SELATAN JAWA, INDONESIA
4 VERIFIKASI DAN VALIDASI SECARA GENETIK SPESIES UNDUR-UNDUR LAUT Emerita emeritus (CRUSTACEA:
HIPPIDAE)
Pendahuluan
Undur-undur laut merupakan sumber daya perikanan bernilai ekonomi yang hidup pada substrat berpasir di daerah intertidal. Undur-undur laut diketahui dapat dijumpai di beberapa wilayah pantai berpasir Indonesia, di antaranya pantai selatan Jawa, Bengkulu, Maluku, Bali, Sulawesi, dan Nusa Tenggara Barat (Boyko 2002; Boyko & Harvey 1999; Mashar et al. 2014; Wardiatno et al. 2015ab). Meskipun demikian, pemanfaatan undur-undur laut untuk kepentingan ekonomi hanya dilakukan di wilayah pesisir selatan Jawa Tengah, terutama di Kabupaten Cilacap dan Kebumen.
Informasi tentang manfaat ekonomi dan keberadaan undur-undur laut di kedua wilayah tersebut makin meluas, tidak hanya sekitar kedua wilayah tersebut, namun hingga ke wilayah lain di sekitarnya bahkan hingga pesisir Yogyakarta. Dampaknya nelayan yang melakukan penangkapan undur-undur laut di pesisir Cilacap dan Kebumen makin banyak, termasuk untuk mensuplai kebutuhan undur- undur laut ke wilayah pesisir Yogyakarta. Kondisi tersebut jika tidak dikontrol dan tidak diatur dapat memberikan tekanan makin tinggi pada populasi undur-undur laut di kedua wilayah tersebut. Oleh karena itu, diperlukan pengelolaan sumber daya undur-undur laut, terutama agar populasinya tetap lestari dan tetap memberikan manfaat ekonomi bagi masyarakat wilayah pesisir, terutama yang berada di wilayah pesisir Cilacap dan Kebumen.
Secara morfologi, undur-undur laut yang banyak ditemukan di wilayah pesisir Cilacap dan Kebumen berasal dari famili Hippidae yang terdiri dari 2 (dua) spesies, yaitu Emerita emeritus dan Hippa adactyla, dengan kelimpahan tertinggi dijumpai pada jenis E. emeritus (Mashar et al. 2014; Wardiatno et al. 2015b; Ardika et al. 2015). Dalam rangka pengelolaan undur-undur laut, maka harus ada kepastian taksonomi (taxonomy certainty) pada undur-undur laut yang terdapat di kedua wilayah tersebut, terutama kepastian untuk jenis E. emeritus yang merupakan jenis kosmopolitan untuk undur-undur laut di kedua lokasi penelitian. Undur-undur laut H. adactyla dari pantai Cilacap dan Kebumen sudah divalidasi secara molekuler dengan gen 16S rRNA (Muzammil et al. 2015).
Pada biota akuatik, penggunaan karakter morfometrik seringkali menunjukkan fenomena cryptic species, yaitu beberapa biota yang secara morfologi seolah-olah satu spesies padahal lebih dari satu spesies, dan fenomena complex species, yaitu beberapa biota yang secara morfologi seolah-olah berbeda spesies atau lebih dari satu spesies padahal satu spesies. Kedua fenomena tersebut seringkali mengakibatkan masalah sinonim yaitu terdapat nama ganda pada satu spesies yang sama atau sebaliknya, sehingga mengakibatkan kesalahan dalam identifikasi spesies pada biota akuatik, padahal kepastian taksonomi sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan suatu sumber daya (Bickford et al. 2006), seperti fenomena cryptic species pada ikan pari (Arlyza et al. 2013) dan fenomena complex species pada kima (Su et al. 2014). Fenomena cryptic species
berpotensi juga terjadi di undur-undur laut. Secara morfologi, undur-undur laut famili Hippidae pada penelitian ini teridentifikasi sebagai Emerita emeritus dan Hippa adactyla. Namun pada penelitian sebelumnya, terdapat peneliti yang mengidentifikasi famili Hippidae yang terdapat di pantai selatan Jawa Tengah sebagai E. analoga, E. talpoida, dan H. ovalis (Mursyidin 2007; Darusman et al. 2014). Oleh karena itu, perlu ada kepastian spesies untuk keperluan pengelolaan undur-undur laut, sehingga identifikasi secara morfologi tersebut perlu divalidasi dengan metode yang lebih akurat untuk menghindari kesalahan identifikasi, yaitu dengan pendekatan genetik atau molekuler.
