PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI LIPASE DARI YEAST M2 SEBAGAI BIODETERJEN
GEMA WAHYUNI G851130391
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul kajian potensi Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Yeast M2 Sebagai Biodeterjen, adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
RINGKASAN
GEMA WAHYUNI. Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Dari Yeast M2 Sebagai Biodeterjen. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan BUDIASIH WAHYUNTARI.
Deterjen merupakan produk industri yang mengandung berbagai bahan kimia surfaktan yang dimanfaatkan sebagai pembersih. Penggunaan deterjen dari senyawa kimia surfaktan yang berlebihan dapat menyebabkan menurunnya kualitas lingkungan. Deterjen berbasis enzim atau biodeterjen dapat membatasi penggunaan senyawa kimia sehingga tidak meninggalkan residu berbahaya, tidak beracun, tidak menimbulkan resiko berbahaya bagi kehidupan perairan bersifat
biodegradable, dan tidak beracun. Penggunaan senyawa kimia pada deterjen juga
dipengaruhi oleh harga enzim yang mahal dan masih impor. Penggunaan mikroba lokal dapat dijadikan sebagai solusi untuk produksi enzim komersial untuk biodeterjen. Yeast M2 merupakan salah satu mikroba yang telah diketahui dapat penghasil lipase yang diisolasi oleh Badan Penerapan dan Pengkajian Teknologi (BPPT) Serpong dari mentega. Lipase yang di aplikasikan pada industri deterjen harus memiliki aktivitas dan stabilitas terhadap suhu, pH basa dan juga harus kompatibel dengan komponen seperti ion logam dan surfaktan. Untuk dapat menghasilkan lipase yang sesuai dengan kebutuhan industri deterjen, maka perlu dilakukan penelitian pemurnian dan karakterisasi terhadap lipase yeast M2 sebagai biodeterjen.
Pemurnian lipase yeast M2 dilakukan dengan menggunakan metode
reverse micellar extraction. Reverse micellar extraction adalah proses pemurnian
dalam bentuk cair-cair yang yang melibatkan pembentukan misel didalam pelarut organik yang distabilkan oleh monolayer surfaktan. Lipase dicampurkan dengan surfaktan CTAB, Triton X-100 dan Tween80 didalam isooktana yang mengandung 15% metanol, 5% hexanol sebagai co surfaktan dengan konsentrasi 25 mM dengan perbandingan 1:1. Dari ketiga surfaktan yang digunakan surfaktan CTAB menunjukan recovery lipase maksimum denga kemurnian 3.10 kali pad pH 7 dengan konsentraci CTAB 75 mM. Pada fase bacward reactions lipase di ekstraksi kembali ke fase berair pada buffer fosfat 0.05 M pH 6 yang mengandung NaCl 0.5 M dengan aktivitas recovery 77.62 %, kemurnian 10.64 kali dengan waktu proses 45 menit. Lipase yang menunjukkan aktivitas optimal pada pH 8 dan 30oC. Aktivitas lipase diaktifkan oleh ion logam, seperti Ca2+, Mn2+, dan Fe2+. Hasil karakterisasi lipase yeast M2 menunjukkan bahwa lipase dari yeast M2 dapat digunakan sebagai tambahan deterjen.
SUMMARY
GEMA WAHYUNI. Purifications and Characterizations Lipase From Yeast M2 As a Biodetergent. Supervised by SYAMSUL FALAH and BUDIASIH WAHYUNTARI.
Detergent is an industrial product contains various chemical surfactants which was used as cleanser. Utilization of detergent from chemical surfactant excessively causes environmental degradation. The enzyme based detergents have better cleaning properties as compared to synthetic detergents. Enzymes can reduce the environmental load of detergent products as the chemicals used in conventional detergents are reduced, they are biodegradable, non toxic and leave no harmful residues. The use of chemical surfactant in detergent is also influenced by the expensive price of enzyme and it is still imported. Utilization of endogeneous microbes can be a solution for production of commercial enzyme as biodetergent. Yeast M2 is one of lipase-produced microbes which had been successfuly isolated by Badan Penerapan dan Pengkajian Teknologi (BPPT) Serpong from the butter. Lipase that will be applied in detergent industry should have activity and stability against temperature, pH alkaline and also should be compatible with components such as metal ions and surfactant. To be able to produce lipase in accordance with the need of detergent industry, therefore it is necessary to study purification and characterization of lipase yeast M2 as biodetergent
The lipase was purified using reverse micellar extractions. Reverse micellar extractions is an attractive liquid-liquid extraction method, which involves a formation of water droplet within an organic solvent. Lipase was mixed to each surfactants of CTAB, Triton X-100, and Tween-80 that were dissolved in isooctane containing 15% methanol and 5% hexanol as co solvent with a concentration 25 mM and ratio 1:1. Out of three different surfactant, surfactant CTAB showed maximum recovery of lipase along with 3.79 fold purifications at pH 7 with consentrations surfactant 75 mM. In case of backward extraction, lipase was extracted from the organic phase to a fresh aqueous phase in 0.05 M potassium phosphate buffer pH 6 containing 0.5 M NaCl. Under optimized
conditions, 10.64 fold purification, 77.62% recovery with a process time of 45 min was obtained. The lipase showed optimal activity at pH 8 and 30 oC. The lipase activity was activated by metal ions, such as Ca2+, Mn2+, and Fe2+. Lipase Characterization showed that yeast M2 can be used as additif detergent.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengummumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI LIPASE DARI YEAST M2 SEBAGAI BIODETERJEN
GEMA WAHYUNI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
Judul Tesis : Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Dari YeastM2 Sebagai Biodeterjen
Nama : Gema Wahyuni NRP : G851130391 Program studi : Biokimia
Disetujui Oleh
Komisi Pembimbing
Dr Syamsul Falah, SHut MSi Dr Ir. Budiasih Wahyuntari, MS
Ketua Anggota
Diketahui Oleh
Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana
Tanggal Ujian : 4 Januari 2016 Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis sampaikan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan november 2014 sampai juli 2015 ini ialah pemurnian dan karakterisasi lipase dari yeast M2 sebagai biodeterjen. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Syamsul Falah MSc sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr Budiasih Wahyuntari MS sebagai anggota komisi pembimbing, yang telah banyak memberikan nasehat, saran, motivasi, waktu konsultasi serta solusi permasalahan yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Kepada DIKTI melalui Beasiswa Fresh Graduated 2013/2014 terima kasih atas kepercayaanya untuk memberikan beasiswa selama menempuh pendidikan Pascasarjana di IPB, dan terimakasih untuk Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro-BioMedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik.
Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada seluruh Staf Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro-BioMedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Nita, Lisa, Fitri, kakak Indah, Viqoh, Novi, Putri, dan Tiara atas dukungannya, motivasi, dan bantuan selama penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga juga penulis ucapkan kepada ibu, ayah (alm), seluruh keluarga, serta sahabat-sahabatku tersayang, atas doa, dukungan, kasih sayang, dan semangat yang diberikan. Terima kasih untuk teman-teman seperjuanganku di Pascasarjana Biokimia IPB angkatan 2013 serta seluruh pihak yang telah memberikan doa dan dukungannya, penulis ucapkan terima kasih.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
2 METODE 2
Waktu dan Tempat 2
Alat dan Bahan 2
Produksi Lipase 3
Uji Kemampuan Lipase Untuk Deterjen 3
Pengukuran Aktivitas Lipase 4
Pengukuran Kadar Protein Lipase 4
Pemurnian Metode Reverse Micellar Extraction 5 Karakterisasi Lipase Sebagai Biodeterjen 5
Analisis SDS-PAGE 6
3 HASIL 6 4 PEMBAHASAN 11 5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan 18
Saran 19
DAFTAR PUSTAKA 19
LAMPIRAN 22
DAFTAR TABEL
1 Pengaruh pH terhadap reaksi forward extraction 7 2 Pengaruh konsentrasi surfaktan terhadap forward extraction 8 3 Pengaruh pH terhadap reaksi backward extraction 8 4 Pengaruh variasi konsentrasi NaCl terhadap reaksi backward extraction 9
DAFTAR GAMBAR
1 Pengaruh jenis surfaktan terhadap reverse micellar extraction 7 2 Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas lipase 9 3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas lipase 10 4 Pengaruh ion logam terhadap akivitas lipase 10
5 Hasil SDS-PAGE 11
6 Reaksi hidrolisis lipase 12
7 Mekanisme metode pemurnian dengan reverse micellar extraction 13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 23
2 Kurva standar pNP 24
3 Kurva standar BSA 25
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Deterjen merupakan produk industri yang mengandung berbagai bahan kimia surfaktan yang dimanfaatkan sebagai pembersih (Amara et al. 2009). Penggunaan deterjen dari senyawa kimia surfaktan yang berlebihan dapat menyebabkan menurunnya kualitas lingkungan (Hasan 2010). Deterjen berbasis enzim atau biodeterjen dapat membatasi penggunaan senyawa kimia sehingga tidak meninggalkan residu berbahaya, tidak beracun, tidak menimbulkan resiko berbahaya bagi kehidupan perairan dan bersifat biodegradable (Hasan et al. 2006; Hamidet et al. 2009). Penggunaan bahan kimia surfaktan pada deterjen juga dipengaruhi harga enzim yang mahal dan masih impor. Penggunaan mikroba lokal dapat dijadikan sebagai solusi untuk produksi enzim komersial sebagai formulasi biodeterjen.
Lipase (EC 3.1.1.3) merupakan salah satu enzim yang memiliki aplikasi dalam berbagai industri dan produk rumah tangga termasuk deterjen, makanan, tekstil, farmasi, kosmetik, biodisel dan industri agrokimia (Li et al. 2014). Lipase memiliki kemampuan dalam reaksi hidrolitik yang mengkatalisis pemecahan lemak dan minyak menjadi asam lemak bebas,monoasilgliserol, diasilgliserol dan gliserol
(Dheeman et al. 2011). Kemampuan lipase dalam menghidrolisis lemak dan minyak, memberikan peluang lipase dapat dijadikan sebagai tambahan pada deterjen. Penambahan lipase pada deterjen selain bersifat biodegradable juga dapat menghapus residu lemak dengan mudah pada suhu rendah pada saat mencuci dan dapat membersihkan saluran pembuangan air yang berlemak (Hasan. 2010). Lipase digunakan sebagai biodeterjen dapat aktif dan stabil pada suhu rendah dan dalam lingkungan basa (Liu et al. 2012). Lipase dari Pseudomonas
stutzeri PS59 menunjukkan 75% kemampuanya dalam menghapus minyak zaitun
dengan menunjukkan aktivitas maksimum pada suhu 20oC dengan pH 4-11 (Li et al. 2014). Beberapa mikroba penghasil lipase lainya yang memiliki potensi dijadikan tambahan deterjen antaranya Talaromyces thermophilus, Staphylococcus aureus, Acinetobacter radioresistens, Humicola lanuginosa,
Trichoderma lanuginosus, dan Aspergillus oryzae (Belhaj et al. 2010; Horchani et
al. 2009; Hasan 2010; Blanco et al. 2011). Lipase yang di aplikasikan pada industri deterjen harus memiliki aktivitas dan stabilitas terhadap suhu, pH basa dan juga harus kompatibel dengan komponen seperti ion logam dan surfaktan. Enzim stabil salah satunya dapat diproduksi dari yeast. Penggunaan enzim yang berasal dari yeast secara umum bersifat stabil dan dapat diproduksi dalam jumlah yang tidak terbatas.
Yeast M2 merupakan salah satu mikroba penghasil lipase yang berhasil
2
Reverse micelar extraction adalah metode pemurnian dalam bentuk cair-cair yang
melibatkan pembentukan misel didalam fase organik yang distabilkan monolayer surfaktan. Untuk dapat menghasilkan lipase yang sesuai dengan kebutuhan industri deterjen, maka perlu dilakukan penelitian pemurnian dan karakterisasi terhadap lipase yeast M2 sebagai biodeterjen.
Perumusan Masalah
Untuk mendapatkan lipase sebagai tambahan biodeterjen, dibutuhkan lipase yang bersifat stabil. Salah satu mikroorganisme yang diketahui mampu menghasilkan enzim stabil adalah yeast M2. Belum diketahuinya karakterisasi lipase dari yeast M2 sebagai biodeterjen.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk pemurnian lipase yeast M2 dengan metode
reverse micellar extraction dan karakterisasi lipase yeastM2 sebagai biodeterjen.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai pemurnian dengan metode reverse micellar dan karakterisasi lipase dari isolat yeast M2 sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan dan teknologi bidang industri deterjen.
2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2014 sampai dengan Juli 2015 di Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro-BioMedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang Selatan.
Alat dan Bahan
3
yang digunakan adalah biakan yeast M2 koleksi BPPT, buffer fosfat 0.05 M pH 7, buffer Tris-HCl 0.005 M pH 8-9, buffer glysin NaOH 0.05 M pH 10-12, pNPP (p-Nitrophenol palmitate), BSA (bovine serum albumin), PAGE blue 0.1%, reagen
Branford, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), Triton X-100, Tween80,
isooctane, hexanol, 2-propanol, butanol, pepton, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, 1000 mL media produksi ( pH 7) steril diikubasi pada inkubator goyang 150 rpm suhu 37oC selama 30 jam. Waktu inkubasi 30 jam merupakan waktu yang dibutuhkan yeast M2 untuk menghasilkan aktivitas lipase tertinggi. Setelah inkubasi 30 jam enzim dipanen dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 xg selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang dihasilkan merupakan crude enzimlipase.
