III. TIJAUA PUSTAKA
3.3 Validasi Metode Analisis
Validasi metode direkomendasikan untuk memastikan bahwa suatu metode dapat menghasilkan data yang akurat dan dapat dipercaya. Validasi dipergunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode terdahulu, atau terjadi perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis yaitu untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul (EURACHEM, 1998).
Validasi metode dilakukan dengan cara melakukan kecermatan (accuracy), keseksamaan (precision), selektifitas (specificity), linearitas dan rentang, batas deteksi atau limit of detection (LOD), batas kuantitasi atau limit of quantitation (LOQ), ketangguhan metode (ruggedness), dan uji kekuatan (robustness). Terdapat beberapa rujukan validasi metode seperti International Organization for Standardization (ISO), United State Pharmacopoeia (USP), British Pharmacopoeia (BP), Association of Official Analytical Chemistry (AOAC), International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) dan International Conference on Harmonizaton (ICH). Penelitian ini mengacu pada petunjuk validasi metode dari AOAC meliputi kecermatan, keseksamaan, linearitas, batas deteksi dan batas kuantitasi.
Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan juga dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat bergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu, untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu dan pelaksanaannya yang cermat dan sesuai prosedur (Harmita, 2004).
Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode adisi (standard addition method). Metode simulasi dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit bahan murni ke dalam plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo, maka dapat dipakai metode adisi. Dalam metode adisi, sampel dianalisis untuk diketahui komposisi awal analitnya, kemudian sampel ditambahkan sejumlah tertentu standar dan dianalisis kembali.
Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang ditambahkan).
Hasil uji recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya, sehingga akan diketahui nilai analisis error sistematisnya. Analisis dilakukan pada kondisi yang sama antara sampel dan sampel yang ditambahkan standar. Kesalahan sistematis adalah sama dengan minus kesalahan acak dan penyebab dari kesalahan ini tidaklah diketahui.
Uji keseksamaan atau presisi digunakan untuk mengevaluasi tingkat kedekatan antara hasil tes individu sampel tertentu sehingga diketahui kesalahan acak analisis (Harmita, 2004). Uji keseksamaan dapat berupa uji keterulangan (repeatibility) dan ketertiruan (reproducibility). Uji keseksamaan tidak berhubungan dengan nilai benar atau tidaknya nilai tersebut. Ukuran keseksamaan biasanya diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi).
Uji keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dilakukan dengan menggunakan sampel yang identik dari batch yang sama, sehingga dapat memberikan ukuran
13 keseksamaan pada kondisi yang normal. Sedangkan uji ketertiruan adalah keseksamaan metode yang dikerjakan pada kondisi berbeda. Analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik serta dari batch yang sama. Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda (Harmita, 2004).
Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematika yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita, 2004). Jika terdapat hubungan yang linear, hasil uji harus dievaluasi lebih lanjut secara statistik dengan perhitungan garis regresi. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y= a+ bx. Linieritas yang baik adalah persamaan yang memiliki R2 lebih dari 0,99. Dalam penentuan linieritas, direkomendasikan untuk menggunakan minimum lima konsentrasi (EMA,1995).
Uji batas deteksi atau Limit of Detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan memberikan respon yang signifikan oleh alat (Harmita, 2004), tetapi konsentrasi tersebut belum tentu dimiliki oleh sampel yang diujikan. Pengujian LOD dilakukan dengan 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasinya. LOD, dinyatakan oleh persamaan:
= + 3 keterangan:
LOD : Limit of Detection atau batas deteksi x : Rata-rata hasil pembacaan blanko SD : Standar deviasi
Uji batas kuantitasi atau Limit of Quantitation (LOQ) menurut Harmita (2004) adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Harmita selanjutnya menyatakan bahwa prinsip uji LOQ pada metode yang menggunakan instrumen dilakukan dengan membuat sederet blanko contoh sebanyak 7 – 10 kali ulangan. LOQ dinyatakan oleh persamaan:
= 10
keterangan:
LOQ : Limit of Quantitation atau batas kuantitasi SD : Standar deviasi
Selektifitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu secara akurat dan presisi walaupun terdapat komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Selektifitas dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode terhadap sampel yang mengandung cemaran seperti hasil urai atau senyawa sejenis atau senyawa asing lainnya, kemudian dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung cemaran.
Ketangguhan metode (ruggedness) adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboratorium dan antar analis.
14 Uji kekuatan (robustness) dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan metodologi yang kecil yang terjadi terus menerus. Uji kekuatan juga berfungsi untuk mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.
