan bahwa pengenalan kompleks ini oleh CD8 sel T diperlukan untuk proses proteksi [25]. Kenyataan ini didukung oleh studi yang
menunjukkan bahwa mencit yang diimunisasi sporozoit iradiasi tidak terlindungi dari tantangan sporozoit, tanpa melibatkan induksi IL-12, IFN-gamma, dan sel T proliferasi [26]. Bongfen SE dkk [27] meneliti respon protektif terhadap sporozoit yang diarahkan untuk melawan circumsporozoite protein
(CSP) parasit dan melibatkan induksi CD8 sel T dan produksi IFN-gamma. Peptida yang berasal dari CSP terdeteksi pada permukaan hepatosit terinfeksi dalam konteks molekul MHC kelas I. Akan tetapi masih belum banyak diketahui bagaimana CSP dan antigen sporozoit lainnya diproses dan disajikan ke CD8 sel T. Mereka meneliti bagaimana hepatosit utama dari mencit BALB/c memproses CSP dari Plasmodium berghei
setelah infeksi sporozoit dan mempresentasi peptida dari CSP pada CD8 sel T yang direstriksi secara in vitro.
Hasil penelitian Bongfen SE dkk juga menunjukkan bahwa hepatosit mampu memproses dan mempresentasikan Ag sporozoit setelah infeksi, tetapi tingkat aktivasi sel T CD8+ bervariasi dengan lamanya infeksi. Untuk menentukan waktu optimal yang diperlukan untuk memproses dan mempresentasi CSP setelah infeksi, hepatosit diinfeksi dengan sporozoit selama periode total 24 jam. Sekresi IFN-CD8+ sel T Pb-CS setelah dikultur bersama dengan hepatosit terinfeksi ditentukan dengan uji ELISPOT. Aktivasi optimal sel T terjadi jika hepatosit diinfeksi sporozoit selama 8 hingga 20 jam, tertinggi pada 16 jam.
Aktivasi menurun jika sel T dikultur kurang dari 8 atau lebih dari 20 jam. Hal ini menunjukkan bahwa waktu optimal yang diperlukan bagi hepatosit untuk memproses dan mempresentasi CSP pada CD8+ sel T adalah antara 8 dan 20 jam [27]. Hasil penelitiannya disajikan dalam Gambar 3.
Gambar 3. Hepatosit primer secara optimal memproses dan menyaji peptide asal-CSP pada 8 20 jam setelah infeksi sporozoit. Sekresi IFN-oleh sel T CD8+ spesifik setelah dikultur bersama dengan hepatosit terinfeksi dan ditentukan dengan uji IFN-ELISPOT [27].
Dengan menggunakan HepG2, Chatterjee S. dkk [28] menguji dan menspesifikasi proses invasi sporozoit terhadap sel hati yang diduga dimediasi oleh suatu reseptor. Daerah deret II dari protein CS P. falciparum yang meliputi nonapeptida (WSPCSVTCG) tersebar pada semua protein CS yang telah dikumpulkan, termasuk P. berghei. Daerah II ini ditemukan pada protein CS dari P. vivax, P. malariae, P. knowlesi, P. berghei dan P. yoelii. Dua deret
peptide berbasis P. falciparum deret daerah II yakni P18 dan P32 ternyata menghambat invasi sporozoit dalam sel HepG2 in vitro. Penghambatan diperbesar jika peptida tersebut diinkubasi terlebih dahulu dengan sel HepG2 sebelum inokulasi sporozoit. Daerah II adalah ligand sporozoit untuk reseptor hepatosit, dan terdapat sedikit perbedaan daerah deret II sekitar nonapeptida antara P. falciparum dan P. berghei. Karena motif yang merepresentasi deret krusial terlibat dalam invasi sporozoit pada hepatosit, antibodi daerah II haruslah menghambat invasi sporozoit. Mereka menemukan bahwa antibody poliklonal yang muncul pada peptide P32 berbasis P. falciparum
menghambat invasi sporozoit pada HepG2. Lebih jauh, mencit inbred (C57BL/6) yang diimunisasi dengan P32 terlindung dari tantangan letal sporozoit P. berghei. Hasil ini menyiratkan bahwa daerah II protein CS mengandung epitop sel T dan sel B sehingga deret peptide daai P. falciparum dapat ditapis dalam model rodensia P. berghei dan daerah II dapat diyakini bermanfaat sebagai satu komponen vaksin malaria.