Uji Kemampuan Lipase Untuk Deterjen (Li et al. 2014)
Lipase dari yeast M2 yang akan digunakan sebagai bahan aditif deterjen terlebih dahulu dilakukan proses uji kemampuan lipase dalam mencuci. Uji ini bertujuan untuk melihat kemampuan lipase dalam menghidrolisis minyak. Kain katun warna putih berukuran 4x4 cm ditimbang sebagai berat awal (Wo). Kain
katun selanjutnya di rendam dengan kloroform mendidih (10 ml untuk 1 kain) selama lima menit. Kain yang selesai direndam dikeringkan semalam pada suhu ruang. Kain yang telah kering, dan selanjutnya ditimbang kembali (Wa). Kain katun yang telah kering di tetesi olive oil pada kedua sisi yang dilarutkan dalam aseton (100 mg/ml) dan kain yang ditetesi olive oil ditimbang (Wb). Kain dikeringkan selama 15 menit disuhu ruangan dan selanjutnya direndam dengan 10 ml buffer phospat pH 8 0.05M yang ditambah dengan 10 ml enzim (1:1). Kain rendeman diinkubsi pada suhu 30oC diinkubator goyang dengan kecepatan 180 rpm selama 1 jam. Setelah diinkubasi kain dikeringkan semalam pada suhu ruang. Kain yang kering ditimbang sebagai berat akhir (Wc).
4
Dimana Wa dan Wb mewakili bobot kain katun sebelum dan setelah penambahan
minyak olive oil, dan Wc adalah berat dari kain katun setelah dicuci. %W didefinisikan dengan presentase olive oil yang dapat didegradasi oleh enzim lipase dengan standar pengujian.
Pengukuran Aktivitas Lipase (Silva et al. 2005)
Pembuatan Kurva Standar. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan mencampurkan 1 ml larutan enzim dan buffer pH 7 dengan 100 l pNP. Sampel di vortex sampai homogen dan di ukur aktivitas pada 410 nm.
Pengukuran Sampel. Aktivitas lipase diukur dengan metode Silva (2005), tahapan pertama dalam pengujian aktivitas enzim lipase dilakukan dengan pembuatan substrat yaitu larutan pertama dibuat dengan mencampurkan 3 mg pNPP (p-nitrophenyl palmitate) dilarutkan dalam 1 mL 2-propanol. Larutan kedua dibuat dengan mencampurkan 10 mg gum Arabic dan 40 mg Triton X-100 dilarutkan dalam 9 ml buffer Tris-HCl 50 mM pH 8.0. Larutan pertama dan larutan kedua dicampurkan sampai homogen (substrat). Pengujian aktivitas dilakukan dengan mengambil 0.1 ml lipase dan dicampurkan dengan 0.9 ml larutan substrat dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Pengukuran absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer pada 410 nm. Aktivitas lipase dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Dimana α adalah konsentrasi pNP, β adalah Mr pNPP, t adalah waktu reaksi dan v adalah volume enzim. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan jumlah mmol
p-Nitrophenol yang di bebaskan per menit dalam kondisi pengujian standar.
⁄ ⁄
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pembuatan Kurva Standar BSA. Pembuatan kurva standar bovine serum
albumin (BSA) dilakukan dengan cara membuat variasi konsentrasi BSA didalam
larutan Tris-HCl pH 8. Setiap variasi konsentrasi BSA diambil sebanyak 30 µl kemudian dicampur dengan 1.5 ml larutan Bradford dalam tabung reaksi, larutan divortex dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Absorbansi larutan kemudian diukur dengan spektrofotometer pada =5λ5 nm.
5
Pembuatan Blanko. Sebanyak 1 ml Bradford ditambahkan RO 20 l. Larutan divortex dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Absorbansi larutan kemudian diukur dengan spektrofotometer pada =5λ5 nm.
Pemurnian Lipase Dengan Metode Reverse Micellar Extractions (Gaikaiwari et al. 2012; Nandini dan Rastogi. 2009)
Proses pemurnian lipase dengan metode reverse micellar extractions dilakukan dengan dua tahapan yaitu forward extraction dan backward extraction.
Reverse micellar extraction adalah suatu metode pemisahan protein dalam bentuk
cair-cair dengan menggunakan surfaktan. Forward extractions: lipase dicampur dengan masing masing surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), Triton X-100, dan Tween-80 yang dilarutkan didalam isooktana yang mengandung 15% butanol, dan 5% hexanol dengan konsentrasi 25 mM dengan perbandingan 1:1. Larutan divortex hingga homogen dan selanjutnya diinkubasi di inkubator goyang pada suhu 25oC selama 10 menit. Campuran reaksi disentrifugasi 3000 xg selama 10 menit pada suhu 25oC. Dua fase (cair dan organik) yang terbentuk setelah disentrifugasi dipisahkan. Fase cair yang terbentuk di uji aktivitas lipase dan kadar protein, sedangkan fase organik yang terbentuk digunakan untuk tahapan kedua yaitu backward reaction. Aktivitas tertinggi dilakukan optimasi terhadap konsentrasi surfaktan, pH forward
extraction. Backward reactions: larutan fase organik yang terbentuk pada forward
extractions dicampurkan dengan variasi buffer pH 6-9 yang mengandung NaCl
0.05 M dan 15% isopropanol (1:1). Larutan di inkubasi pada suhu 25oC selama 10 menit dan disentrifugasi di 3000 xg selama 10 menit pada suhu 25oC. pH optimum dari hasil optimasi yang diperoleh selanjutnya dilakukan uji variasi konsentrasi NaCl (0.01-1.0 M). Larutan disentrifugasi di 3000 rpm selama 10 menit pada suhu 25oC dan selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas dan kadar protein. Perhitungan (Nandini dan Rastogi 2009):
Karakterisasi Lipase Untuk Aplikasi Deterjen (Li et al. 2014)
6
sampling untuk mengetahui aktivitas lipase sisa. Aktivitas lipase kemudian diukur dalam kondisi pengujian standar.
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Lipase. Pengukuran suhu optimum lipase dilakukan dengan menginkubasi lipase dengan variasi suhu dari 26, 28, 30, 34, 37, dan 40oC. Pengujian dilakukan berdasarkan pH optimum selama 30 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas enzim lipase menunjukkan suhu optimum enzim lipase. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasi enzim tanpa substrat pada berbagai suhu selama 90 menit. Pada menit ke 0, 30, 60 dan 90 dilakukan sampling untuk mengetahui aktivitas dari lipase sisa. Aktivitas enzim sisa kemudian diukur dalam kondisi pengujian standar.
