ABSTRAK
FERMENTASI HIDROLISAT ONGGOK DENGAN MENGGUNAKAN MIKROBA ENDOFITIK
Oleh
Muhamad Amin
ABSTRACT
FERMENTATION OF ONGGOK HYDROLYZATES BY ENDOPHYTIC MICROBES
By
Muhamad Amin
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ... i
DAFTAR TABEL ... iii
DAFTAR GAMBAR ... iv
I. PENDAHULUAN ... 1
A.Latar Belakang ... 1
B.Tujuan Penelitian ... 2
C.Manfaat Penelitian ... 3
II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4
A.Pembuatan Tepung Tapioka ... 4
B.Onggok ... 5
C.Pati ... 5
D.Hidrolisis Pati ... 6
E.Fermentasi Alkohol ... 9
F. Mikroba Endofitik ... 10
G.Isolasi dan Karakterisasi Mikroba Endofitik ... 11
H.Fase Pertumbuhan Bakteri ... 17
I. Analisis kadar alkohol ... 18
J. Analisis gula reduksi dengan metode DNS (Dinitrosalisilat) ... 19
III. METODOLOGI ... 21
A.Waktu dan Tempat Penelitian ... 21
B.Alat dan Bahan ... 21
C.Prosedur Penelitian ... 22
1. Pembuatan media perkembangbiakan mikroba endofitik ... 22
a. Pembuatan media nutrien agar (NA) ... 22
b. Pembuatan media inokulum ... 22
2. Penyiapan Contoh Kulit Kayu Raru ... 23
3. Penapisan Mikroba Endofitik pada Media NA ... 23
4. Isolasi Mikroba Endofitik Hasil Penapisan ... 23
5. Pemurnian Mikroba Endofitik ... 24
7. Penentuan Pertumbuhan Sel Mikroba Endofitik ... 24
8. Pengeringan Onggok ... 25
9. Ultrasonifikasi ... 25
10. Hidrolisis Onggok ... 25
11. Fermentasi Onggok Dengan Mengunakan Mikroba Endofitik ... 26
12. Analisis kadar alkohol ... 26
13. Analisis gula reduksi dengan metode DNS ... 27
IV. HASIL DAN PEMBAHASA ... 27
A. Penapisan dan Isolasi Mikroba Endofitik ... 27
B. Pemurnian Mikroba Endofitik ... 28
C. Pertumbuhan Sel Mikroba Endofitik ... 29
D. Fermentasi Onggok Dengan Menggunakan Mikroba Endofitik ... 32
E. Analisis kadar alkohol ... 32
F. Analisis gula reduksidengan metode DNS... 35
V. SIMPULAN DAN SARAN ... 38
A. Simpulan ... 38
B. Saran ... 39 DAFTAR PUSTAKA
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya dengan hasil bumi dan memiliki tanah yang subur untuk menghasilkan berbagai produk pertanian. Salah satunya adalah adalah ubi kayu atau singkong (Manihot esculenta), dengan jumlah produksi mencapai 9.321.545 ton pada tahun 2012 (BPS Indonesia, 2012). Selain dimanfaatkan sebagai makanan tradisional, singkong telah dimanfaatkan oleh industri besar untuk menghasilkan tepung tapioka yang memiliki nilai ekonomi lebih tinggi karena dapat diolah menjadi berbagai macam produk seperti makanan ringan, glukosa, fruktosa dan sorbitol.
2
Dalam aspek fermentasi gula pereduksi menjadi bioetanol, salah satu potensi yang dimiliki Indonesia namun belum banyak diteliti adalah mikroba endofitik yang terkandung dalam kulit kayu raru. Potensi ini didasarkan pada pemanfaatan kulit kayu raru untuk pengolahan nira menjadi minuman tradisional (tuak) khususnya oleh masyarakat suku batak. Untuk menggali potensi ini, dalam penelitian sebelumnya oleh Trisnawati dan Suka (2007) telah menggunakan kulit kayu raru untuk fermentasi hidrolisat onggok, dan diketahui mampu menghasilkan etanol dengan kadar sekitar 25%. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa dalam kulit kayu tanaman raru ini terdapat mikroba endofitik yang mampu mengubah gula pereduksi dalam hidrolisat onggok menjadi alkohol. Hasil studi pendahuluan isolasi mikroba endofitik oleh Amin (2012) dan Elianasari (2012), diperoleh 12 jenis mikroba endofitik dalam kulit kayu raru yang kemungkinan berpotensi untuk fermentasi gula pereduksi menjadi bioetanol (Amin, 2012; Elianasari, 2012). Dikaitkan dengan mikroba endofitik yang hidup dalam kulit kayu raru, penelitian ini dimaksudkan sebagai upaya lebih lanjut untuk mendapatkan isolat mana yang paling berpotensi untuk fermentasi hidrolisat onggok menjadi etanol.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan isolat mikroba endofitik dari kulit kayu raru yang memiliki kemampuan menghasilkan bioetanol dari hidrolisat onggok.