Chattopadhyay dkk [29] juga menguji interaksi sporozoit dan hepatosit yang mengarah ke respon inang sistemik yang berbeda, kompleks dan terkoordinasi. Belum diketahui apakahinvasi ini merupakan adaptif primer untuk parasit, atau untuk inang atau keduanya. Peneliti ini menggunakan profil ekspresi gen sel HepG2-A16 yang diinfeksi sporozoit P. falciparum untuk
mengetahui kejadian seluler dini dalam inang dan faktor-faktor yang mempengaruhi infektifitas dan perkembangan sporozoit. Mereka menunjukkan bahwa dalam 30 menit setelah paparan sporozoit jenis ganas (non iradiasi) menyebabkan ekspresi paling tidak 742 gen berubah secara selektif. Gen ini mengatur fungsi-fungsi biologik seperti proses imun, adesi dan komunikasi sel, lajur-lajur metabolism, pengaturan siklus sel dan tranduksi sinyal. Fungsi ini merefleksikan kejadian seluler yang konsisten dari respon awal pertahanan sel inang dan perubahan sel inang untuk menahan perkembang biakan atau daya tahan hidup sporozoit. Sporozoit iradiasi juga menyebabkan perubahan ekspresi gen yang sangat mirip, tetapi mengarah ke analisis komparatif antara profil ekspresi gen hati disebabkan oleh sporozoit iradiasi dan non-iradiasi mengidentifikasi 29 gen, termasuk glypican-3 yang spesial dalam meng-up-regulasi hanya pada sporozoit iradiasi. Pengungkapan ini sangat bermanfaat untuk mengidentifikasi dasar molekuler ketidak mampuan sporozoit iradiasi berkembang secara intrahepatik dan kegunaannya sebagai imunogen untuk mengembangkan imunitas protektif melawan parasit malaria tahap pra-eritrositik.
Ketika sporozoit P. berghei
menginvasi sel HepG2 in vitro setelah inkubasi selama 24 jam, sporozoit iradiasi dan non-iradiasi mengalami transformasi menjadi trophozoit bulat. Empat puluh jam kemudian, sebagian besar parasit
eksoeritrositik iradiasi tidak bertambah ukurannya, sedangkan yang non iradiasi bertambah ukurannya hampir 4 kalinya. Hanya 5% sporozoit iradiasi berkembang menjadi schizont. Tujuh puluh dua jam kemudian, kemunculan merozoit dapat teramati hanya pada sporozoit non iradiasi [30]. Data ini menyiratkan bahwa sporozoit iradiasi mampu menginvasi hepatosit secara
in vitro dan berkembang menjadi trophozoit tetapi tidak mencapai kematangan. Sporozoit iradiasi ini juga menginduksi respon imun lebih efektif daripada sporozoit yang mati atau fraksinya. Temuan ini meyakinkan bahwa sporozoit haruslah terlihat (viable) untuk memunculkan proteksi. Sporozoit yang dinon aktifkan dengan pemanasan tidak mampu menembus hepatosit dan oleh karenanya tidak dapat melindungi terhadap re-infeksi.
Penelitian oleh Purcell L.A. dkk [31] dengan menggunakan jenis sel hati yang lain yakni Hepa 1-6 menemukan bahwa infeksi hepatosit oleh sporozoit in vitro secara nyata menurun, dan parasit yang diberi obat menunjukkan penghentian perkembangan tahap hati. Inokulasi mencit dengan sporozoit yang diberi perlakuan in vitro dengan sentanamisin untuk menghasilkan infeksi tahap darah. Penelitian ini menunjukkan bahwa sporozoit yang diatenuasi secara kimia dapat menjadi satu alternatif untuk memproduksi vaksin tahap darah untuk malaria.