Pendekatan molekuler melalui teknik DNA barcoding merupakan salah satu metode paling populer dan berkembang saat ini dalam mengatasi masalah kepastian taksonomi secara cepat dan akurat mulai dari tingkat spesies hingga subspesies dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida yang pendek terhadap berbagai spesies yang sulit dibedakan secara morfologi atau melalui karakter morfometrik (Tudge 2000). Gen Cythocrome Oxydase subunit I (COI) dan 16S rRNA merupakan gen-gen pada DNA mitokondria yang dapat dijadikan sebagai marka molekuler untuk penentuan spesies. Sifat unik dari urutan nukleotida polimorfisme DNA mitokondria (mtDNA) dapat memberikan informasi pada hubungan evolusi antara keluarga taksonomi terikat karena gen mitokondria berevolusi sekitar 10 kali lebih cepat dari DNA inti (Brown et al. 1979), sehingga mtDNA adalah penanda molekuler yang berguna untuk membantu identifikasi suatu organisme (Palumbi & Cipriano 1998). GenCOI pada mitokondria merupakan gen yang berevolusi sangat lambat (Solihin 1994), sedikit mengalami delesi dan insersi dalam sekuennya, serta mempunyai variasi yang sedikit (Hebert et al. 2003). Sedangkan Quan et al. (2004) menyatakan bahwa fragmen gen 16S rRNA cocok untuk memeriksa hubungan filogenetik pada level spesies atau genus pada krustasea. Dengan demikian, kedua gen mitokondria tersebut dapat digunakan sebagai penanda DNA atau DNA barcoding untuk undur-undur laut pada penelitian ini.
Bahan dan Metode
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah undur-undur laut jenis E. emeritus berdasarkan karakter morfologi (Mashar et al. 2014; Wardiatno et al. 2015b). Adapun untuk analisis molekuler, alat dan bahan yang digunakan di antaranya tube 1.5 ml, pengocok (shaker), mikro tip, mikro pipet, pistil, pemanas inkubator, sentrifuse, spin column, mesin visual ultraviolet, alkohol 96%, agarose 1.2%, akuades, kit Gene Aid, EtOH absolut, dan reagen PCR.
Undur-undur laut E. emeritus yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 20 ekor yang diambil dari undur-undur laut yang dikumpulkan dan digunakan untuk penelitian Komposisi Kelimpahan (Bab 2), dengan rincian: terdiri dari 10 ekor dari pantai Bunton Cilacap dan 10 ekor dari pantai Bocor Kebumen (untuk analisis DNA masing-masing digunakan 5 ekor per gen (COI dan 16S rRNA per lokasi). Dua puluh contoh undur-undur laut E. emeritus tersebut dimasukkan ke dalam tabung koleksi berukuran 100 ml yang berisi alkohol 96% dan dibawa ke Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan untuk analisis molekuler.
Isolasi dan Ekstraksi DNA. Dua puluh contoh undur-undur laut yang telah diawetkan dalam alkohol 96% diambil otot pada telson dengan bobot masing- masing 30 mg dan dicuci untuk menghilangkan kandungan alkohol. Kemudian contoh otot dikeringkan dan dimasukkan kedalam microtube untuk proses isolasi dan ekstraksi DNA menggunakan kit komersil (Gene Aid) berdasarkan manual pabrik dengan beberapa modifikasi.