C. Manfaat Penelitian
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Pembuatan Tepung Tapioka
[image:11.612.237.509.330.647.2]Tepung tapioka dibuat dengan mengekstrak bagian umbi singkong dengan tahap dapat dilihat dalam Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Diagram alir pembuatan tepung tapioka (Rahman, 2007) Pati singkong ( tepung tapioka)
Pengeringan
Ampas Pengendapan
Pencucian pati Penyaringan
Pemarutan
Dari proses pembuatan tepung tapioka, dihasilkan limbah sekitar 2/3 bagian atau sekitar 3/4 dari bahan mentahnya, berupa limbah cair dan padat yaitu kulit dan ampas (onggok). Limbah cair tepung tapioka memiliki kisaran 10 – 15% dari total bobot singkong, sedangkan limbah kulit menempati kisaran 16% dari total bobot singkong, dan onggok sendiri dihasilkan sekitar 10 – 30% dari berat singkong (Pandey et al., 2000).
B. Onggok
Onggok (ampas) singkong merupakan limbah padat dari pembuatan tepung tapioka. Susijahadi, (1997) menyatakan bahwa komposisi onggok tepung tapioka sangat bervariasi bergantung pada jenis/varietas singkong, daerah asal serta cara pengolahan tepung tapioka. Kandungan pati dari onggok sekitar 50 – 70% (Pandey et al., 2000) dan serat kasar sekitar 8 % (Judoamidjojo, dkk., 1992), kandungan pati yang cukup tinggi ini, sehingga dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan alkohol (Astuti, 2008).
C. Pati
6
cadangan makanan yang tergolong dalam homopolimer glukosa dengan ikatan L-glikosidik. Pati terdiri dari dua fraksi, yaitu amilosa dan amilopektin
[image:13.612.154.507.218.421.2](Soebagio dkk., 2009). Pati singkong dari tepung tapioka memiliki rasio 17% amilosa dan 83% amilopektin. Struktur amilosa dan amilopektin dapat dilihat pada Gambar 2 berikut ini.
Gambar 2. Struktur amilosa dan amilopektin
D. Hidrolisis Pati
hidrolisis enzimatis akan memutus rantai polimer secara spesifik pada percabangan tertentu. Hidrolisis dapat digolongkan menjadi hidrolisis murni, hidrolisis asam (penambahan katalisator asam) dan hidrolisis enzim (BeMiller dan Whistler, 2009). Hidrolisis ampas singkong terjadi antara ampas singkong dengan air. Pada reaksi hidrolisis ini air akan memecah komponen karbohidrat atau hemiselulosa menjadi gula atau monosakarida yang lebih sederhana seperti glukosa, galaktosa, dan mannosa (Agra, dkk., 1973).
Proses hidrolisis onggok yang dilakukan dengan menggunakan asam untuk mengubah pati menjadi molekul yang lebih kecil lagi bahkan mengubah pati menjadi gula pereduksi. Masing-masing proses hidrolisis baik menggunakan asam maupun enzim memiliki kelebihan dan kekurangan. Hidrolisis asam menghasilkan proses yang lebih murah namun produk yang dihasilkan tidak sebaik yang dihasilkan dari hidrolisis menggunakan enzim yang tentunya jauh lebih mahal (BeMiller dan Whistler, 2009). Jika onggok dipanaskan dengan asam akan terurai menjadi molekul-molekul yang lebih kecil secara berurutan dan hasilnya adalah glukosa.
(C6H10O5)n + n-1 H2O nC6H12O6
Pati Air Glukosa
8
katalis banyak dipengaruhi oleh konsentrasi katalis yang diberikan (Stout and Ryberg, 1989). Penambahan asam sulfat dapat juga mempengaruhi pH. Bila pH mendekati netral, maka jumlah asam yang dikandung relatif rendah sehingga ikatan glikosida yang membentuk polisakarida lebih kuat dibandingkan dengan suspensi pati yang mengandung jumlah asam yang lebih tinggi. Akibatnya proses pemutusan rantai heksosa dari ikatan polisakarida yang mendekati pH netral menjadi lebih sulit (Meyer, 1970).
Hidrolisis dengan enzim, enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk dalam bentuk gula sederhana seperti glukosa, froktosa, dan galaktosa. Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senyawa intermediat melalui suatu reaksi kimia organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi membutuhkan waktu lebih lama (BeMiller dan Whistler, 2009). Hasil dari kedua hidrolisis ini adalah Hidrolisat pati, hidrolisat pati ini dihasilkan dari proses hidrolisis pati. Hidrolisat pati mempunyai total nilai gula pereduksi (DE) yang
bervariasi. Hidrolisat pati yang dibuat memiliki total nilai gula pereduksi
E. Fermentasi Alkohol
Fermentasi alkohol merupakan kegiatan mikroba pada bahan pangan sehingga dihasilkan alkohol. Alkohol yang dihasilkan salah satunya adalah etanol, Etanol umumnya digunakan dalam minuman beralkohol, dan bagi masyarakat luas etanol juga digunakan sebagai bahan bakar yang diproduksi oleh peragian (fermentasi). Ketika peragian berlangsung metabolisme gula terjadi secara anaerob menghasilkan etanol dan gas karbondioksida. Persamaan reaksinya adalah :
Mikroba yang umum digunakan dalam fermentasi adalah bakteri, ragi dan kapang. Beberapa contoh proses fermentasi diantaranya adalah pembuatan tempe, tape, susu fermentasi dan sebagainya. Mikroba yang terlibat pada fermentasi alkohol adalah Saccharomyces Cerevisiae. Etanol yang diproduksi secara fermentasi dengan menggunakan yeast, yaitu S. cerevisiae masih dianggap kurang memuaskan dalam sudut pandang industri, terutama karena harganya yang relatif mahal dan prosedurnya yang cukup rumit. Selain itu, mikroorganisme ini hanya dapat menghasilkan etanol sekitar 14−16% ( Gunasekaran, 1999). Selain itu, dapat digunakan bakteri Zymomonas mobilis untuk menghasilkan etanol. Etanol yang dihasilkan oleh
10
lebih tinggi dan tahan terhadap kadar etanol yang tinggi (Gunasekaran, 1986; Tanate dan Putra, 2008).