V. PENUTUP
Pengetahuan tentang karakteristik atau tabiat parasit dalam sel hati masih menjadi tantangan besar para peneliti obat dan vaksin. Untuk vaksin, mekanisme protektif yang muncul pasca pemberian vaksin terutama berfungsi untuk melawan parasit tahap hati atau membuat sel hati terinfeksi melakukan kematian melalui apoptosis. Oleh karena itu, pengungkapan komposisi antigenik parasit tahap hati merupakan hal yang sangat penting untuk dilakukan. Saat ini ditemui adanya kesulitan dalam memperoleh sukarelawan yang bersedia untuk memberikan biopsi organ hatinya untuk studi atau penelitian vaksin malaria. Namun akhir-akhir ini telah diperoleh suatu kemajuan luar biasa dalam memperoleh sistem in vitro sel hati untuk maksud tersebut antara lain cell lines HepG2. Satu keunggulan cell line HepG2 dibandingkan dengan cell line dan kultur hepatosit manusia primer yang diperoleh dan diuji sebelumnya adalah penyempurnaan yang besar dalam hal laju kerentanan infeksi yang merupakan hal kritis untuk menggunakan kultur tahap hati in vitro dalam berbagai aplikasi eksperimental. Jadi saat ini satu-satunya sistem in vitro yang paling dapat dihandalkan untuk mengkultur P. falciparum
adalah hepatosit manusia primer [32,33]. Masih diperlukan teknik yang mudah dan murah untuk mengisolasi hepatosit terinfeksi yang mendukung penelusuran dan pengungkapan secara lebih mendetail siklus
hidup parasit malaria tahap hati in vivo. Sistem in vitro seperti cell line hepatoma manusia HepG2 yang mendukung perkembangan parasit malaria rodensia P. berghei telah menjadi temuan yang sangat penting, tetapi tidak untuk P. falciparum
kecuali satu cell line yang efisiensinya masih rendah [34].
Selain mempelajari bagaimana terjadinya infeksi oleh sporozoit, studi tentang proses imun dalam kaitannya dengan pengembangan atau uji pra klinis vaksin juga sedang berlangsung. Pengembangan saat ini bertumpu pada dasar-dasar untuk pengkulturan parasit malaria tahap hati pada sel manusia secara in vitro secara rutin, terstandardisasi, dan efisien [15,19]. Sistem kultur ini akan menjamin kelangsungan penelitian malaria antara lain untuk identifikasi antigen hati yang protektif, uji tapis obat melawan parasit tahap hati, dan uji keamanan vaksin sporozoit-utuh teratenuasi-hidup (live-attenutaed whole sporozoites) [29]. Masih banyak hasil-hasil penelitian lain yang mendukung pentingnya pengembangan vaksin sporozoit dengan menggunakan radiasi pengion.
Jadi vaksinasi melawan beberapa agensia penyebab penyakit seperti malaria yang mematikan terbukti mampu menyelamatkan milyaran manusia setiap tahunnya dan mampu memperbaiki kualitas hidup puluhan juta penduduk di dunia dengan mencegah atau menurunkan secara nyata transmisi beberapa penyakit infeksi pandemik
dan yang ditransmisikan secara lokal. Jadi, ada alasan untuk percaya bahwa keberhasilan vaksin malaria tidak hanya akan menurunkan secara nyata kematian dan kesakitan tetapi juga menjadi alat/cara penting dalam usaha mengontrol penyakit ini.
DAFTAR PUSTAKA
1. TDR. Malaria. Available at http://www.who.int/tdr/diseases/malaria/d iseaseinfo.htm [Disunting pada 15 Mei 2007].
2. GLOBALIS INDONESIA. Indonesia: Malaria Cases. Available at http://globalis.gvu.unu.edu/
indicator_detail.cfm?IndicatorID=74&Co untry=ID [Disunting 23 Mei 2007]. 3. WORLD HEALTH ORGANIZATION.
Malaria Epidemics/Outbreaks in SEA Region. Available at http://www.searo.who.int/en/Section10/S ection21/Section1987.htm [Disunting 23 Mei 2007].
4. NUGROHO, A., HARIJANTO, P., dan DATAU, E., Imunologi pada Malaria. Dalam : Harijanto PN, editor. Malaria. Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis, & Penanganan. Jakarta: EGC; 2000: 128-50.
5. LYCETT, G.J. and KAFATOS, F.C., Medicine: Anti-malarial mosquitoes?,
Nature, 417, 387-388, 2002.
6. VAN AGTMAEL, M.A., EGGELTE, T.A. and VAN BOXTEL, C.J., Artemisinin drugs in the treatment of malaria: from medicinal herb to , pages 199 205.
7. MORRIS, K.M., ADEN, D.P., KNOWLES, B.B. and COLTEN, H.R., Complement biosynthesis by the human hepatoma-derived cell line HepG2, J. Clin. Invest. 70, 906-913, 1982.
