Vitamin merupakan salah satu zat gizi yang penting bagi tubuh. Beberapa vitamin berfungsi sebagai bagian dari koenzim, yang tanpa vitamin itu enzim tersebut tidak efektif sebagai biokatalis. Koenzim seperti itu seringkali merupakan bentuk vitamin yang difosforilasi dan berperan dalam metabolisme lemak, protein, dan karbohidrat. Beberapa vitamin terdapat dalam makanan sebagai provitamin atau senyawa yang bukan vitamin. Provitamin adalah senyawa yang tidak
termasuk vitamin, namun dapat diubah menjadi vitamin, seperti β-karoten yang bisa diubah menjadi vitamin A pada dinding usus (Nasoetion 1987). Vitamin dibedakan menjadi dua berdasarakan kelarutannya, yaitu vitamin yang larut lemak dan vitamin larut air.
Vitamin larut lemak merupakan molekul hidrofobik yang semuanya adalah turunan isoprene. Asupan vitamin-vitamin larut lemak memerlukan absorpsi lemak yang normal agar vitamin tersebut dapat diangkut dalam darah, yaitu oleh lipoprotein atau protein pengikat yang spesifik. Vitamin larut lemak yang terdiri dari vitamin A, vitamin D, vitamin E, dan vitamin K (Ottaway 1993). Vitamin larut air termasuk dalam zat hidrofilik. Kelompok vitamin larut air yaitu tiamin, riboflavin, niasin, vitamin B6, vitamin B12, asam folat, asam pantotenat, biotin, dan vitamin C. Vitamin larut air terjadi secara alami di lebih dari satu proses aktif biologi. Vitamin larut dalam air biasanya lebih labil dibanding dengan vitamin yang larut dalam lemak. Kebanyakan dari kelompok vitamin ini, kecuali vitamin
B12, mempunyai penyebaran yang luas baik itu pada makanan hewan dan juga pada makanan tumbuhan, walaupun jumlahnya sangat kecil (Ottaway 1993). Kebanyakan vitamin yang larut dalam air berfungsi sebagai koenzim atau gugus prostetik enzim yang penting dalam metabolisme sel. Vitamin B merupakan contoh dari vitamin yang larut air. Vitamin B terdiri dari vitamin B1 (tiamin), vitamin B2 (riboflavin), vitamin B3 (niasin), vitamin B6, dan vitamin B12 (Lehninger 1990).
2.3.1 Vitamin B12
Vitamin B12 terdiri atas cincin mirip porifirin seperti hem, yang mangandung kobalt serta terkait pada ribose dan asam fosfat. Vitamin B12 adalah kristal merah yang larut air. Warna merah karena adanya kobalt. Kobalt merupakan salah satu mineral yang banyak terkandung dalam tanah. Vitamin B12 terbentuk dari hasil sintesis bakteri dalam usus yang kemudian disimpan dalam hati. Vitamin B12 terkandung dalam makanan dalam jumlah sedikit, sumber utama vitamin B12 berasal dari hati sapi. Vitamin B12 banyak terkandung dalam hasil perairan, diantaranya terkandung dalam sardin, bandeng, tuna, kembung, dan kekerangan. Manusia mendapatkan vitamin B12 dari konsumsi hati, ikan, ginjal, telur, susu, dan daging. Vitamin B12 yang terbentuk melalui sintesis bakteri pada manusia tidak dapat diabsorbsi karena sintesis terjadi dalam kolon (Almatsier 2006). Gambar struktur vitamin B12 dapat dilihat pada Gambar 4.
Vitamin B12 secara perlahan rusak oleh asam encer, alkali, cahaya dan bahan-bahan pengoksidasi dan pereduksi. Pada pemasakan, kurang lebih 70% vitamin B12 dapat dipertahankan. Dalam keadaan normal sebanyak ± 70% vitamin B12 yang dikonsumsi dapat diserap oleh tubuh. Vitamin B12 diperlukan untuk mengubah folat menjadi bentuk aktif dan memperlancar proses metabolisme. Vitamin B12 juga merupakan kofaktor dua jenis enzim pada manusia, yaitu metionin sintetase dan metilmalonil-Ko A mutase. Gejala kekurangan vitamin B12 ditandai dengan anemia. Kekurangan vitamin B12 dapat menimbulkan dua jenis sindroma, yaitu sindroma berupa gangguan sintesis DNA yang menyebabkan gangguan perkembangbiakan sel dan sindroma berupa gangguan saraf yang menunjukkan degenerasi otak, saraf mata, saraf tulang belakang, dan saraf perifer (Almatsier 2006).