F. Mikroba Endofitik
Mikroba endofitik merupakan mikroba yang tumbuh dalam jaringan tumbuhan, yaitu pada jaringan akar, batang dan daun. Mikroba endofitik dapat diisolasi dari jaringan tersebut, dan yang paling umum ditemukan adalah dari jenis fungi dan bakteri (Strobel, 2003). Mikroba ini berasosiasi dengan jaringan tanaman sehat yang bersifat netral atau menguntungkan. Hampir setiap tanaman tingkat tinggi memiliki beberapa mikroba endofitik yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder. Bahan aktif yang dihasilkan mikroba endofitik ini diperkirakan memiliki kemampuan yang sama dengan bahan aktif yang dihasilkan oleh tanaman induknya.
Beberapa keuntungan mikroba ini adalah meningkatkan pertumbuhan tanaman dan kekuatan menyerap nutrisi tanaman. Demikian pula dengan banyaknya kandungan sebagai agen biokontrol, endofitik juga memproduksi biokontrol berikut aktivitas produksi senyawa antimikroba, persaingan untuk mempertahankan tempat hidup dan nutrisi serta stimulasi pertahanan inangnya; sebagai mekanisme inhibisi mereka terhadap berbagai patogen(Ting, dkk, 2010). Bakteri endofit bersifat diazotrof dalam tanaman induk yang sudah dibuktikan oleh banyak peneliti (Boonjawat et al. 1991;
Dong et al. 1994; Muthukumarasamy et al. 2002), dan bahkan bentuk asosiasi
obligate endophyte bakteri diazotrof pada tanaman induk ditunjukkan oleh
persistensi bakteri dalam jaringan tanaman tersebut, yaitu bakteri akan tetap
terbawa dalam jaringan tanaman yaitu jaringan akar, batang, daun dan kulit
kayu.
G. Isolasi dan Karakterisasi Mikroba Endofitik
12
Peran mikroba endofitik yang memiliki aktivitas antimikroba dapat terlihat pula dalam tanaman kedelai yaitu sebagai antijamur Sclerotium rolfsii Sacc yang menyebabkan penyakit busuk batang. Menurut Taringan dan kuswandi (2010), metode isolasi dengan merendam batang kedelai dengan Na3OCl 5,25 % selama 5 menit, kemudian dicuci dengan menggunakan akuades steril, selanjutnya digerus dengan menambahkan 10 mL akuades dan hasil gerusan ditanam pada media NA (Nutrient Agar). Isolat yang didapat berjumlah 6 dari jenis bakteri dengan bentuk coccus dan bacillus serta termasuk dalam gram negatif dan positif. Uji aktivitas antimikroba pada 6 isolat, semua isolat positif memiliki kemampuan antijamur S. rolfsii Sacc yang menyebabkan penyakit busuk batang (Taringan dan Kuswandi, 2010).
Tidak hanya mikroba endofitik yang berasal dari tanaman kedelai yang mampu menghasilkan aktivitas anti jamur, tetapi aktivitas antijamur dan antibakteri dapat dimiliki oleh jamur endofitik yang diisoolasi dari tanaman kentang (Sunarni, 2010). Menurut Sunarni (2010), jamur uji diperoleh dari isolasi tanaman kentang di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga serta telah diidentifikasi dan merupakan Penisillium sp. Berdasarkan uji aktivitas anti jamur dan anti bakteri, disimpulkan bahwa jamur ini berpotensi sebagai Anti jamur Fusarium sp, Phytopthora infestans dan Anti Bakteri dan Ralstonia solanacaerum.
menggunakan metode steril permukaan dan tanam langsung pada media PDY (Potato Dextro Yeast) didapatkan 10 kapang. isolat kapang endofit menunjukkan hasil uji hayati antimikroba yang positif terhadap bakteri. Sementara hanya 3 isolat kapang endofit yang menunjukkan basil positif terhadap khamir. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa antimikroba yang dihasilkan kapang endofit bersifat spesiiik terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Sedangkan 3 isolat lain hanya spesifik terhadap khamir Candidaalbicans. Isolat yang diperoleh dari hasil penelitian ini isolat kapang
endofit yang mempunyai kemampuan menghasilkan senyawa antimikroba yang lebih kuat terhadap bakteri gram negatif jika dibandingkan terbadap bakteri gram positif. Sedangkan pada isolat lain menunjukkan kemampuan senyawa antimikroba pada bakteri gram positif dan gram negatif. Metabolit sekunder kapang yang aktif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan B. subtilis dapat dikembangkan menjadi baban baku untuk obat antimikroba
Grampositif. Sedangkan yang aktif atau memberikan hasil positif terhadap bakteri E. coli dan Salmonella typhii mempunyai prospek untuk dijadikan bahan baku obat antimikroba gram negatif (Kumala dkk., 2006).