Uji Kualitas DNA. Kualitas DNA diuji pada gel agarosa 1.2% dengan menggunakan larutan buffer TAE1x. Cetakan DNA total yang dipakai sebanyak 2.5 μl. Visualisasi DNA total dilakukan dengan menggunakan mesin ultraviolet.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA. DNA yang memiliki kualitas baik layak dijadikan sebagai cetakan untuk amplifikasi fragmen DNA gen COI dan 16s rRNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan kit komersial Kapa Extra Hot Start. Primer yang digunakan adalah primer universal untuk beberapa biota akuatik yang didisain oleh Butet (2013, unpublish data). Amplifikasi dilakukan pada suhu predenaturasi 94 0C selama 5 menit, suhu denaturasi 94 0C selama 45 detik, suhu annealing 53 0C selama 1 menit, suhu elongasi 72 0C selama 1 menit, suhu pascaelongasi 72 0C selama 5 menit, dan suhu penyimpanan 15 0C selama 10 menit. Produk PCR kemudian divisualisasi menggunakan gel agarosa 1.2% pada mesin ultraviolet.
Pengurutan Produk PCR(Sekuensing DNA). Produk PCR yang memiliki kualitas baik layak dilanjutkan ke tahap sekuensing untuk ditentukan sekuen basa nukleotidanya. Sekuensing dilakukan menggunakan metode Sanger et al. (1977) dengan mengirimkan produk PCR tersebut ke perusahaan jasa pelayanan sekuensing.
Pensejajaran Sekuen Nukleotida. Sekuen nukleotida hasil sekuensing disejajarkan dengan menggunakan metoda Clustal W yang terdapat pada software MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Sekuen nukleotida gen COI dan 16S rRNA Emerita emeritus dengan primer forward dan reverse diedit dan dianalis untuk mendapatkan sekuen DNA dari kedua gen tersebut. Sebagai ingroup, sekuen gen COI dan 16S rRNA E. emeritus disejajarkan antar contoh dan antar lokasi penelitian. Sebagai outgroup, sekuen gen COI E. emeritus disejajarkan dengan beberapa spesies lain dari ordo Decapoda dan infraordo Anomura, yaitu Panulirus stimsoni, P. ornatus, P. japonicas, P. cygnus, dan Lithodes nintokuae. Adapun untuk sekuen gen 16S rRNA, sebagai outgroup disejajarkan dengan beberapa spesies lain dari famili Hippidae, meliputi E. analoga, E. brasiliensis, E. portoricensis, E. benedicti, E. talpoida, E. holthuisi, H. adactyla, dan H. pacifica. Sekuen gen COI dan 16S rRNA spesies-spesies tersebut diunduh dari data GenBank.
Pensejajaran sekuen COI E. emeritus pada outgroup dengan spesies lain dari ordo Decapoda dan infraordo Anomura, bukan dari famili Hippidae, dikarenakan pada data GenBank belum terdapat data basa nukleotida secara lengkap (complete genome) dari spesies-spesies yang berasal dari famili Hippidae. Demikian juga hingga tingkat superfamili, juga belum terdapat data spesies dari superfamili Hippoidea pada GenBank yang mempunyai complete genome. Oleh karena itu, sekuen COI E. emeritus disejajarkan dengan spesies yang berada pada infraordo
yang sama (Anomura) dan ordo yang sama (Decapoda) yang memiliki complete genome pada GenBank.
Jarak Genetik. Jarak genetik sekuen gen COI Emerita emeritus dengan spesies lain dari ordo Decapoda dan jarak genetik sekuen gen 16S rRNA E. emeritus dengan spesies lain dari famili Hippidae dihitung menggunakan metode Kimura 2 parameter yang terdapat pada program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Hasil perhitungan jarak genetik disajikan dalam bentuk matriks data yang dapat digunakan untuk analisis hubungan kekerabatan antarspesies berdasarkan pohon filogeni.
Analisis Filogeni. Analisis filogeni E. emeritus dikonstruksi antara gen COI E. emeritus dengan Panulirus stimsoni, P. ornatus, P. japonicas, P. cygnus, dan Lithodes nintokuae; dan antara gen 16S rRNA E. emeritus pada penelitian ini dengan E. analoga, E. brasiliensis, E. portoricensis, E. benedicti, E. talpoida, E. holthuisi, H. adactyla, dan H. pacifica. Konstruksi pohon filogeni dibuat dengan menggunakan metode bootstrapped Neighbour-Joinning (NJ) dengan 1000 kali pengulangan yang terdapat pada program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011).
