BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi persyaratan validitas sehingga memberikan hasil analisis yang dapat dipercaya. Validasi dilakukan dengan 3 seri konsentrasi sebanyak 5 replikasi. Konsentrasi yang digunakan merupakan konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi dari konsentrasi seri baku, yaitu 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm. Pemilihan ketiga seri konsentrasi ini adalah untuk mewakili setiap konsentrasi dari seri baku, yaitu 50 ppm sampai 175 ppm. Parameter yang digunakan dalam penentuan validitas metode ini adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, danrange.
1. Selektivitas
Selektivitas metode menggambarkan kemampuan suatu metode untuk mengukur respon analit dalam sampel secara akurat diantara semua komponen yang terdapat dalam matriks sampel. Metode yang memenuhi persyaratan selektivitas, maka metode tersebut hanya mengukur kadar analit. Pengambilan
analit dari matriks sampel, dilakukan dengan mengekstraksi sampel dengan metanol pH 4. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ultrasonikator. Gelombang ultrasonik yang dihasilkan akan memberikan energi atau getaran yang akan mendorong kurkumin keluar dari serbuk simplisia yang tersuspensi dalam sampel, kemudian adanya metanol akan dapat menarik dan melarutkan kurkumin. Hal ini disebabkan karena kurkumin memiliki kelarutan yang baik dalam metanol. Namun banyak senyawa-senyawa dalam sampel yang juga memiliki kelarutan yang baik dalam metanol, sehingga dapat ikut terekstraksi bersama kurkumin, seperti demetoksikurkumin danbis-demetoksikurkumin, serta minyak atsiri. Oleh karena itu, selektivitas yang baik dari metode diperlukan untuk mengukur analit secara akurat tanpa terganggu oleh senyawa-senyawa lain yang terdapat dalam sampel.
Penentuan selektivitas dari metode KLT-Densitometri ini dapat dilihat dengan membandingkan nilai Rf baku dan Rf analit dalam sampel. Nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif suatu senyawa dalam campuran pada metode KLT, sehingga dapat digunakan sebagai parameter selektivitas. Parameter lain dari selektivitas adalah resolusi, dimana suatu metode dikatakan memiliki selektivitas yang baik apabila memiliki nilai resolusi > 1,5 (Swartz and Krull, 1997). Perbandingan nilai Rf antara baku dan analit dalam sampel serta nilai resolusi dapat dilihat pada tabel VI.
Tabel VI. Perbandingan nilai Rfbaku dan sampel, serta nilai resolusi Konsentrasi seri
larutan baku kurkumin (ppm)
Rfbaku Replikasi
sampel Rfsampel Resolusi
50 0,53 1 0,50 2,4 75 0,53 2 0,50 2,25 100 0,52 3 0,50 2,4 125 0,53 4 0,51 2,53 150 0,53 5 0,54 2,57 175 0,54 Rata-rata 0,53 0,51 2,43
Pada tabel VI dapat dilihat bahwa Rf baku dan analit dalam sampel menunjukkan nilai yang identik, dimana nilai Rf rata-rata dari baku adalah 0,53 dan Rf rata-rata dari analit dalam sampel adalah 0,51. Dari gambar 14 dan 15 dapat dilihat nilai Rfyang identik antara baku dan sampel. Sedangkan untuk nilai resolusi, pada gambar 15 dapat dilihat bahwa pada kromatogram sampel terdapat 3peakdan nilai rata-rata resolusi antarapeaknomor 3 denganpeakterdekat (peak nomor 2) adalah 2,43. Berdasarkan nilai Rf dan resolusi yang diperoleh tersebut, maka metode KLT-Densitometri ini dikatakan memenuhi parameter selektivitas dalam menetapkan kadar kurkumin.
Gambar 15. Rfsampel replikasi 1 = 0,50 2. Linearitas
Linearitas suatu metode ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) dari kurva baku, dimana nilai r ini menunjukkan korelasi hubungan antara konsentrasi dengan respon pengukuran, dalam hal ini AUC. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila nilai r > 0,999 (Yuwono and indrayanto, 2005).
Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil pembuatan kurva baku diperoleh nilai r untuk replikasi II = 0,9997 dan replikasi III = 0,9999. Nilai r yang kurva baku repliasi II dan III tersebut memenuhi persyaratan, sehingga dapat dikatakan metode KLT-densitometri ini memiliki linearitas yang baik dalam menetapkan kadar kurkumin.