Mikroba endofitik yang berasal dari tanaman nilam (Pogostemon cablin Bent.) yang memiliki kemampuan dalam mengendalikan nematoda peluka
akar (Pratylenchus brachyurus) (Harni dkk., 2007). Menurut Harni dkk.
(2007), mikroba endofitik yang diisolasi dengan menggunakan metode
sterilisasi permukaan (Hallmann et al. 1997), didapat 9 isolat yaitu
P. fluorescent ES32 mampu memproduksi (protease, HCN, pelarut posfat,
14
kitinase), B. subtilis ERB21 (protease, selulase, dan pelarut posfat), Bacillus
NA22 (protease, pelarut posfat), Bacillus NJ41 ( selulase, pelarut posfat),
Bacillus NJ46 (pelarut posfat, kitinase), Bacillus NJ57 (pelarut posfat,
kitinase), Bacillus NJ2 (pelarut posfat). Kemampuan Bacillus NJ46, Bacillus
NA22, dan Bacillus NJ2 dalam menekan populasi P. brachyurus cukup
tinggi. Terjadinya penekanan populasi nematoda yang tinggi oleh
isolat-isolat tersebut, diduga disebabkan oleh metabolit sekunder, enzim kitinase,
dan protease yang dihasilkannya. Enzim ini dapat digunakan langsung oleh
bakteri untuk mendegradasi dinding sel patogen. Enzim kitinase merupakan
enzim penting yang dihasilkan bakteri endofit untuk mengendalikan
nematoda karena enzim ini dapat mendegradasi lapisan tengah telur nematoda
seperti M. javanica, R. reniformis, Tylenchulus semipenetrans, dan
Pratylenchus minyus (Tian et al. 2000).
Tingginya penurunan populasi nematoda tidak selalu sejalan dengan
peningkatan pertumbuhan tanaman (berat tajuk tanaman, berat akar, dan
panjang akar). Isolat Bacillus NA22 dapat menekan populasi P. brachyurus
cukup tinggi tetapi tidak diikuti dengan tingginya berat tajuk tanaman dan
panjang akar. Hal ini mungkin disebabkan oleh metabolit yang dihasilkan
Bacillus NA22 bersifat toksik terhadap akar, sehingga menghambat
pertumbuhannya (Harni dkk., 2007).
Menurut Shiomi et al.(2006), mikroba endofitik yang diperoleh dari bagian
tanaman kopi robosta dan arabika yang diisolasi dapat mengendalikan
penyakit kuning daun yang disebabkan oleh jamur Hemileia vastatrix. Isolat
isolat yang telah menghasilkan aktivitas terbaik yaitu 62,0 % menghambat pertumbuhan H. vastatrix pada tanaman kopi. Pada uji pengendalian penyakit kuning daun, terjadi penurunan jumlah isolat disertai mengurangnya keparahan penyakit, sebagai interval antara kehadiran agen biocontrol dan patogen yang menurun. Bakteri endofitik dari tanaman ini, diidentifikasi sebagai Bacillus lentimorbus, Bacillus cereus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Smith, dan Klebsiella pneumoniae Schroeter, masing-masing, menunjukkan aktivitas terbaik. Bakteri endofitik lain yang diidentifikasi sebagai Bacillus sp., Klebsiella pneumoniae, Pandorae pnomenusa, Kocuria kristinae, Cedecea davisae, dan Acinetobacter
calcoaceticus Beijerinck (Shiomi et al.,2006).
16
campestris, 49 isolat menghambat P. solanacearum, 28 isolat menghambat
C. glocosporoides, dan 18 isolat menghambat F. oxysporum. Di antara
bakteri yang terseleksi ada yang mempunyai kemampuan ganda yaitu 19 isolat menghambat X. campestris dan P. solanacearum, tujuh isolat menghambat C. gloeosporioides dan F. oxysporum, enam isolat menghambat
X. campestris dan C. gloeosporioides, empat isolat menghambat X. campestris dan F. oxysporum, lima isolat menghambat P. Solanacearum
dan C. gloeosporioides, dua isolat menghambat P. solanacearum dan F. oxysporum. Di antara mikrobia endofit yang mampu menghambat mikrobia patogen, lima isolat dapat menghambat tiga mikrobia patogen (X. campestris, P. solanacearum dan C. gloeosporioide). Hasil analisis KLT terhadap ekstrak isolat mikroba endofitik, ternyata mengandung senyawa aktif (steroid) yang mampu menghambat pertumbuhan mikrobia patogen (Melliawati dkk.,2006).
Dari banyaknya manfaat dan kegunaan mikroba endofitik baik sebagai antijamur, antibakteri dan penghasil metabolit sekunder, mikroba endofitik memiliki kemampuan dalam menghasilkan etanol (Amin, 2012; Elianasari, 2012). Menurut Amin (2012) dan Elianasari (2012), isolasi mikroba endofitik yang berasal dari kulit kayu raru dengan metode steril permukaan, diperoleh 12 mikroba endofitik yang berperan dalam fermentasi gula pereduksi menjadi etanol.