Hasil dan Pembahasan Amplifikasi DNA
Pada penelitian ini, dari 20 contoh E. emeritus, terdapat delapan contoh gen COI dari E. emeritus yang berhasil teramplifikasi dengan baik, terdiri dari tiga contoh berasal dari pesisir Cilacap dan lima contoh dari pesisir Kebumen (Gambar 5). Sedangkan untuk gen 16S rRNA, terdapat sepuluh contoh gen 16S rRNA dari E. emeritus yang berhasil teramplifikasi dengan baik, terdiri dari lima contoh berasal dari pesisir Cilacap dan lima contoh dari pesisir Kebumen (Gambar 6).
Keterangan: EK=Emerita emeritus Kebumen, EC= Emerita emeritus Cilacap Gambar 5. Visualisasi hasil amplifikasi gen COI Emerita emeritus yang berasal
Keterangan: EK=Emerita emeritus Kebumen, EC= Emerita emeritus Cilacap
Gambar 6. Visualisasi hasil amplifikasi gen 16S rRNA Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen
Target gen COI pada E. emeritus di dalam penelitian ini diperkirakan berada pada situs 675 hingga 1 358 yang mengacu pada gen COI spesies Anomura lainnya, yaitu Lithodes nintokuae (Gambar 7), sedangkan target gen 16S rRNA diperkirakan berada pada situs 195 hingga 713 yang juga mengacu pada gen 16S rRNA spesies L. nintokuae (Gambar 8). Spesies L. nintokuae merupakan spesies satu infraordo dengan E. emeritus, yaitu Anomura. Penggunaan L. nintokuae sebagai acuan dalam menentukan targen gen pada E. emeritus, baik berdasarkan gen COI maupun 16S rRNA, dikarenakan pada GenBank tidak ditemukan data dengan complete genome berdasarkan gen COI dan 16S rRNA pada spesies, genus, famili, dan superfamili yang sama dengan E. emeritus, namun hanya ditemukan pada tingkat infraordo Anomura yang mempunyai complete genome berdasarkan gen COI dan 16S rRNA, yaitu spesies L. nintokuae. Oleh karena itu, L. nintokuae dijadikan sebagai acuan dalam menentukan target gen COI dan gen 16S rRNA dari spesies E. emeritus.
Gambar 7. Target gen COI Emerita emeritus berdasarkan gen COI Lithodes nintokuae
Gambar 8. Target gen 16S rRNA Emerita emeritus berdasarkan gen 16S rRNA Lithodes nintokuae
Jarak genetik dan filogenetik
Jarak genetik menggambarkan hubungan kekerabatan antarspesies. Jarak genetik fragmen gen COI antara Emerita emeritus dengan spesies lain dari ordo Decapoda dan infraordo Anomura berkisar antara 0.256 – 0.318 dengan jarak genetik terendah terjadi antara E. emeritus Cilacap 2 dan 3, Kebumen 1 dan 3, dengan Lithodes nintokuae; dan jarak genetik tertinggi terjadi antara E. emeritus di seluruh lokasi kecuali E. emeritus Kebumen 4 dengan Panulirus stimsoni (NC 014339.1) (Tabel 4).
Jarak genetik fragmen gen 16S rRNA antara E. emeritus dengan spesies lain dari famili Hippidae berada pada kisaran 0.016 – 0.221 dengan nilai genetik terendah terjadi antara E. emeritus Cilacap 3 dan 4, Kebumen 1-5, dengan E. emeritus dari India (AF246156); dan jarak genetik tertinggi terjadi antara E. emeritus Cilacap 3 dan 4, Kebumen 1-5, dengan Hippa adactyla (KF051307) (Tabel 5).