Pengaruh Ion Logam Terhadap Aktivitas Lipase. Logam ion yang digunakan untuk pengujian kation adalah Ca2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+ dengan konsentrasi 0.01 M. Kation logam dengan konsentrasi 0.01 M ditambahkan dalam enzim dan selanjutnya diinkubasi selama 1 jam. Aktivitas enzim kemudian diukur pada kondisi optimal reaksi enzimatik lipase. Inhibitor dan aktivator aktivitas lipase oleh kation logam dinyatakan dalam persentase aktivitas lipase dengan kontrol (tanpa kation logam).
Analisis Protein Dengan SDS-PAGE
Analisis protein dilakukan dengan menggunakan Sodium Dedosyl Sulfate
Polyacrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE). Pemisahan protein dilakukan
pada gel pemisah 12%. Komposisi gel pemisah SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 4. Sampel yang telah ditambahkan loading dye dengan total volume 15 L dipanaskan pada suhu ± 95°C selama 1 menit untuk denaturasi protein. Langkah selanjutnya dilakukan running sampel selama 2 jam pada tegangan 110 V menggunakan peralatan SDS-PAGE. Setelah proses running selesai gel dicuci sebanyak 3x. Gel diwarnai dengan Page-blue didalam microwave selama 30 detik. Setelah itu gel dibilas dengan air RO (reverse osmosis) hingga bilasan tidak berwarna.
3 HASIL
Produksi Lipase Yeast M2 dan Aplikasi Mencuci Pada Kain
Hasil produksi lipase yeast M2 menggunakan media yeast nitrogen base
broth (YNBB) dengan masa kultivasi 30 jam pada suhu 37oC memiliki aktivitas
7
Kemurnian Lipase dengan Metode Reverse Micellar Extractions
Pengaruh Surfaktan Terhadap Forward Extractions. Surfaktan yang digunakan dalam proses pemurnian metode reverse micellar adalah CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide), Triton x-100 dan Tween80. Dari tiga jenis
surfaktan yang digunakan dalam proses pemurnian lipase, surfaktan CTAB memiliki kemampuan ekstraksi paling optimal untuk lipase yeast M2 dalam pemisahan protein. Kemampuan ekstraksi ditandai dengan terbentuknya dua fase pemisahan yaitu fase organik dan fase air (Gambar 1). Kemampuan recovery aktivitas lipase dari yeast M2 sebesar 43.5% dan kadar protein 11.5% dengan kemurnian 3.1 kali. Surfaktan ionik Triton X-100 dan Tween80 tidak ada fase pemisahan yang dapat diamati setelah reaksi forward extraction, oleh karena itu tidak digunakan lagi untuk proses selanjutnya. Proses optimasi pemurnian lipase dari yeast M2 menggunakn surfaktan CTAB meliputi pH forward extraction, konsentrasi surfaktan CTAB, pH backward extraction dan konsentrasi NaCl.
(a) (b) (c)
Gambar 1 Pengaruh surfaktan terhadap reaksi reverse micellar (a) surfaktan Triton x-100 (b) surfaktan Tween80 (c) sufaktan CTAB
Pengaruh pH Pada Reaksi Forward Extractions. Pada reaksi forward
extraction pH mempengaruhi proses pengikatan protein target dengan surfaktan
sehingga terbentuk misel pada fase organik. Variasi pH yang digunakan pada reaksi forward extractions adalah pH 6, 7 dan 8. Aktivitas recovery mencapai optimum pada pH 7 dengan aktivitas recovery 47.20% dan protein recovery 15.66% dengan kemurnian 3.01 kali (Tabel 1). pH 8 menunjukan recovery protein tertinggi yaitu 23.28% sedangkan aktivitas recovery paling rendah yaitu sebesar 34.28% dengan kemurnian 1.46 kali.
Tabel 1 Pengaruh pH terhadap reaksi forward extraction
8
8 12.81 1.98 6.47 34.28 23.49 1.46
Konsentrasi Optimum CTAB Pada Forward Extractions. Konsentrasi surfaktan CTAB berperan penting dalam pembentukan misel secara sempurna dalam fase organik. Konsentrasi surfaktan CTAB yang digunakan adalah 25, 50, 75, 100, 150, dan 200 mM (Tabel 2). Variasi konsentrasi dari CTAB 50 dan 75 mM menunjukan kenaikan aktivitas recovery 64 % dan 66 % dengan recovery protein 25.5% dan 9.2% (Tabel 2). Peningkatan konsentrasi surfaktan CTAB (100, 150, 200 mM) lebih tinggi menyebabkan penurunan aktivitas recovery lipase dengan protein recovery semakin tinggi serta kemurnian lipase yang bervariasi. Konsentrasi optimum surfaktan CTAB untuk proses pemurnian lipase dari yeast M2 adalah 75 mM dengan aktivitas recovery 66 % dan protein
recovery 9.2 % dengan kemurnian 7.22 kali.
Tabel 2 Pengaruh variasi konsentrasi surfaktan CTAB
CTAB
pH Optimum Backward Reactions. Proses transfer kembali protein dari fase organik ke fase air ditentukan oleh nilai pH. pH pada reaksi backward
extractions divariasikan antara pH 6 hingga 9. Dari empat variasi pH backward
reactions, pH 8 dan 9 menunjukkan penurunan aktivitas recovery yang signifikan.
pH 9 aktivitas recovery adalah 0.00% dan protein recovery 7.22% sedangkan pH 8 aktivitas recovery 25.81% dengan kadar protein tertinggi sebesar 23.45%. Reaksi backward extreaction dengan menggunakan surfaktan CTAB dengan konsentrasi 75 mM optimum pada pH 6 dengan aktivitas recovery lipase 77.54% dan kemurnian mencapai 8.58 kali (Tabel 3). Recovery aktivitas lipase pada pH 7 adalah 43.76% dan protein recovery 10.32%.
Tabel 3 Pengaruh pH terhadap backward reactions
9
NaCl Optimum Backward Reactions. Konsentrasi NaCl sangat penting dalam proses pelepasan protein dari fase organik. Konsentrasi NaCl yang digunakan adalah 0.05, 0.1, 0.5, dan 1 M (Tabel 4). Dari empat konsentrasi yang digunakan dalam pemurnian lipase dengan surfaktan CTAB (75 mM) dan reaksi
backward extraction pada pH 6 terjadi peningkatan aktivitas recovery NaCl
dengan konsentrasi 0.1 M dan 0.5 M dengan aktivitas recovery tertinggi 77.62%, protein recovery 7.30 dan kemurnian 10.64 kali. Peningkatan konsentrasi NaCl 1 M menyebabkan penurunan aktivitas recovery yaitu 43.10% dengan kadar protein
recovery 7.15% dan kemurnian 6.03 kali (Tabel 4).