8. CHAKRAVARTY S, COCKBURN IA, KUK S, OVERSTREET MG, SACCI JB, et al. CD8+ T lymphocytes protective
against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes, Nature Medicine 13, 1035 1041, 2007.
9. GILBERT, J.M., FULLER, A.L., SCOTT, T.C., dan MCDOUGALD, L.R., Biological effects of gamma-irradiation on laboratory and field isolates of Eimeria tenella (Protozoa; Coccidia),
Prasiotol Res 84, 437-441, 1998.
10. SCHELLER, L. F., and AZAD, A.F., Maintenance of protective immunity against malaria by persistent hepatic parasites derived from irradiated sporozoites., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92: 4066 4068, 1995.
11. WAKI, S., YONOME, I., and SUZUKI, M., Plasmodium falciparum: attenuation by irradiation, Experimental Parasitology
56(3), 339 345, 1983.
12. LUKE, T.C. and HOFFMAN, S.L., Rationale and plans for developing a non-replicating, metabolically active, radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoite vaccine, Journal of Experimental Biology, 206, 3803 3808, 2003.
13. SILVIE, O., et al. Effects of irradiation on Plasmodium falciparum sporozoite hepatic development: implications for the design of pre-erythrocytic malaria vaccines, Parasite Immunology, 24, 221 223, 2002.
14. VAN IJZENDOORN, S.C.D. and HOEKSTRA, D., Polarized Sphingolipid Transport from the Subapical Compartment: Evidence for Distinct Sphingolipid Domains, Molecular Biology of the Cell, 10, 3449 3461, October 1999.
15. VAN PELT, J.F., DECORTE, R., YAP, P.S., FEVERY, J., Identification of HepG2 variant cell lines by short tandem repeat (STR) analysis, Mol Cell Biochem. 2003 Jan;243(1-2):49-54.
16. ANONIM. Malaria.
http://www.infeksi.com/articles.php?lng= in&pg=46 [Disadur pada 26 Juli 2007].
17. SATTABONGKOT, J.,
YIMAMNUAYCHOKE, N.,
LEELAUDOMLIPI, s.,
RASAMEESORAJ, M.,
JENWITHISUK, R., COLEMAN, R.E., UDOMSANGPETCH, R., CUI, L. and BREWER, T.G., Establishment of a human hepatocyte line that supports in vitro development of the exo-erythrocytic stages of the malaria parasites
Plasmodium falciparum and P. vivax,
Am. J. Trop. Med. Hyg., 74(5), 2006, 708 715.
18. HOLLINGDALE, M.R., LEEF, J.L., MCCULLOUGH, M., and BEAUDOIN, R.L., In vitro cultivation of the exoerythrocytic stage of Plasmodium berghei from sporozoites, Science 213: 1021 1022, 1981.
19. LONG, G.W., LEATH, S., SCHUMAN, R,, HOLLINGDALE, M.R., BALLOU, W.R., SIM, B.K.L., and HOFFMAN, S.L., Cultivation of the exoerythrocytic stage of Plasmodium berghei in primary cultures of mouse hepatocytes and continuous mouse cell lines, In Vitro Cell Develop Biol,25,857 862, 1989.
20. CALVO-CALLE, J.M., MORENO, A., ELING, W.M., and NARDIN, E.H., In vitro development of infectious liver stages of P. yoelii and P. berghei in human cell lines, Exp Parasitol,79,362 373, 1994.
21. CLYDE, D. F., Immunization of man against falciparum and vivax malaria by use of attenuated sporozoites. Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: 397 401, 1975. 22. NUSSENZWEIG, R. S.,
VANDERBERG, J., MOST, H. and ORTON, C., Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of Plasmodium berghei,
Nature 216: 160 162, 1967.
23. FREVERT, U., ENGELMANN, S., ZOUGBEDE, S., STANGE, J., NG, B., MATUSCHEWSKI, K., LIEBES, L. and YEE, H., 2005. Intravital observation of
Plasmodium berghei sporozoite infection of the liver. PLoS Biol. 3: E192.
24. RENIA, L., M. M. RODRIGUES, and V. NUSSENZWEIG. 1994. Intrasplenic immunization with infected hepatocytes: a mouse model for studying protective immunity against malaria pre-erythrocytic stage. Immunology 82: 164 168.