H. Fase Pertumbuhan Bakteri
Suatu mikroba mempunyai siklus pertumbuhan tergantung jenis dan produk yang akan dihasilkan. Fase pertumbuhan bakteri dapat dibagi menjadi 4 fase, yaitu fase lag, fase logaritma (eksponensial), fase stasioner dan fase kematian. Fase lag merupakan fase penyesuaian bakteri dengan lingkungan yang baru. Lama fase lag pada bakteri sangat bervariasi, tergantung pada komposisi media, pH, suhu, aerasi, jumlah sel pada inokulum awal dan sifat fisiologis mikroorganisme pada media sebelumnya. Ketika sel telah menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru maka sel mulai membelah hingga mencapai populasi yang maksimum. Fase ini disebut fase logaritma atau fase eksponensial (Volk dan Wheeler, 1993).
18
menghasilkan populasi yang maksimum, maka akan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang mati dan jumlah sel yang hidup (Volk dan Wheeler, 1993).
Fase stasioner terjadi pada saat laju pertumbuhan bakteri sama dengan laju kematiannya, sehingga jumlah bakteri keseluruhan akan tetap. Keseimbangan jumlah keseluruhan bakteri ini terjadi karena adanya pengurangan derajat pembelahan sel. Hal ini disebabkan oleh kadar nutrisi yang berkurang dan terjadi akumulasi produk toksik sehingga mengganggu pembelahan sel. Fase stasioner ini dilanjutkan dengan fase kematian yang ditandai dengan peningkatan laju kematian yang melampaui laju pertumbuhan, sehingga secara keseluruhan terjadi penurunan populasi bakteri (Volk dan Wheeler, 1993).
I. Analisis Kadar Etanol
Penentuan kadar etanol dilakukan dengan cara yang sederhana, yaitu dengan penggunaan spektrometer UV-Vis pada panjang gelombang ( ) 414 nm. Pada ini merupakan serapan maksimum dari hasil oksidasi etanol dengan menggunakan K2Cr2O7 dalam suasana asam. Dengan demikian, absorbansi etanol pada panjang gelombang diatas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan memanfaatkan hukum Lambert-Beer (Supriyanto, 1999; Day dan Underwood, 2002).
dapat dimanfaatkan dengan bantuan kurva kalibrasi yang dapat dibuat dengan mengukur absorbansi larutan etanol dengan kadar etanol yang berbeda pada
414 dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Dari absorbansi ini didapat kurva kalibrasi dan persamaan garis yang menunjukkan hubungan antara absorbansi hasil oksidasi etanol dengan kadar etanol, sehingga dapat digunakan untuk menentukan kadar etanol dalam contoh (Day dan Underwood, 2002).
J. Analisis Gula Pereduksi Dengan Metode DNS (Dinitrosalisilat)
20
[image:27.612.155.506.117.197.2]Reaksi DNS dengan glukosa dapat dilihat pada Gambar 3.
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Juli sampai September 2012, bertempat di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung. Hidrolisis onggok di Laboratorium Biomassa Terpadu Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium, inkubator P-SELECTA, auto clave SPEED CLAVE S-90N, alat sentrifugasi, ruang laminar air flow CRUMA 9005-FL, jarum ose, pinset, mikropipet, neraca analitik, alat pengguncang STUART SSL2, Vortex, Analisis gula reduksi menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
22
C. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Media Perkembangbiakan Mikroba Endofitik
Mikroba endofitik ditumbuhkan pada tiga media yaitu pada media Nutrien Agar (NA), inokulum dan fermentasi.
a. Pembuatan media nutrien agar (NA)
Ekstrak ragi 3 gram, pepton 5 gram dan agar 15 gram dalam 1000 mL akuades kemudian disterilikan dengan auto clave, campuran yang dihasilkan disebut media NA.
b. Pembuatan media inokulum
Nutient Broth (NB) 0,8 gram dilarutkan dalam 100 mL akuades kemudian disteril selama 15 menit. Pada media ini dimasukkan sebanyak 1 ose mikroba kemudian diinkubasi pada suhu 35°C selama 3 hari.
c. Pembuatan media fermentasi
2. Penyiapan Contoh Kulit Kayu Raru
Kulit kayu raru yang digunakan dipotong kecil dengan menggunakan pisau, kemudian ditimbang hingga berat 1 gram. Contoh ini disterilkan dengan dicelupkan sebentar ke dalam alkohol 70%. Setelah itu, contoh direndam dalam air salin (NaCl 0,85%) selama 15 menit dalam mortar dengan ditutup oleh aluminium foil pada ruang Laminar air flow. Setelah 15 menit, contoh digerus dengan mortar hingga air salin menjadi keruh. Cairan hasil gerusan diencerkan dari 10-1-10-5 dan dihomogenkan dengan menggunakan alat vortex.
3. Isolasi Mikroba Endofitik pada Media NA
Dari masing-masing pengenceran contoh kulit kayu raru diambil 200 µL kemudian ditumbuhkan pada medium NA. Contoh diratakan dengan menggunakan spreader, yaitu suatu alat yang berbentuk L yang permukaannya halus untuk meratakan contoh yang telah diencerkan. Pertumbuhan mikroba diamati setiap hari selama 5 hari.
4. Penapisan Mikroba Endofitik Hasil Isolasi
24
dengan menggunakan metode tusuk, yaitu mengambil bakteri dan ragi yang diinginkan dengan menggunakan jarum ose tusuk. Isolat mikroba diremajakan pada media NA yang baru.