Tabel 4 Pengaruh NaCl terhadap backward reactions
NaCl (M)
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Lipase. Variasi pH untuk uji lipase dari yeast M2 divariasikan antara pH 7 hingga 12 dengan suhu reaksi 37oC. Aktivitas lipase diukur dengan terbentuknya produk pNP pada selang pH tertentu. Aktivitas lipase dari yeast M2 pada pH 8 dan 9 tidak menunjukkan aktivitas yang jauh berbeda. Aktivitas lipase dari yeast M2 optimum pada pH 8 dengan aktivitas 10.431 U/ml (Gambar 1) sedangkan lipase kehilangan aktivitas pada pH 12. Lipase dari yeast M2 aktif pada kisaran pH 7 hingga 9 hingga waktu inkubasi ke-90 menit dengan aktivitas sisa pada jam ke 90 menit sebesar 62.76%, 43.50%, dan 36.96%. Pada pH 10 lipase dari yeast M2 aktif hingga waktu inkubasi 60 menit dengan aktivitas sisa sebesar 34.97% sedangkan lipase pada pH 11 aktif hingga waktu inkubasi 30 menit.
10
Gambar 2 (a) Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase (b) pengaruh pH terhadap stabilitas lipase
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas dan Stabilitas Lipase. Variasi suhu yang digunakan untuk pengukuran aktivitas lipase yaitu 26, 28, 30, 34, 37, 40oC dengan pH reaksi 8. Aktivitas lipase mencapai optimum pad suhu 30oC dengan aktivitas 11.049 U/ml. Lipase dari yeast M2 yang diinkubasi pada suhu 26, 28, 30, 34, 37 & 40oC aktif hingga waktu inkubasi 90 menit dengan aktivitas sisa pada menit ke 90 sebesar 33.96%, 33.59%, 30.84%, 45.58%, 48.37%, dan 36.80%.
(a) (b)
Gambar 3 (a) Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase (b) pengaruh suhu terhadap stabilitas lipase
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Lipase
11
Gambar 4 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas lipase
Analisis SDS-PAGE
Lipase hasil pemurnian dianalisis dengan SDS-PAGE yang bertujuan untuk melihat kemurnian lipase dari yeast M2. Kemurnian lipase dilihat dengan menggunakan SDS-PAGE pada 12% gel akrilamid. Marker sebagai penanda bobot molekul, dan membandingkan antara crude lipase dan lipase ekstraksi
micellar extraction. Hasil SDS-PAGE menunjukan pada crude lipase
menunjukkan banyak pita yang terlihat, hal tersebut menandakan terdapatnya pengotor atau protein lain yang bukan dari lipase. Lipase hasil pemurnian dengan metode reverse micellar menunjukkan ada dua pitayang muncul.
a b c
Gambar 5 SDS-PAGE dari (a) marker (b) crude lipase (c) lipase pemurnian reverse micellar extraction
4 PEMBAHASAN
Produksi Lipase Yeast M2 dan Uji Aplikasi Lipase Pada Kain
Yeast M2 merupakan salah satu mikroorganisme penghasil lipase yang
12
merupakan enzim ekstrak kasar lipase. Sentrifugasi adalah suatu teknik pemisahan suatu protein berdasarkan berat molekul tertentu dan dengan kecepatan tertentu. Sifat hidrolitik yang dihasilkan lipase menjadikan peluang lipase untuk dijadikan sebagai tambahan pada deterjen. Lipase alkalin sangat dibutuhkan dalam formulasi deterjen karena memiliki kemampuan membersihkan lebih tinggi. Lipase dari yeast yang sudah dikembangkan untuk dijadikan deterjen seperti
Trichoderma lanugionosus dan Aspergylus oryzae dengan nama produk deterjen
lipoprime (Hasan 2010).
Enzim yang digunakan untuk deterjen harus stabil terhadap komponen lain dari deterjen seperti surfaktan dan juga stabil pada pH basa. Lipase yang dihasilkan oleh yeast M2 di uji kemampuan mencuci dalam menghilangkan olive oil pada kain. Aplikasi lipase pada kain bertujuan untuk melihat kemampuan lipase dalam menghidrolisis olive oil pada kain. Hasil uji menunjukan lipase dari
yeast M2 memiliki kemampuan menghilangkan minyak olive oil pada kain katun
sebesar 68.91% dengan kontrol 29.54% pada suhu ruang dan pH 8 selama 1 jam . Hasil ini menunjukkan kemampuan lipase dari yeast M2 dalam mencuci pada suhu rendah dan pada kondisi basa. Mikroba penghasil lipase alkali sangat dibutuhkan dalam formulasi deterjen berbasis enzim karena memiliki kemampuan membersihkan lebih tinggi dibandingkan deterjen menggunakan bahan kimia (Salihu et al. 2015). Faktor faktor yang mendukung penggunaan lipase pada deterjen adalah ketersediaan enzim yang luas, poliferasi bahan kimia dilingkungan, dan meminimalkan pemakaian energi, menurunkan penggunaan sumber bahan non perbaharuan dan penggunaan dapat dikontrol (Hasan 2010; Kumar et al. 2009). Deterjen yang mengandung enzim meningkatkan kualitas kain dan menjaga warna cerah. Enzim yang digunakan dalam deterjen dapat dijadikan sebagai pengganti pemutih klorin untuk menghilangkan noda pada kain.
Gambar 6 Reaksi Hidrolisis Lemak (Salimon et al. 2011)
Lipase dari yeast M2 dimurnikan dengan menggunakan metode reverse
micellar extraction. Reverse micellar extraction adalah proses pemurnian dalam
bentuk cair-cair yang melibatkan pembentukan misel oleh surfakatan didalam pelarut organik (Yang et al. 2008). Pemurnian enzim dengan metode reverse
micellar extraction melibatkan dua proses yaitu forward extraction dan backward
extraction (Gambar 5).Forward extraction adalah proses transfer protein dari fase
13
selektif dan pemurnian protein target dalam campuran protein yang sama dan berbeda. Reverse micellar extraction yang stabil secara termodinamika memiliki ukuran nanometer yang merangkum kolam mikroskopis air di dalam fase organik.
Reverse micellar extraction memiliki potensi besar untuk aplikasi dalam
industri, karena memberikan kondisi reaksi yang menguntungkan bagi kelarutan protein dalam fase organik dengan mempetahankan aktivitas biologis (Cortez et al. 2004). Pemurnian dengan menggunakan metode reverse micellar extraction dipengaruhi oleh jenis surfaktan, pH forward extraction, konsentrasi surfaktan,
pH backward extraction dan konsentrasi NaCl.