3.4 Potensiometri
Potensiometri merupakan suatu pengukuran tunggal terhadap potensial dari suatu aktivitas ion yang diamati, hal ini terutama diterapkan dalam pengukuran pH larutan (Basset, 1994).
Potensiometri merupakan aplikasi langsung dari persamaan Nernst dengan cara pengukuran potensial dua elektroda tidak terpolarisasi pada kondisi arus nol. Persamaan Nernst memberikan hubungan antara potensial relatif suatu elektroda dan konsentrasi spesies ioniknya yang sesuai dengan larutan.
Dengan pengukuran potensial reversible suatu elektroda, maka perhitungan aktivitas atau konsentrasi suatu komponen dapat dilakukan.
Prinsip potensiometri didasarkan pada pengukuran potensial listrik antara elektroda indikator dan elektroda yang dicelupkan pada larutan. Untuk mengukur potensial pada elektroda indikator harus digunakan elektroda standar yang berfungsi sebagai pembanding yang mempunyai harga potensial tetap selama pengukuran (Gandjar, 2007). Elektroda pembanding yang diambil sebagai baku international adalah elektroda hidrogen baku. Harga potensial elektroda ini ditetapkan nol pada kesadahan baku ( H+ )= 1 M, tekanan gas H2 = 1 atm dan suhu 25o C, sedangkan gaya gerak listrik ( GGL ) pasangan elektroda itu diukur dengan bantuan potensiometer yang sesuai, dan sering digunakan peralatan elektronik ( volt meter ).
Pada dasarnya setiap titrasi (asam–basa), kompleksiometri, ataupun titrasi redoks dapat dilakukan secara potensiometri dengan bantuan elektroda indikator dan elektroda pembanding yang sesuai (Ramsey dan Colichman, 1942). Dengan demikian diperoleh kurva titrasi yang menggambarkan grafik potensial volume penitran yang ditambahkan dan mempunyai kenaikan yang tajam disekitar titik kesetaraan (Gambar 3).
Gambar 3. Kurva titrasi potensiometri (Metrohm Application Bulletin no.98/3)
Gambar 3 menunjukkan hubungan antara satuan potensial yang dinyatakan dalam millivolt (mV) dan volume titran yang dikeluarkan alat dalam milliliter (ml). Grafik tersebut menunjukkan potensial berada pada titik paling tinggi ketika belum ada volume titran yang dikeluarkan untuk
300 U[mV]
700
500
100
0 1 2 3 4
V[ml]
15 mentitrasi. Seiring dengan bertambahnya volume titran yang dikeluarkan, maka mV yang ditunjukkan alat potensiometer akan turun hingga mencapai titik keseimbangan yang akan menyebabkan mV turun secara drastis hingga 0 mV dan tidak ada lagi titran yang dikeluarkan oleh alat. Hasil dari grafik tersebut yang ditunjukkan oleh titik hitam disebelah kanan kurva dapat diperkirakan merupakan titik akhir titrasi. Cara potensiometri cocok untuk menentukan titik akhir titrasi jika dalam percobaan tidak ada indikator yang cocok, misalnya saja analisa untuk larutan yang keruh atau bila daerah kesetaraannya sangat pendek (Rivai, 1995). Kelebihan potensiometri sebagai metode dalam menentukan kadar vitamin C adalah metode ini dapat mengukur kadar vitamin C secara cepat pada jus, tanaman dan material lainnya (Abdullin et al, 2001).
Prinsip potensiometri dengan titrasi (asam-basa) dapat dilakukan untuk menentukan kadar vitamin C pada produk susu bubuk. Penentuan kadar vitamin C susu bubuk dengan prinsip potensiometri dilakukan dengan menggunakan alat titrasi dengan merk Metrohm 702 SM. Alat ini menggunakan 2,6-dichlorophenol indophenol (DPIP) sebagai titran untuk menentukan kadar vitamin C dalam produk susu bubuk. Dibantu dengan campuran asam metafosfat/asam asetat glasial dan EDTA sebagai pereaksi. Penambahan campuran asam metafosfat/asam asetat glasial berfungsi untuk membuat larutan dalam keadaan asam dan sebagai penstabil karena larutan ini lebih stabil dalam keadaan asam (Andarwulan dan Koswara, 1992). EDTA berfungsi sebagai pengkelat logam terutama Fe dan Cu. Titik akhir titrasi dideteksi oleh alat potensiometer dengan menggunakan elektroda logam atau emas. Terjadinya perubahan warna menjadi warna merah muda menandai telah tercapainya titik akhir titrasi (Brady, 1999). Potensiometri dapat dilakukan untuk produk susu bubuk karena larutan susu bubuk yang berwarna keruh (Rivai, 1995).