Data-data dari matriks jarak genetik pada fragmen gen COI dan 16S rRNA digunakan untuk analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogeni. Pohon filogeni yang dikonstruksi berdasarkan gen COI dan gen 16S rRNA ditunjukkan pada Gambar 9 dan Gambar 10.
Tabel 4. Jarak genetik antara individu Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen serta spesies lainnya dari ordo dekapoda bedasarkan gen COI
Spesies (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (1) Emerita emeritus Cilacap 1
(2) Emerita emeritus Cilacap 2 0.001
(3) Emerita emeritus Cilacap 3 0.001 0.000
(4) Emerita emeritus Kebumen 1 0.001 0.000 0.000 (5) Emerita emeritus Kebumen 2 0.000 0.001 0.001 0.001
(6) Emerita emeritus Kebumen 3 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001
(7) Emerita emeritus Kebumen 4 0.003 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001
(8) Emerita emeritus Kebumen 5 0.000 0.001 0.001 0.001 0.000 0.001 0.003
(9) Panulirus stimpsoni NC 014339.1 0.318 0.318 0.318 0.318 0.318 0.318 0.315 0.318
(10) Panulirus ornatus GQ223286.1 0.308 0.306 0.306 0.306 0.308 0.306 0.304 0.308 0.176
(11) Panulirus ornatus HM446347 0.308 0.306 0.306 0.306 0.308 0.306 0.304 0.308 0.174 0.003
(12) Panulirus japonicus NC 004251 0.279 0.279 0.279 0.279 0.279 0.279 0.277 0.279 0.277 0.268 0.268
(13) Panulirus cygnus NC 028024.1 0.282 0.282 0.282 0.282 0.282 0.282 0.280 0.282 0.282 0.253 0.257 0.187
(14) Lithodes nintokuae AB769476.1 0.258 0.256 0.256 0.256 0.258 0.256 0.258 0.258 0.346 0.317 0.322 0.295 0.328 (15) Lithodes nintokuae NC 024202.1 0.258 0.256 0.256 0.256 0.258 0.256 0.258 0.258 0.346 0.317 0.322 0.295 0.328 0.000
Tabel 5. Jarak genetik antara individu Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen serta spesies lainnya dari famili Hippidae bedasarkan gen 16S rRNA
Spesies (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (1) Emerita emeritus Cilacap 1
(2) E. emeritus Cilacap 2 0.000 (3) E. emeritus Cilacap 3 0.049 0.049 (4) E. emeritus Cilacap 4 0.049 0.049 0.000 (5) E. emeritus Cilacap 5 0.000 0.000 0.049 0.049 (6) E. emeritus Kebumen 1 0.049 0.049 0.000 0.000 0.049 (7) E. emeritus Kebumen 2 0.049 0.049 0.000 0.000 0.049 0.000 (8) E. emeritus Kebumen 3 0.049 0.049 0.000 0.000 0.049 0.000 0.000 (9) E. emeritus Kebumen 4 0.049 0.049 0.000 0.000 0.049 0.000 0.000 0.000 (10) E. emeritus Kebumen 5 0.049 0.049 0.000 0.000 0.049 0.000 0.000 0.000 0.000 (11) E. benedicti_AF246155 0.113 0.113 0.118 0.118 0.113 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 (12) E. emeritus_AF246156 0.049 0.049 0.016 0.016 0.049 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 0.132 (13) E. holthuisi_AF246156 0.048 0.048 0.057 0.057 0.048 0.057 0.057 0.057 0.057 0.057 0.132 0.057 (14) E. analoga_L43107.1 0.180 0.180 0.175 0.175 0.180 0.175 0.175 0.175 0.175 0.175 0.160 0.175 0.185 (15) E. analoga_L43108.1 0.180 0.180 0.175 0.175 0.180 0.175 0.175 0.175 0.175 0.175 0.160 0.175 0.185 0.000 (16) E. benedicti_L43109.1 0.113 0.113 0.118 0.118 0.113 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.000 0.132 0.132 0.160 0.160 (17) E. talpoida_L43112.1 0.132 0.132 0.131 0.131 0.132 0.131 0.131 0.131 0.131 0.131 0.056 0.146 0.141 0.179 0.179 0.056 (18) E. talpoida_L43113.1 0.132 0.132 0.131 0.131 0.132 0.131 0.131 0.131 0.131 0.131 0.056 0.146 0.141 0.179 