Gambar 7 Mekanisme Reverse Micellar Extraction (Storm et al. 2014)
Pengaruh Surfaktan Terhadap Forward Extractions
Surfaktan merupakan faktor penting dalam proses pemurnian dengan menggunakan metode reverse micellar extraction. Surfaktan yang digunakan pada proses pemurnian pada umumnya adalah surfaktan ionik, kationik dan nonionik. Surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) dilarutkan dengan isooktana yang mengandung hexanol dan butanol sebagai co-surfaktan memiliki kemampuan optimal dalam mengekstraksi lipase dari yeast M2. Kemampuan optimal CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) dalam pemurnian dengan metode reverse micellar extraction ditandai dengan terbentuknya dua fase yaitu fase organik dan fase air (Gambar 1c) pada forward extraction dengan aktivitas
recovery sebesar 43.5% dan protein 11.5% dengan kemurnian 3.1 kali.
14
umumnya surfaktan nonionik Tween80 dan Triton x-100 pada pemurnian dengan metode reverse micellar dimodifikasi dengan menggunakan surfaktan ionik sehingga mudah melarutkan protein. Untuk mencegah penonaktifan protein oleh surfaktan nonionik dengan menambahkan surfaktan ionik sehingga dapat meringankan interaksi elektrostatik yang kuat dalam misel dan protein dapat terlarut sempurna pada fase organik (Yang et al. 2008). Surfaktan CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide) yang digunakan untuk proses pemurnian
lipase dari yeast M2 dengan metode reverse micellar extraction membutuhkan co -surfaktan. Co-surfaktan adalah surfaktan yang mampu membangun kestabilan air didalam pelarut organik. Co-surfaktan yang digunakan dipilih dalam kelompok komponen yang larut didalam minyak dan memiliki daya tarik yang kuat terhadap surfaktan. Co-surfaktan berperan untuk meningkatkan kelarutan surfaktan didalam hidrokarbon dan berperan sebagai penstabil ion-ion pada bagian kepala surfaktan sehingga memudahkan dalam proses pembentukan misel. Isooctane yang digunakan sebagai pelarut surfaktan mampu meningkatkan interaksi yang menarik antara reverse micellar yang dapat peningkatkan interaksi intermisel karena isooktan yang tebal menembus ke dalam monolayer ampifilik pada antarmuka misel dibandingkan dengan pelarut yang lain. Alkohol membantu memodifikasi baik untuk reverse micellar karena molekul alkohol memiliki properti amphiphilic sebagai co-surfaktan (Yin et al. 2011). Keberadaan co-surfaktan juga tidak selalu diinginkan didalam protein murni terutama dari jenis alkohol. Alternatif lain penganti alkohol dapat digunakan seperti dari jeni keton (metil isobutil keton), ester ( N-butil asetat) atau aldehid (heptylaldehyde) (Tanova et al. 2008).
Nandini dan Rastogi (2009) telah melaporkan Recovery enzim 82.72% dengan kationik surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) pada reaksi
forward extractions dari lipase Aspergillus niger menggunakan isooktana
mengandung heksana dan butanol sebagai co-solvent pada pH 7.0 dengan kemurnian 4.094 kali. Recovery enzim lipase 80% dan kemurnian 15 kali lipat dengan surfaktan ionik AOT (Gaikaiwari et al.2012). Pemurnian tannase menggunakan surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) memiliki aktivitas recovery 81% dengan kemurnian mencapai 12.74 kali pada dengan reaksi bacward extraction pada pH 3.5 (Gaikaiwari et al. 2012).
Pengaruh pH Pada Reaksi Forward Extractions
pH pada reaksi forward extraction menentukan keadaan ionisasi dari permukaan dengan molekul protein. Interaksi tarik menarik antara molekul protein dan kelompok surfaktan akan terjadi ketika muatan protein berlawanan dengan muatan dari kelompok surfaktan. Pemurnian lipase dari yeast M2 pada reaksi forward extraction optimum pada pH 7 dengan aktvitas recovery 47.20% (Tabel 1). Proses ekstraksi protein tergantung pada nilai pH dari forward
extraction karena dapat mempengaruhi kestabilan reverse micellar extraction. pH
15
proses pemisahan, ketika perubahan nilai pH, volume ekstraksi dan kelarutan surfaktan dapat bervariasi (Yin et al. 2011). Perubahan nilai pH sangat memengaruhi stabilitas reaksi forward extraction karena perubahan nilai pH larutan pada saat ekstraksi dapat mempengaruhi kelarutan surfaktan. Faktor ion juga dapat mempengaruhi kelarutan protein didalam fase organik. Pada umumnya protein dapat dipindahkan ke fase reverse micellar ketika pH berlawanan dengan kelompok surfaktan karena kelarutan biasanya dikendalikan oleh interaksi elekrostatik antara molekul protein dan kelompok kepala surfaktan (Yu et al. 2003). Jika nilai pH fase air lebih tinggi, protein dapat dengan mudah masuk ke
reverse micellar disusun dengan menggunakan surfaktan kationik. (Yin et al.
2011).
Pengaruh Konsentrasi CTAB Pada Forward Extractions
Konsentrasi optimum surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium
bromide) untuk pemurnian lipase dari yeast M2 dengan metode reverse micellar
extraction adalah 75 mM (Tabel 2). Konsentrasi surfaktan dan protein awal dapat
membatasi kelarutan. Batas kelarutan tergantung pada ukuran protein, konsentrasi surfaktan dan kekuatan ion fase organik (Tanova et al. 2008). Ketika konsentrasi surfaktan meningkat, jumlah misel juga akan meningkat karena peningkatan tolakan elektrostatik dalam misel. Peningkatan konsentrasi surfaktan CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide) (100, 150, dan 200 mM) menunjukkan
penurunan aktivitas recovery pada lipase yeast M2. Kuantitas maksimum protein yang dapat dilarutkan dalam fase misel terutama ditentukan oleh luas permukaan dan dinding surfaktan (Lye et al. 1995). Penurunan aktivitas recovery akibat tingginya konsentrasi surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) disebabkan oleh pengelompokan misel yang menurunkan daerah substrat yang tersedia untuk biomolekul target sehingga menyebabkan penurunan kapasitas ekstraksi (Nandini dan Rastogi. 2009). Surfaktan kationik CTAB dalam ekstraksi protein membutuhkan co surfaktan dalam ekstraksi karena menunjukkan sifat serapan air yang tinggi, (Yang et al. 2008).