5. Pemurnian Mikroba Endofitik
Isolat mikroba yang didapat dari proses sebelumnya ditumbuhkan pada media NA yang baru, kemudian dimurnikan dengan menggunakan metode gores kuadran. Cawan petri yang akan digunakan dibagi menjadi 4 kuadran yang diberi penomoran 1-4. Mikroba diambil dengan menggunakan jarum ose gores, kemudian digoreskan pada kuadran pertama. Jarum ose disterilkan, ujung dari penggoresan pertama kemudian diteruskan dengan menariknya pada kuadran kedua dan digores kembali. Begitu seterusnya hingga kuadran ke-4. Mikroba yang tumbuh terpisah di kuadran 4 diremajakan pada media NA baru.
6. Inokulasi Kultur
Sebelum kultur dilakukan, disiapkan starter inokulum. Inokulum disiapkan dengan menginokulasi 1 ose biakan isolat ke medium NB steril dalam labu Erlenmeyer. Biakan diinkubasi pada suhu 35ºC selama 3 malam.
7. Penentuan Pola Pertumbuhan Sel Mikroba Endofitik
spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm (overnight : 12-72 jam).
8. Pengeringan Onggok
Sebelum digunakan onggok terlebih dahulu dikeringkan untuk menurun kadar airnya sehingga onggok tidak mengalami pembusukan. Pengeringan onggok dilakukan dengan oven pada suhu 50°C dengan lama pengeringan 24 jam (BPPT, 2005). Bila belum kering, onggok akan dikeringkan dengan waktu yang lebih lama, kemudian onggok dihaluskan hingga ukuran 125 mesh.
9. Ultrasonifikasi
Pada proses ini, disiapkan 40 gram onggok kering kedalam gelas kimia dan ditambahkan 800 mL air. Contoh selanjutnya diultrasonifikasi selama 90 menit (Trisnawati dan Irwan, 2008). Ultrasonifikasi dilakukan menggunakan alat ultrason Bason, yang bekerja pada frekuensi tetap yaitu 20 kHz. Setelah proses ini selesai, contoh digunakan untuk percobaan hidrolisis.
10. Hidrolisis Onggok
26
11. Fermentasi Hidrolisat Onggok dengan Menggunakan Mikroba Endofitik
Media fermantasi yang mengandung hidrolisat onggok sebagai substrat di tambahkan 10% inokulum dari mikroba endofitik hasil penapisan dari kulit kayu raru dan diinkubasi selama 72 jam. Setelah fermentasi berlangsung, diamati kadar alkohol yang pada 72 jam untuk menentukan kadar etanol yang dihasilkan dan gula pereduksi yang digunakan dalam fermentasi.
12. Analisis kadar alkohol
Membuat kurva standar hasil oksidasi etanol dengan menggunakan K2Cr2O7, berdasarkan pada larutan standar etanol dengan konsentrasi 0, 5. 10, 15, 20, 25, dan 30%. Sebanyak 0,5 mL masing-masing larutan standar ditambahkan dengan 0,5 mL larutan K2Cr2O7 dalam suasana asam yang dibuat dengan mencampurkan larutan K2Cr2O7 0,1 N dengan perbandingan 1:1. Masing-masing campuran dipanaskan selama 10 menit dan diukur absorbansi pada 414 nm. Selanjutnya menggunakan kurva standar ini untuk mengukur kadar etanol dari larutan contoh.
menjadi hijau dan berbau aldehida. Hasil oksidasi ini, kemudian diukur absorbansi pada 414 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
13. Analisis Gula Pereduksi dengan Metode DNS
Dalam menghitung gula pereduksi dalam contoh, perlu dibuat kurva standar dari gula reduksi yang akan diukur. Untuk hal ini,dibuat larutan
standar glukosa dengan konsentrasi 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1; 1,2 dan 1,4 mg/mL. Pembuatan larutan standar glukosa 2 mg/mL, dilarutkan
0,1 g glukosa dalam 50 mL akuades, dan dari larutan tersebut dibuat larutan standar konsentrasi 0,2; 0,4; 0,8; 1; 1,2 dan 1,4 mg/mL.
38
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut :
1. Mikroba endofitik yang terdapat pada kulit kayu raru memiliki morfologi bentuk dan ukuran koloni yang beraneka ragam.
2. Dari serangkaian kegiatan isolasi dan penapisan pada medium NA didapat enam mikroba endofitik kulit kayu raru, yaitu MA1-01, MA1-02, MA1-03, MA2-01, MA2-02 dan MA2-03.
3. Waktu Pertumbuhan optimum isolat mikroba MA1-01, ,MA1-03, MA2-01 dan MA2-03 pada medium NB adalah 36 jam, sedangkan mikroba MA1-02 dan MA2-02 adalah 48 jam
4. Hasil oksidasi dari destilat hasil fermentasi hidrolisat onggok dengan mikroba MA1-01, MA1-02, MA1-03, MA2-01, MA2-02 dan MA2-03 dengan K2Cr2O7, hanya destilat MA2-02 yang positif mengandung etanol dengan konsentrasi 15,5 %
B. Saran
Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka pada penelitian selanjutnya disarankan:
1. Perlu dilakukan analisis kadar alkohol dari hasil fermentasi hidrolisat onggok oleh mikroba MA2-02 dengan menggunakan spektrofotometri GCMS.