25. GOOD, M. F., and D. L. DOOLAN. 1999. Immune effector mechanisms in malaria. Curr. Opin. Immunol. 11: 412 419.
26. WHITE, K. L., SNYDER, H. L. and KRZYCH, U, MHC class I-dependent presentation of exoerythrocytic antigens to CD8_ T lymphocytes is required for protective immunity against Plasmodium berghei, J. Immunol. 156: 3374 3381, 1996.
27. BONGFEN, S.E., TORGLER, R., ROMERO, J.F., RENIA, L. and CORRADIN, G., Plasmodium berghei -infected primary hepatocytes process and present the circumsporozoite protein to specific CD8_T cells in vitro, The Journal of Immunology, 2007, 178: 7054
7063.
28. CHATTERJEE, S., SHARMA, W.P. and CHAUHAN, V.S., A conserved peptide sequence of the Plasmodium falciparum
circumsporozoite protein and antipeptide antibodiwes inhibit Plasmodium berghei
sporozoite invasion of Hep-G2 cells and protect immunized mice against P. berghei sporozoite challenge, Infection and Immunity 63(11), 4375-4381, 1995. 29. CHATTOPADHYAY, R., DE LA
VEGA, P., PAIK, S.H., MURATA, Y., FERGUSON, E.W., RICHIE, T.L. and OOI, G.T., Early Transcriptional Responses of HepG2-A16 Liver Cells to Infection by Plasmodium falciparum
Sporozoites, The Journal of Biological Chemistry, 286, 26396-26405, 2011. 30. SIGLER, C., LELAND, P. and
HOLLINGDALE, M., In vitro infectivity of irradiated Plasmodium falciparum
sporozoites to cultured hepatoma cells,
Am. J. Trop. Med. Hyg. 33, 544-547, 1984.
31. PURCELL, L.A., YANOW, S.K., LEE, M., SPITHILL, T.W. and ANA RODRIGUEZ, A., Chemical attenuation of Plasmodium berghei sporozoites induces sterile immunity in mice,
Infection and Immunity, Vol. 76(3), 1193 1199, 2008.
32. MAZIER, D., BEAUDOIN, R.L., MELLOUK, S., DRUILHE, P., TEXIER, B., TROSPER, J., MILTGEN, F., LANDAU, I., PAUL, C., and BRANDICOURT, O., Complete development of hepatic stages of Plasmodium falciparum invitro, Science,
227:440 442, 1985.
33. KAPPE, S.H.I. and DUFFY, P.E., Malaria liver stage culture: in vitro
veritas?, Am. J. Trop. Med. Hyg., 74(5), 2006, pp. 706 707.
34. KARNASUTA, C., PAVANAND, K.,
CHANTAKULKIJ, S.,
LUTTIWONGSAKORN, N.,
RASSAMESORAJ, M., LAOHATHAI, K., WEBSTER, H.K., and WATT, G., Complete development of the liver stage of Plasmodium falciparum in a human hepatoma cell line, Am J Trop Med Hyg 53: 607 611, 1995.
TANYA JAWAB
1. Penanya : Robert (PRR) Pertanyaan :
- Saya pernah menderita malaria, bagaimana/ apakah sudah ada uji klinis?
- Berapa harganya dan siapa yang memproduksinya?
Jawaban :
- Vaksin ini telah diuji pada anak-anak di Afrika dan mampu menekan kasus malaria hingga 50%.
- Harganya belum dapat diketahui tetapi investasinya sangat besar, tetapi diusahakan semurah mungkin atau gratis karena sebagian besar penderita malaria adalah golongan miskin.
2. Penanya : Kunto Wiharto Pertanyaan :
- Secara keseluruhan bagaimana prospek vaksin malaria radiasi dibandingkan dengan vaksin klasik?
- Seberapa jauh penelitian vaksin malaria radiasi itu telah berprogresi dalam mencapai target?
Jawaban :
- Prospeknya sangat bagus dan lebih unggul daripada vaksin klasik karena dapat memunculkan respon imun lebih lama, vaksin iradiasi adalah live-attennated.
- Di luar negeri telah dilakukan imunisasi tahap IIIb anak-anak di Afrika dan melindungi dari malaria hingga ±50%, di Indonesia masih perlu perbaikan litbang vaksin, di Indonesia masih jauh dari target karena banyak kendala baik SDM dan peralatan dsb.