Benturan misel yang lebih sering terjadi karena besar populasi pada konsentrasi surfaktan yang tinggi sehingga menyebabkan ekstraksi menurun. Peningkatan ekstraksi biomolekul target dengan peningkatan konsentrasi surfaktan menyebabkan penurunan aktivitas recovery lipase (Gaikaiwari et al. 2012). Semakin tinggi konsentrasi surfaktan dibandingkan jumlah misel, tingkat ekstraksi protein dapat meningkat. Jika konsentrasi surfaktan melebihi batas tertentu, interaksi kekuatan antara misel menyebabkan difusi dan mengurangi rasio ekstraksi protein (Yin et al. 2011). Pada umumnya, semakin besar ukuran misel, proses pembungkusan enkapsulasi semakin mudah karena ukuran misel yang besar dapat ditempati oleh satu atau lebih protein yang dikemas dan semakin sedikitnya jumlah misel dapat mencegah benturan yang mempengaruhi proses ekstraksi.
16
Transfer protein terlarut dari fase organik kembali ke fasa cair merupakan ekstraksi kembali. Protein dapat dilepaskan dipengaruhi oleh tolakan elektrostatik dari surfaktan, pemilihan pH yang sesuai, atau dengan meningkatkan konsentrasi garam dalam fasa air.Untuk membuat protein kembali ke fase air segar dari fase organik daya tarik antara surfaktan dan protein harus dirusak. Dalam meningkatkan proses kembali untuk mentransfer protein kembali ke fase air dari fase organik terjadi tarik menarik antara surfaktan dengan protein. Backward extraction terjadi ketika pH larutan lebih rendah dibandingkan pH larutan organik (Wang et al. 2015). Ekstraksi kembali protein terlarut dari fase organik dipengaruhi oleh pH yang digunakan. Dari empat variasi pH yang digunakan,
backward reactions optimal pada pH 6 dengan aktivitas recovery lipase 77.54%
dan kemurnian mencapai 8.58 kali (Tabel 3). Ekstraksi kembali zat terlarut dari fase organik dipengaruhi oleh pH larutan yang digunakan. Kenaikan nilai pH reaksi backward extraction menyebabkan penurunan aktivitas recovery. Penurunan aktivitas enzimatik ketika pH tinggi kemungkinan disebabkan oleh ketidakstabilan protein dalam pelarut organik. Dalam reaksi tanase dari
Aspergillus allahbadi menggunakan surfaktan CTAB (cetyltrimethylammonium
bromide) tidak ada recovery enzim dalam kisaran pH basa (7.0 dan 9.0)
(Gaikaiwari et al. 2012). Nilai pH pada fase organik tidak mendukung untuk transfer protein ke fase berair (Harikrishna et al. 2002). Teknik penting untuk meningkatkan ekstraksi kembali protein dari fase organik yaitu dengan menggunakan larutan dengan konsentrasi garam yang tinggi atau pH yang tinggi dan penambahan alkohol yang sesuai. Tolakan elektrostatik antara protein dan surfakatan diakibatkan oleh perbedaan pH dan konsentrasi garam yang meningkat (Lee et al. 2011).
Pengaruh NaCl terhadap Backward Reactions
Kekuatan ionik dari fase air menentukan faktor penting dalam reverse
micellar. Transfer protein terlarut dari backward extraction kembali ke fasa air
17
larutan bufer yang mengandung NaCl dianggap sebagai penggerak transfer air dengan perembesan melalui misel surfaktan. Gerakan yang terjadi dua arah menyebabkan destabilisasi terbalik antara misel dan protein. Ketika kekuatan ion yang telah digunakan rendah, terjadi pembengkakan pada misel dan menyebabkan protein rilis(Gaikaiwari et al. 2012).
Penambahan isopropanol 15% dalam reaksi backward extraction bertujuan untuk membantu pelepasan protein dari surfaktan pada fase organik. Penambahan isopropanol dapat meningkatkan interaksi dan tarik menarik antara misel dan susunan surfaktan dalam fase pelarut organik sehingga terjadi ketidakstabilan pada reverse micellar sehingga protein lepas.
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Lipase
Aktivitas enzim merupakan kemampuan enzim dalam mengubah substrat menjadi produk selama selang waktu tertentu. Aktivitas enzim dapat diukur berdasarkan bertambahnya produk atau bekurangnya substrat. Lipase merupakan enzim yang menghidrolisis pemecahan lemak dan minyak menjadi asam lemak bebas. pH dapat mempengaruhi pergerakan ion terhadap residu asam amino enzim. Lipase yang toleran pada pH alkali dibutuhkan dalam formulasi deterjen karena deterjen berbasis enzim memiliki kemampuan membersihkan yang lebih tinggi daripada deterjen kimia (Salihu et al. 2015). Lipase dari yeast M2 optimum pada pH 8 yaitu 10.431 U/ml sedangkan pada pH 12 enzim lipase kehilangan aktivitas (Gambar 3a). ). Nilai pH deterjen pada umumnya berkisar antara 9.0-10.0 karena aktifitas yang tinggi pada pH basa merupakan faktor penting dalam deterjen berbasis enzim (Jellouli et al. 2011). Lipase yang dihasilkan oleh
Acinetobacter radioresistens memiliki pH optimum 10 dan stabil pada rentang pH
6-10 oleh karena itu memiliki potensi besar untuk aplikasi dalam industri deterjen (Hasan et al. 2006). Lipase dari Talaromyses thermophilus yang berpotensi sebagai tambahan pada deterjen memiliki pH optimum 9 (Belhaj et al. 2010). Lipase yang stabil dan bekeja pada pH basa (8-11) memiliki potensi yang baik untuk diaplikasikan dalam industri deterjen (Li et al. 2014; Hasan et al 2006; Maharana dan Ray 2015). Aktivitas katalitik enzim dipengaruhi oleh bentuk struktur konformasi dalam pelipatan polipeptida, sehingga kerusakan kecil yang terjadi pada struktur trsier dapat menurunkan aktivitas biokatalisnya. Aktivitas lipase stabil pada pH 7 hingga 9 dengan waktu inkubasi selama 90 menit (Gambar 3). Pada pH 10 lipase kehilangan stabilitas pada menit ke 90 lipase sebesar 34.97% dan pada pH 11 lipase kehilangan aktivitas pada menit ke 30. Perbedaan nilai pH lipase tersebut dikarenakan perbedaan struktur residu asam amino pada sisi aktif enzim. Lipase yang digunakan dalam formulasi deterjen umumnya stabil pada kondisi basa karena pH deterjen laundry umumnya berkisar pada pH 9.0-11.0 (Liu et al. 2009).