2. Perlu dilakukan klasifikasi dari mikroba agar didapat mikroba yang lebih spesifik lagi.
DAFTAR PUSTAKA
Agra, I. B., Warnijati, S., dan Pujianto, B., 1973. “ Hidrolisa Pati Ketela Rambat
Pada Suhu Lebih Dari 100 C”, Forum Teknik, 3, 115-129.
Alberty, F. D., 1992. Kimia Fisik. Jakarta, Erlangga
Alexander, R.J. 1992. Maltodextrins: Production, properties, and applications. Dalam. Zobel
Amin, M., 2012. Pembelajaran Awal Isolasi Mikroba Endofitik Kayu Raru pada Media Kaya Nutrisi Untuk Fermentasi Alkohol. Laporan Kerja Praktik, Universitas Lampung. Lampung.
Apriyantono, A., Fardiaz, D., Puspitasari, N. L., Sedarnawati, Budiyanto, S., 1988. Analisis Pangan. Bogor: PAU Pangan dan Gizi. IPB
Astuti, T. D., 2008. Lama Inkubasi dan dosis Ragi pada Fermentasi Tepung
Gaplek (Manihot esculanta Crantz) Terhadap Kadar Glukosa dan
Bio-Etanol dengan Penambahan Aspergilus Niger. Universitas
Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.
Atkins, P.W. 1999. Kimia Fisika. Jilid 1. Edisi Keempat. Jakarta, Erlangga
Balai Pusat Statistik Indonesia. 2010. http://www.bps.go.id/. Lampung dalam Angka: Tanaman Pangan di Provinsi Lampung Tahun 2005 – 2010. Diakses pada tanggal 20 juni 2012 pukul 19.15 WIB
BeMiller,J.N., dan Whistler,R. 2009. Starch: Chemistry and Technology. Academic Press,Inc
Boddey RM, Urquiaga S, Reis V, Dobereiner J. 1991. Biological nitrogen fixation associated with sugarcane. In: Polsinelli M, Materassi R, Vincenzini M (eds). Nitrogen Fixation. London: Kluwer Acad. P 105-111.
Day, A. A dan Underwood, A. L., 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta, Erlangga
Dong Z et al. 1994. A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems. A new role for thr apoplast. Plant Physiol 105:1139-1147.
Elianasari, V. D., 2012. Pembelajaran Awal Isolasi Mikroba Endofitik Kayu Raru pada Media Miskin Nutrisi Untuk Fermentasi Alkohol. Laporan Kerja Praktik, Universitas Lampung. Lampung.
Gunasekaran, P. T. Karunakaran dan M. Kasthuribai. (1986). “Fermentation
pattern of Zymomonas mobilis strains on different substrates—a
comparative study”, J. Biosci., Vol. 10. Number 2. pp. 181-186.
Gunasekaran, P. dan Raj, K.C., (1999), “Fermentation Technology-Zymomonas
mobilis”, Departement of Microbial Technology, School of Biological
Sciences, Mandurai Kamaraj University: India.
Hallmann J., Hallmann A.Q., Mahaffee W.F., Kloepper. 1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43:895-914.
Harni, R., Abdul M., Supramana, dan Ika M., 2007. Potensi Bakteri Endofit
Pengendali Nematoda Peluka Akar (Pratylenchus brachyurus) pada Nilam. HAYATI Journal of Biosciences. vol 14. p 7-12.
Hidayat, N., M. C. Padaga dan S. Suhartini, 2006. Mikrobiologi Industri. Andi, Yogyakarta
Judoamidjojo, M., A. A. Darwis, dan E. G. Said, 1992. Teknologi Fermentasi. Rajawali-Press, Jakarta.
Kompas, 2005. Emisi Karbon Gasohol lebih Rendah Dibanding Pertamax.
http:/www.kompas-online.co.id. Diakses pada tanggal 15 juni 2012
pukul 19.15 WIB
Kumala, S., Agustina E., dan Wahyudi P., 2006. Uji Aktivltas Antimikroba
Metabolit Sekunder Kapang Endofit Tanaman Trengguli (Cassia Futula
L). FF Universitas Pancasila, Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta
Selatan
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Maggy Thenawijaya, penerjemah.
Jakarta: Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Principles of
Biochemistry.
42
Lumyong S, Norkaew N, Ponputhachart D, Lumyong P, dan Tomita F, 2001. Isolation, Optimitation and Characterization of Xylanase from Endophytic fungi. Biotechnology for Sustainable Utilization of
Biological Resources. The Tropic, 15.
McFarland, J. 1907. Nephelometer; JAMA 14:1176 1178
Melliawati R., Dian Noverita W., Apridah C D., dan Harmastini S., 2006.
Pengkajian Bakteri Endofit Penghasil Senyawa Bioaktif untuk Proteksi
Tanaman. B I O D I V E R S I T A S. Vol. 7, Halaman: 221-224
Meyer, L. H., 1970. Food Chemistry. Reinhold Publishing Coorporation, New York.
Muthukumarasamy R, Revathi G, Seshadri S, Lakshminarasimhan C. 2002. Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropic. Curr Sci 83:137-145.