0.179 0.056 0.000 (19) E. talpoida_L43114.1 0.122 0.122 0.131 0.131 0.122 0.131 0.131 0.131 0.131 0.131 0.052 0.136 0.131 0.189 0.189 0.052 0.012 0.012 (20) E. brasiliensis_L43110 0.123 0.123 0.132 0.132 0.123 0.132 0.132 0.132 0.132 0.132 0.082 0.128 0.123 0.169 0.169 0.082 0.109 0.109 0.095 (21) E. portoricensis_L43111 0.104 0.104 0.113 0.113 0.104 0.113 0.113 0.113 0.113 0.113 0.044 0.127 0.095 0.169 0.169 0.044 0.069 0.069 0.065 0.073 (22) H. pacifica_AF246158 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.185 0.174 0.180 0.160 0.150 0.150 0.174 0.205 0.205 0.195 0.189 0.169 (23) H. adactyla_KF051307 0.194 0.194 0.221 0.221 0.194 0.221 0.221 0.221 0.221 0.221 0.194 0.232 0.194 0.199 0.199 0.194 0.200 0.200 0.200 0.226 0.200 0.136
Gambar 9. Konstruksi pohon filogeni Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen serta spesies lain dari infraordo Anomura dan ordo Decapoda berdasarkan gen COI
Gambar 10. Konstruksi pohon filogeni Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen serta spesies lainnya dari famili Hippidae berdasarkan gen 16S rRNA
Konstruksi pohon filogeni berdasarkan gen COI di atas menunjukkan bahwa spesies Emerita emeritus terpisah nyata dari spesies sesama infraordo Anomura, yaitu Lithodes nintokuae dengan jarak genetik sebesar 0.257. Konstruksi pohon filogeni di atas juga menunjukkan bahwa spesies E. emeritus terpisah nyata dari genus sesama ordo Decapoda, yaitu genus Panulirus, dengan nilai jarak genetik sebesar 0.287.
Konstruksi pohon filogeni berdasarkan gen 16S rRNA di atas menunjukkan bahwa spesies E. emeritus terpisah nyata dari spesies sesama genus Emerita dengan nilai jarak genetik sebesar 0.118. Konstruksi pohon filogeni di atas juga menunjukkan bahwa spesies E. emeritus terpisah nyata dari spesies sesama famili Hippidae, yaitu Hippa adactyla dan H. pacifica, dengan nilai jarak genetik sebesar 0.199. Berdasarkan pohon filogeni tersebut juga terlihat bahwa secara ingroup, individu-individu Emerita emeritus memiliki hubungan yang sangat erat, terutama berdasarkan gen COI dengan jarak genetik intraspesies sangat kecil, yaitu kurang dari sama dengan 0.003 (≤ 0.3%).
Dalam proses konstruksi pohon filogeni E. emeritus dengan spesies lain dari famili Hippidae, infraordo Anomura, dan orde Decapoda, baik dengan gen COI maupun gen 16S rRNA, dijumpai fenomena menarik pada populasi E. emeritus dari kedua lokasi penelitian. Berdasarkan kedua konstruksi pohon filogeni terlihat bahwa populasi E. emeritus Cilacap tidak terpisah secara nyata atau bercampur dengan populasi E. emeritus Kebumen. Bahkan pada konstruksi pohon filogeni E. emeritus berdasarkan gen COI terlihat populasi E. emeritus dari Cilacap dan Kebumen bercampur dalam nodus yang sama (kelompok Emerita pada Gambar 9). Pada konstruksi pohon filogeni E. emeritus berdasarkan gen 16S rRNA juga terlihat ada dua contoh E. emeritus dari Cilacap (Cilacap 3, 4) yang bercampur dengan E. emeritus Kebumen dalam satu nodus (kelompok Emerita nodus paling atas pada Gambar 10). Hasil analisis filogeni dengan gen 16S rRNA tersebut makin memperkuat dugaan bahwa populasi E. emeritus Cilacap dan Kebumen merupakan satu populasi dan terdapat konektivitas genetik yang kuat dari E. emeritus kedua lokasi, yang diperkuat dengan fakta bahwa secara spasial kedua lokasi tersebut berdekatan.