2.3.2 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak baik cairan polar maupun non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi (Adnan 1997). Dalam kromatografi partisi cair baik fase stasioner maupun fase mobil berupa cairan. Pelarut yang digunakan harus tidak dapat bercampur. Perlarut yang lebih polar biasanya digunakan sebagai fase stasioner, oleh karena itu sistem ini dinamakan kromatografi fase normal (normal phase chromatography). Bila fase stasioner yang dipakai senyawa non polar, sedangkan fase mobilnya polar atau terbalik dengan sistem fase normal maka sistemnya disebut kromatografi fase (reverse
phase chromatography). Komponen utama alat yang dipakai dalam HPLC antara
lain (1) reservoir zat pelarut untuk fase gerak; (2) pompa; (3) injektor; (4) kolom; (5) detektor dan (6) rekorder (Adnan 1997).
Komposisi vitamin dapat ditentukan menggunakan HPLC (Robinson et al.
2001). Penggunaan HPLC yang digabungkan dengan detektor flourimetrik memungkinkan sebagai metode khusus dan sensitif yang dapat dikembangkan untuk penentuan beberapa vitamin dalam bahan makanan, diantara banyak metode yang dianjurkan, vitamin merupakan yang paling sering diuji dalam bentuk bebas, meliputi hidrolisis dari bentuk fosforilase (Ndaw et al. 2000).
Zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis. Hal yang harus diperhatikan adalah tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut tersebut. Cara yang dipakai dapat bermacam-macam, misalnya dengan pemanasan, perlakuan vakum, atau dengan mengalirkan gas yang bersifat inert seperti helium (Adnan 1997).
Menghilangkan gas atau udara dalam pelarut yang dipakai sebagai fase gerak penting, karena pada waktu dialirkan dengan pompa, aliran fase gerak dapat terbentuk gelembung gas, sehingga dapat menyebabkan aliran menjadi diskontinyu dan dapat mengganggu kromatogram yang dihasilkan (Adnan 1997). Pompa
Pompa diperlukan sebagai fase gerak dengan kecepatan dan tekanan yang tetap. Tatanan yang diperlukan tergantung dari ukuran kolom dan viskositas dari pelarut. Pada kolom yang umum dipakai, yaitu berdiameter 5 mm dengan kecepatan aliran 1-2 ml/menit dan tekanan yang diperlukan mencapai 400 bar. Sistem pompa pada HPLC telah diprogram untuk dapat melakukan elusi dengan satu atau dua lebih macam pelarut. Ada dua teknik elusi yang digunakan dalam HPLC, yaitu :
1) teknik isokratik, merupakan teknik elusi dengan komposisi fase gerak yang tidak berubah selama analisis berlangsung sehingga polaritas fase geraknya tetap.
2) teknik elusi gradien, merupakan teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak yang berubah secara periodik, umumnya digunakan untuk contoh yang mengandung komponen dengan polaritas berbeda-beda (Adnan 1997).
Injektor
Pada waktu sampel disuntikkan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom atau digunakan katup injeksi, dimana sampel diinjeksi ke dalam holding loop. Aliran pelarut dari pompa kemudian dialirkan melalui loop yang seterusnya akan mendesak sampel masuk ke ujung kolom (Adnan 1997).
Kolom
kolom merupakan jantung atau inti dari keseluruhan peralatan kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis tergatung pada pilihan kolom dan kondisi kerja, karena pemisahan komponen analit terjadi pada kolom. Berdasarkan jenis fase diam dan fase geraknya, kolom terbagi menjadi dua, yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal jika fase diamnya lebih polar dari fase geraknya, sebaliknya fase terbalik jika fase geraknya lebih polar dari fase diamnya (Gritter et al. 1991).
Detektor
Cairan fase gerak yang keluar dari kolom langsung dialirkan ke detektor untuk dideteksi komponen-komponennya. Pendeteksian ini berguna untuk menentukan komponen-komponen dalam sampel baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa persyaratan detektor, yaitu memiliki sensitifitas tinggi, stabil, memiliki reprodusibilitas yang baik, dapat bekerja pada suhu kamar sampai 400oC, dan tidak terpengaruh oleh perubahan suhu dan kecepatan pelarut pengembang, serta tidak merusak contoh (Gritter et al. 1991).