Onsoy T., P. Thanonkeo, S. Thanonkeo dan M. Yamada. 2007. “Ethanol
Production From Jerusalem Artichoke By Zymomonas Mobilis In Batch
Fermentation”. KMITL Sci. Tech. J. Vol. 7 No. S1
Pandey, A., Soccol, C. R., Ningam, P. dan Soccol, V. T. 2000. Biotechnological
potential of agro – industrial residues : II cassava bagasse. J.
Bioresource Technology. 74, pp 81 – 87.
Pasaribu,G. T.,2009. “Zat Ekstraktif Kayu Raru Dan Pengaruhnya Terhadap Penurun Kadar Gula Darah Secara In Vitro”. Tesis, IPB. Bogor.
Puspita, E. M., Silviana H. dan Ismail T., 2010. “Fermentasi Etanol Dari Molasses
Dengan Zymomonas Mobilis A3 Yang Diamobilisasi Pada
-Karaginan”. Seminar Rekayasa Kimia Dan Proses 2010.
Rahman, A. M., 2007. Mempelajari Karakteristik Kimia Dan Fisik Tepung
Tapioka Dan Mocal (Modified Cassava Flour) Sebagai Penyalut Kacang Pada Produk Kacang Salut. Skripsi. Bogor. Institut Pertanian Bogor.
Soebagio, B., Sriwododo, dan Adhika, A. S. 2009. Pengujian Sifat Fisikokimia Pati Biji Durian (Durio Zibethinus Murr) Alami dan Modifikasi cecara Hidrolisis Asam (skripsi). Bandung: Universitas Padjadjaran
Shiomi H. F.; Harllen Sandro A. S.; Itamar S. M.; Flávia V. N.; Wagner B., 2006. Bioprospecting Endophytic Bacteria For Biological Control Of Coffee
Simarmata, R., Lekatompessy, S., dan Sukiman, H., 2007, “Isolasi Mikroba
Endofitik Dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura procumbens)
dan Analisis Potensinya Sebagai Antimikroba”. Berk. Penel. Hayati: 13
(85–90)
Sriyanti, 2003. Perbandingan Kadar Alkohol dan Asam Asetat pada Cuka Air Cucian Beras. Skripsi. Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.
Stout, L. E., dan Ryberg, 1989. Polysacharida Chemistry. Academic-Press. Inc Publisher, New York.
Strobel, G.A. 2003. “Endophytes as sources of bioactive products”. pp.11
Sunarni, N., 2010. Isolasi Dan Identifikasi Jamur Endofit Dari Akar Tanaman Kentang Sebagai Anti Jamur (Fusarium Sp, Phytoptora Infestans) Dan Anti Bakteri (Ralstonia Solanacaerum). Skripsi. Fakultas Sains Dan TeknologiUniversitas Islam Negeri Malang (Uin) Maulana Malik Ibrahim Malang.
Supriyanto, R., 1990. Kimia Analitik. Lampung, Universitas Lampung
Susijahadi, 1997. Hasil Olahan Tepung Tapioka. http://www.iptekindo.com.
Tanate T. S. dan S. R. Putra, 2008, “Pembuatan Etanol Menggunakan Zymomonas
Mobilis Pada Kondisi Steril dan Nonsteril dengan Memanfaatkan
Limbah Padat Pabrik Rokok Kretek Sebagai Substrat”, Tesis. ITS. Surabaya.
Tan, R.X., dan W.X. Zou. 2001. “Endophytes : a rich source of functional
metabolites”. Nat. Prod. Rep. 18: 448-459.
Tian H., Riggs R.D., and Crippen D.L., 2000. Control of soybean cyst nematode by chitinolytic bacteria with chitin subtrate. J Nematology 32:370-376.
Ting A.S.Y., S.W. Mah dan C.S. Tee. 2010. “Identification of Volatile Metabolites from Fungal Endophytes with Biocontrol Potential
towards Fusarium oxysporum F. sp. cubense Race 4”. A. J. of
Agri.and Bio. Sci. 5 (2): 177-182
Taringan, R. Dan Kuswandi. 2010. “Efektivitas Asal Isolat Bakteri Endofit Dan Kerapatan Pengenceran Dalam Mengendalikan Penyakit Busuk Batang
(Sclerotium Rolfsii Sacc) Pada Tanaman Kedelai”. Balai Penelitian
44
Trisnawati, E. And Suka, S. G., 2007. Pembuatan Etanol Dari Onggok
Terhidrolisis. Laporan Kerja Praktik, Universitas Lampung. Lampung
Trisnawati, E. And Suka, G. I., 2008. Pengaruh Ultrasonifikasi Terhadap Hidrolisis Pati Dan Onggok Serta Kaitannya Dengan Fermentasi
Menggunakan Kulit Kayu Tanaman Raru (Garcinia Mangostana)
Skripsi. Universitas Lampung. Lampung
Vidya, E. Y., 2002. Pemanfaatan Ampas Singkong Menjadi Mkanan Bernilai
Gizi. http://www.tanimakmursejahtera.blogspot.com.
Volk, W.A dan M.F. Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima.
Alih bahasa oleh Soenarto Adisoemarto, Ph.D. Erlangga. Jakarta. 396 halaman.
Winarno, F.G. 1994. Kimia Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utana
:Jakarta