Fenomena spesies E. emeritus tersebut juga terjadi spesies dari famili Hippidae lainnya, yaitu Hippa adactyla, yang ditemukan di Cilacap dan Kebumen. Muzammil et al. (2015) melaporkan bahwa tidak ada jarak genetik antara undur- undur laut H. adactyla asal Cilacap dan Kebumen berdasarkan gen 16S rRNA. Setelah dilakukan analisis filogeni dengan menggunakan metode bootsrapped Neighbour Joining Tree dengan 1000 kali pengulangan didapatkan konstruksi filogeni H. adactyla asal Cilacap dan Kebumen memiliki nilai bootstrap 100. Hal tersebut menunjukkan bahwa cabang filogeni antar populasi H. adactyla asal Cilacap dan Kebumen memiliki kekerabatan dan menunjukkan konstruksi filogeni yang tidak berubah meskipun telah diulang sebanyak 1000 kali. Fakta tersebut mengindikasikan bahwa antara H. adactyla asal Cilacap dan Kebumen diperkirakan merupakan satu populasi.
Jarak genetik intra- dan interpopulasi
Berdasarkan gen COI, diketahui jarak genetik intrapopulasi Emerita emeritus yang berasal dari pesisir Cilacap adalah 0.00098, sedangkan jarak
intrapopulasi untuk E. emeritus yang berasal dari pesisir Kebumen adalah 0.00147. Jarak interpopulasi antara E emeritus yang berasal dari Cilacap dan Kebumen adalah 0.00098. Berdasarkan gen 16S rRNA diketahui jarak genetik intrapopulasi E. emeritus yang berasal dari pesisir Cilacap adalah 0.03062 dan yang berasal dari pesisir Kebumen adalah 0. Jarak interpopulasi antara E emeritus yang berasal dari Cilacap dan Kebumen adalah 0.03062. Hasil perhitungan jarak genetik intra- dan interpopulasi ini makin memperkuat dugaan bahwa populasi E. emeritus Cilacap dan Kebumen adalah bercampur atau satu populasi.
Urutan basa nukleotida
Urutan basa nukleotida gen COI dan 16S rRNA pada E. emeritus tidak didapatkan situs spesifik yang menjadi penciri bagi masing-masing populasi. Hasil ini juga memperkuat dugaan bahwa populasi E. emeritus dari Cilacap dan Kebumen adalah satu populasi. Hal tersebut dikarenakan tidak ada basa nukleotida pada individu-individu setiap populasi yang menjadi penciri khusus yang dapat menjadi pembeda yang jelas di antara individu undur-undur laut kedua lokasi penelitian.
Berdasarkan urutan basa nukleotida gen COI yang didapatkan diketahui bahwa tidak terdapat situs spesifik yang menjadi penciri bagi masing-masing populasi. Demikian juga berdasarkan urutan basa nukleotida gen 16S rRNA yang didapatkan juga tidak terdapat situs spesifik yang menjadi penciri bagi masing- masing populasi. Hasil ini semakin memperkuat dugaan di atas bahwa undur-undur laut E. emeritus yang berasal dari Cilacap dan Kebumen kemungkinan adalah satu populasi. Hal tersebut dikarenakan tidak ada basa nukleotida pada individu- individu setiap populasi yang menjadi penciri khusus yang dapat menjadi pembeda yang jelas diantara individu undur-undur laut dari kedua lokasi penelitian.
