Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Validasi metode adalah suatu proses untuk mengonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut. Laboratorium harus memvalidasi metode analisa jika: (1) metode tidak baku, (2) metode yang dikembangkan oleh laboratorium, (3) metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksudkan dan (4) metode baku yang dimodifikasi. Laboratorium juga harus merekam hasil yang diperoleh, prosedur yang digunakan untuk validasi dan pernyataan bahwa metode tersebut tepat untuk penggunaan yang dimaksud (ISO/IEC 17025 – 2005 dalam Udin 2007).
Sac (2002) menjelaskan bahwa karakteristik kinerja (performance
characteristics) yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode secara lengkap (full validation) meliputi 9 parameter, yaitu (1) akurasi, (2) presisi, (3)
sensitivitas, (4) spesifisitas, (5) penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi), (6) limit kuantitasi, (7) ketahanan, (8) kekasaran, dan (9) linearitas.
Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analit, misalnya mikroba target. Apabila suatu analit (mikroba target) secara alami ada di dalam suatu sampel atau di-spike ke dalam sampel sebagai bagian dari suatu tantangan atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali (recover) analit atau mikroorganisme tersebut pada konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat.
Presisi adalah tingkat kesamaan (degree of agreement) antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel homogenat. Presisi dari suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif (relative standard deviation atau coefficient of variation) dari suatu seri pengukuran. Presisi dapat diukur dari tingkat repitabilitas atau tingkat reproduksibilitas dari metode analisa yang dilakukan dalam kondisi normal. Repitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang sama oleh operator (analis) yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Sedangkan Reproduksibilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang berbeda dan peralatan berbeda, atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama.
Sensitifitas adalah kemampuan metoda untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin.
Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing/bahan/matrik lain.
Penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi) adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme dalam contoh yang dapat terdeteksi, akan tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati.
Limit kuantitasi adalah biasa juga disebut sebagai limit pelaporan adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati.
Ketahanan adalah suatu ukuran dari kapasitasnya terhadap sisa yang tidak dipengaruhi oleh sedikit tetapi variasi-variasi yang disengaja dalam parameter- parameter metode dan memberikan suatu indikasi dari reliablilitasnya selama penggunaan normal.
Kekasaran adalah kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada
contoh yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda. Bertujuan untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal terhadap metode (contoh dan metode sama, tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda).
Linearitas adalah kemampuan metode analisa yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proposional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi matematika.
Jenis parameter yang harus dilakukan pada validasi primer, baik secara kualitatif maupun kuantitatif secara ringkas dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Parameter validasi primer untuk uji mikrobiologi
Parameter Uji Kualitatif Uji Kuantitatif
Akurasi Tidak Ya
Presisi Tidak Ya
Spesifisitas Ya Ya
Limit Deteksi Ya Ya
Limit Kuantisasi Tidak Ya
Linearitas Tidak Ya
Kisaran Hitung Tidak Ya
Ketahanan Ya Ya
Repeatabilitas Ya Ya
Kekasaran Ya Ya
Sumber: USP 2007
Dalam validasi primer, semua biakan positif tersangka dan negatif tersangka harus diverifikasi. Validasi harus meliputi sampel alami yang dipelajari sepanjang waktu (Sac 2002).
Validasi sekunder atau verifikasi adalah proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode sesuai dalam memenuhi kebutuhan laboratorium. Validasi sekunder diperlukan karena adanya perbedaan kondisi antara saat metode tersebut
dibuat dengan metode tersebut diadopsi oleh suatu laboratorium. Kondisi yang dapat mempengaruhi penggunaan metode analisa antara lain perbedaan (1) kondisi lingkungan, (2) personil, (3) instrumen, dan (4) media dan pereaksi yang dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan menggunakannya (Sukarno 2005).
Kondisi lingkungan sangat mempengaruhi hasil pengujian, seperti suhu, kelembaban, cahaya, oksigen dan akses terhadap ruang pengujian. Kondisi tersebut dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi silang, menyebabkan perubahan media dan dapat mempengaruhi ketahanan mikroba. Dengan demikian faktor lingkungan harus dijaga secara ketat untuk memperoleh kondisi optimal. Pengaturan kondisi lingkungan sangat bervariasi antara laboratorium baik laboratorium lokal maupun internasional. Adanya variasi tersebut mengharuskan laboratorium yang akan mengadopsi suatu metode analisa melakukan validasi sekunder terhadap metode analisa tersebut.