3. Akurasi
Akurasi metode dalam suatu penelitian dinyatakan dengan nilairecovery. Recovery merupakan persen perolehan kembali kadar terukur terhadap kadar sebenarnya. Suatu metode dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila nilai % recoverynya antara 98-102% (Harmita, 2004).
Tabel VII. Data %recovery
Recovery(%) Kadar
kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V
50 ppm 101,10 100,11 99,00 100,75 98,95
100 ppm 101,64 100,77 101,79 100,10 98,61
175 ppm 101,99 100,18 102,72 103,83 100,96
Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai recovery yang masuk pada rentang 98-102% adalah konsentrasi level rendah hingga sedang. Pada level konsentrasi tinggi (175 ppm), metode ini memiliki nilai recoveryantara 100,18-103,83%, nilairecoveryyang diperoleh tidak memenuhi persyaratan akurasi yang baik yaitu 98-102% (Harmita, 2004). Oleh karena itu, metode ini dikatakan memiliki akurasi yang baik pada kadar 50 ppm dan 100 ppm, sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin pada level tersebut.
4. Presisi
Presisi merupakan parameter yang menggambarkan kedekatan hasil pengukuran satu dengan lainnya dalam kondisi analisis yang sama. Presisi dinyatakan dengan nilai Coefficient of Variation (CV) atau Relative Standar Deviation(RSD). Kriteria presisi yang baik yaitu nilai CV≤ 2% (Harmita, 2004).
Tabel VIII. DataCoefficientof Variation (CV)
Kadar kurkumin (ppm) SD CV (%)
50 ppm 50,2883 0,8552 1,7
100 ppm 100,5458 0,7125 0,7
175 ppm 179,4245 1,5902 0,9
Dari hasil perhitungan data yang diperoleh, nilai CV pada konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm kurang dari 2 %. Oleh karena itu, metode penetapan kadar kurkumin ini dikatakan memiliki presisi yang baik, sehingga penetapan
kadar kurkumin pada level konsentrasi tersebut menggunakan metode ini akan memberikan kedekatan hasil pengukuran.
5. Range
Rangemerupakan interval antara konsentrasi analit pada level bawah dan level atas dalam suatu sampel, yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
Gambar 16.Rangekonsentrasi kurkumin
Pada gambar 16 dapat dilihat bahwarangekonsentrasi metode ini adalah 50-100 ppm. Range ini menunjukkan area analisis yang memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel dilakukan dengan menambahkan baku kurkumin ke dalam matriks sampel. Namun sebelum melihat akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel, adisi baku kurkumin pada sampel juga dilakukan untuk memastikan bahwapeak dengan nilai Rf yang identik terhadap baku kurkumin memang merupakan peak senyawa kurkumin.
Linearitas dan presisi
Hal ini dapat diketahui dengan melihat apakah terjadi penambahan luas area pada peak yang dimaksud ketika dilakukan penambahan baku ke dalam sampel. Apabila luas area pada peak tersebut bertambah ketika baku kurkumin ditambahkan maka dapat dipastikan bahwa peak tersebut merupakan peak kurkumin. Berikut adalah gambar peak dari sampel tanpa penambahan baku dan sampel yang ditambah baku:
Gambar17. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin
Gambar18. Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin Berdasarkan hasil yang diperoleh, terjadi penambahan luas area pada peak yang memiliki nilai Rf identik terhadap baku kurkumin. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwapeaktersebut merupakan kurkumin.
Setelah dapat dipastikan bahwa peak dengan nilai Rf yang identik tersebut merupakan kurkumin, maka dilakukan penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah metode ini masih dapat mengukur respon baku kurkumin dalam matriks sampel secara akurat dan seksama. Akurasi dan presisi baku yang ditambahkan dapat dilihat pada tabel IX.
Tabel IX.Recoverydan CV baku kurkumin dalam matriks sampel Replikasi Recovery(%) CV (%) I 101,28 II 99,47 III 101,83 IV 96,99 V 103,55 2,5
Kadar baku yang ditambahkan pada sampel adalah 25 ppm, maka menurut USP, nilai recovery yang dapat diterima yaitu 90-107% dan nilai CV≤16%. Oleh karena itu, dari tabel IX dapat disimpulkan bahwa metode KLT-Densitometri ini dapat mengukur analit dalam matriks sampel secara akurat dan seksama.
49