Berdasarkan hasil pensejajaran basa nukleotida juga diketahui adanya situs variabel, yaitu dua situs variabel pada urutan nukleotida gen COI dari kedua lokasi penelitian, yaitu perubahan situs nukleotida C menjadi T dan perubahan situs nukleotida G menjadi A; dan 13 situs variabel pada urutan nukleotida gen 16S rRNA dari kedua populasi penelitian. Kedua perubahan nukleotida ini termasuk ke dalam mutasi transisi, yaitu suatu pergantian basa purin dengan basa purin lain (dalam hal ini basa nukleotida G menjadi A) atau pergantian basa pirimidin dengan basa pirimidin lain (dalam hal ini basa nukleotida C menjadi T). Secara rinci situs variabel ini ditunjukkan pada Tabel 6 dan Tabel 7.
Tabel 6. Situs variabel gen COI pada Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen
Kode Contoh Emerita emeritus
Situs nukleotida ke-
1241 1318 Cilacap 1 C G Cilacap 2 C A Cilacap 3 C A Kebumen 1 C A Kebumen 2 C G Kebumen 3 C A Kebumen 4 T A Kebumen 5 C G
Tabel 7. Situs variabel gen 16S rRNA pada Emerita emeritus yang berasal dari pantai Cilacap dan pantai Kebumen
Kode Contoh
Emerita emeritus
Situs Nukleotida ke-
273 339 366 378 380 398 431 441 444 445 465 468 480 Cilacap 1 C T T T G C T T T T C C A Cilacap 2 C T T T G C T T T T C C A Cilacap 3 T C C C A T A C C C T T G Cilacap 4 T C C C A T A C C C T T G Cilacap 5 C T T T G C T T T T C C A Kebumen 1 T C C C A T A C C C T T G Kebumen 2 T C C C A T A C C C T T G Kebumen 3 T C C C A T A C C C T T G Kebumen 4 T C C C A T A C C C T T G Kebumen 5 T C C C A T A C C C T T G
Kepastian taksonomi (taxonomy certainty) sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan suatu sumber daya. Suatu spesies yang memiliki taksonomi secara morfologi yang sudah jelas, perlu dilakukan identifikasi secara molekuler guna mengetahui urutan basa nukleotida. Identifikasi molekuler dengan menggunakan sekuen gen COI dan gen 16S rRNA menyimpulkan bahwa 18 contoh undur-undur laut yang secara morfologi diidentifikasi sebagai E. emeritus adalah benar dan valid sebagai spesies E. emeritus berdasarkan pengunggahan pada BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Delapan contoh yang divalidasi dengan gen COI memiliki tingkat kemiripan sebesar 96% dan sepuluh contoh yang divalidasi dengan gen 16S rRNA mempunyai tingkat kemiripan sebesar 99% dengan data Emerita emeritus yang terdapat pada GenBank. Validasi jenis biota dengan gen COI dianggap valid seharusnya didapatkan tingkat kemiripan lebih atau sama dengan 97%, namun pada penelitian ini tingkat kemiripan contoh E. emeritus dengan data GenBank hanya 96%. Pada kasus penelitian ini, kondisi tersebut disebabkan karena pasangan basa nukleotida gen COI pada contoh E. emeritus berbeda dengan yang tersedia di GenBank. Pada penelitian ini, pasangan basa nukleotida gen COI contoh E. emeritus berasal dari bagian tengah hingga belakang, sedangkan data pasangan basa nukleotida gen COI E. emeritus yang tersedia di GenBank berasal dari bagian tengah agak ke belakang hingga bagian belakang. Kondisi ini mengakibatkan tidak semua pasangan basa nukleotida gen COI contoh E. emeritus bisa disejajarkan dengan pasangan basa nukleotida gen COI E. emeritus yang tersedia di GenBank, sehingga tingkat kemiripannya hanya sampai 96%.
Simpulan
Contoh undur-undur laut yang digunakan pada penelitian ini, yang secara morfologi diidentifikasi sebagai spesies Emerita emeritus telah berhasil divalidasi secara molekuler berdasarkan gen COI dengan tingkat akurasi 96% dan gen 16S rRNA dengan tingkat akurasi 99% sebagai spesies E. emeritus. Secara populasi, populasi E. emeritus dari Cilacap dan Kebumen berdasarkan gen COI dan gen 16S rRNA diduga satu populasi atau populasinya bercampur.