Personil penguji sangat mempengaruhi hasil pengujian, sehingga diperlukan kemampuan dan pengalaman yang memadai. Pelatihan terstruktur diperlukan untuk meningkatkan pengetahuan dan ketrampilan personil dan merupakan hal mutlak yang harus dilakukan oleh suatu organisasi. Kemampuan dan ketrampilan penguji pada saat melakukan validasi primer metode analisa berbeda dengan personil yang akan mengadopsi metoda analisa tersebut. Validasi sekunder diperlukan untuk mengonfirmasi kemampuan dan ketrampilan personil.
Instrumen merupakan suatu sarana yang diperlukan dalam menganalisis mikroba. Instrumen yang diperlukan harus memiliki spesifikasi khusus dan dipelihara secara periodik. Kalibrasi dan monitoring secara teratur dapat menjamin mutu hasil pengujian. Penggunaan instrumen yang tidak benar dapat memberikan hasil yang tidak valid, sehingga validasi sekunder diperlukan untuk mengonfirmasi kinerja instrumen.
Karakteristik spesifik dari mikroba dapat diamati menggunakan media dan pereaksi. Spesifikasi dan penanganan media harus benar-benar diperhatikan dalam menganalisa mikroba target. Ada beberapa media dan pereaksi yang meskipun memiliki komposisi yang sama tetapi dapat memberikan hasil yang berbeda.
Validasi sekunder harus dilakukan untuk mengonfirmasi penggunaan media dan pereaksi sehingga mutu hasil pengujian dapat dipertanggungjawabkan.
Tujuan validasi sekunder adalah untuk memastikan, bahwa laboratorium/personel penguji dapat menerapkan metode tersebut dengan baik (ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji, ketrampilan, dan kompetensi). Selain itu validasi sekunder juga bertujuan untuk menjamin mutu hasil pengujian.
Dalam melakukan validasi sekunder, terdapat beberapa parameter yang harus diukur, yaitu jika pengujian bersifat kuantitatif maka parameter yang harus diukur adalah presisi dan akurasi sedangkan jika pengujian bersifat kualitatif maka parameter yang harus diukur adalah spesifisitas (USP 2007), seperti pada Tabel 4. Tabel 4 Paramater validasi sekunder untuk uji mikrobiologi
Parameter Uji Kualitatif Uji Kuantitatif
Akurasi Tidak Ya
Presisi Tidak Ya
Spesifisitas Ya Tidak
Limit Deteksi Tidak Tidak
Limit Kuantisasi Tidak Tidak
Linearitas Tidak Tidak
Kisaran Hitung Tidak Tidak
Ketahanan Tidak Tidak
Repeatabilitas Tidak Tidak
Kekasaran Tidak Tidak
Sumber: USP (2007)
Untuk menganalisa hasil verifikasi maupun validasi, data presisi dapat dievaluasi menggunakan persen standar deviasi relatif (RSD). Suatu metode analisa dapat diadopsi dalam suatu laboratorium jika nilai RSD berkisar < 5%.
Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persen recovery. Kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi mikroorganisme dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Suatu metode analisa dapat diadopsi jika hasil verifikasi memperoleh nilai recovery sebesar 90 – 110%.
Spesifisitas dapat dihitung menggunakan jumlah sampel positif yang menunjukkan hasil pengujian positif dibagi dengan hasil pengujian positif terhadap kontrol positif dikalikan 100%. Hasil penghitungan menunjukkan nilai recovery dari hasil validasi/verifikasi metode analisa (USP 2007). Idealnya, nilai recovery adalah sebesar 80% tetapi metode analisa dianggap valid jika nilai recovery berkisar 50 - 95% (AOAC 1999).
Untuk deteksi patogen, metode yang digunakan harus divalidasi sehingga mampu mendeteksi jumlah terendah dari organisme yang ditetapkan oleh metode baku tersebut. Apabila pedoman tersebut tidak ada di dalam metode baku sebagai pedoman umum, jumlah organisme yang digunakan sebagai inokulum dalam uji validasi untuk patogen dalam sampel yang diuji antara 10 – 100 koloni. Hasil positif untuk masing-masing mikroorganisme harus diperoleh. Strain mikroorganisme acuan yang digunakan harus tepat untuk ditetapkan dalam publikasi akhir dari baku yang relevan seperti metode baku APHA untuk pengujian air dan air limbah, British
pharmacopeia, Europian pharmacopeia dan metode baku AOAC(Sac 2002). Selain
itu, mikroorganisme yang digunakan sebagai baku dapat menggunakan produk komersial dengan sertifikat ATCC atau NCTC.