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Lipase
18
4). Lipase pada suhu rendah yang digunakan dalam formulasi deterjen dapat mengurangi pemakaian energi serta dapat menjaga serat dan kualitas kain (Liu et al. 2009). Deterjen berbasis enzim yang menunjukkan aktivitas tertinggi pada suhu rendah akan lebih praktis daripada yang memiliki suhu tinggi. Aktifitas dan stabilitas lipase yang didapatkan baik dan sebanding dengan lipase lainnya yang telah dilaporkan kompatibel untuk formulasi deterjen. Secara umum noda lemak tidak mudah dihapus pada suhu rendah menggunakan deterjen konvensional (Li et al. 2014). Lipase dari yeast M2 menunjukkan kestabilan pada suhu 28 hingga 37 dengan waktu inkubasi selama 90 menit. Kestabilan enzim terhadap suhu terjadi karena pelipatan asam amino penyusun protein membentuk konformasi tertentu yang tahan terhadap efek denaturasi akibat pemanasan. Lipase jamur maupun yeast pada umumnya jarang ditemukan stabil pada suhu di atas 40oC (Liu et al. 2009).
Pengaruh Ion LogamTerhadap Aktivitas Lipase
Enzim memerlukan ion-ion logam tertentu untuk meningkatkan aktivitasnya. Pada konsentrasi tertentu, ion logam dapat bertindak sebagai aktivator dan pada konsentrasi tertentu pula dapat bertindak sebagai inhibitor. Dari beberapa ion logam yang diuji Mn, Ca, Fe bersifat sebagai aktivator untuk lipase sedangkan Zn dan Cu bersifat inhibitor terhadap lipase (Gambar 3). Kation logam Ca memainkan peranan penting dalam mempengaruhi struktur dan fungsi enzim (Horchani et al. 2009). Aktivator merupakan suatu senyawa yang berfungsi untuk mengaktivasi kompleks enzim dan substrat. Meningkatnya aktivitas lipase disebabkan karena dapat mengukat kompleks logam pada sisi aktif dari enzim untuk merubah konformasi protein dan kemungkinan Ca2+ bisa kompleks dengan asam lemak yang dihasilkan selama proses katalisis sehingga menghilangkan kemungkinan penghambatan produk (Patel et al. 2014). Lipase membutuhkan kalsium sebagai penggerak katalitik dan dalam membangun struktur enzim stabil yang berperan dalam mengikat struktur internal enzim (Li et al. 2014). Pada umumnya ion logam melindungi enzim terhadap denaturasi suhu dan memainkan peran penting dalam menjaga konformasi aktif dari enzim pada suhu yang lebih tinggi (Do Nascimento dan Martins. 2004). Aktivasi atau inhibisi enzim proteolitik oleh ion logam bisa mengubah tingkat turnover enzim ekstraseluler (Palmieri et al. 2001)
Analisis SDS-PAGE
Elektroforesis merupakan suatu teknik untuk pemisahan fraksi-fraksi campuran berdasarkan atas penggerakan partikel dibawah pengaruh medan listrik. Hasil SDS-PAGE pemurnian enzim lipase dari yeast M2 dengan metode reverse
micellar extraction menunjukkan adanya dua pita protein yang berdekatan
19
surfaktan yang digunakan kurang selektif pada saat proses pemurnian sehingga tidak terjadi pemurnian secara sempurna.
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Surfaktan yang digunakan dalam proses pemurnian dengan metode reverse
micellar extraction adalah cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), Triton
X-100, Tween-80. Dari ketiga surfaktan yang digunakan dalam ekstraksi reverse
micellar, surfaktan cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) terpilih dapat
merecovery lipase. Forward extractions dari lipase ditemukan maksimum menggunakan buffer fosfat pada pH 7.0 yang mengandung 75 mM CTAB dalam fase organik yang terdiri dari isooktana, butanol dan heksanol. Lipase pada
backward reactions pada saat diekstraksi dari fase organik ke fase berair optimum
pada buffer pH 6 yang mengadung 0.5 M NaCl. Aktivitas recovery lipase dengan 77.62% dengan kemurnian 10.64 kali lipat. Lipase memiliki suhu optimum dan pH 30oC dengan pH 8 dan stabilitas dengan berbagai logam ion, hasil menunjukkan bahwa enzim menunjukkan potensi sebagai tambahan pada deterjen.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjut tentang kondisi pH dan suhu optimum pertumbuhan dari isolat yeast M2 untuk menghasilkan lipase yang optimum dan pemurnian lipase dari yeast M2 dengan metode reverse micellar extraction menggunakan surfaktan ionik di-2-ethylhexyl sodium sulfosuccinate (AOT) untuk mengetahui pengaruh surfaktan ionik AOT dalam proses pemurnian dengan menggunakan metode reverse micellar sehingga mendapatkan jenis surfaktan yang optimal dalam proses pemurnian lipase dari yeast M2.
DAFTAR PUSTAKA
Amara S, Salem SR. 2009. The possibility to use bacterial protease and lipase as biodetergent. J Biotechnology & Biochemistry 4 (2): 104-114
20
fungus for use in laundry detergents. Biochemical Engineering Journal 53:112–120.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganism quantities of protein in utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem 72 (1): 248‐254.
Carvalho CML, Cabral JMS 2000. Reverse micelles as reaction media for lipases.
Biochimie 82: 1063–1085.
Cortez EV, Pessoa A, Felipe MDGDA, Roberto IC, Vitolo M. 2004. Liquid– liquid extraction of xylitol dehydrogenase from Candida guilliermondii homogenate by reversed micelles. Journal of Chromatography B (807): 55–60
Dheeman D, Babu S, Frias JM, Mahenan GT. 2011. Purification and characterization of an extracellular lipase from a novel strain Penicillium sp. DS-39 (DSM 23773). Journal of Molecular Catalysis Enzymatic 72: 256–262.
Do Nascimento, WCA and Martins MLL.2004. Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp. J.Microbiol 35: 91. Gaikawari RP, Wagh SA, Kulkarni BD. 2012. Efficient lipase purification using
reverse micellar extraction. Bioresource Technology 108 224–230.
Gaikawari RP, Wagh SA, Kulkarni BD. 2012. Extraction and purification of tannase by reverse micelle system. Bioresource biotechnology 89:288– 296.
Hasan. 2010. Enzymes used in detergents: lipases. African Journal of
Biotechnology Vol. 9 (31): 4836-4844.
Hasan F, Shah AA, Hameed A. 2006. Industrial applications of microbial lipases.
Enzyme and Microbial Technology 39: 235–251.
Hebbar HU, Sumana B, Rhagavarao KSMS. 2008. Use of reverse micellar systems for the extraction and purification of bromelain from pineapple wastes. Bioresource Technology 99: 4896–4902.
Horchani H, Hoabah H, Salem NB, Gargouri Y, Sayari A. 2009. Biochemical and molecular characterisation of a thermoactive, alkaline and detergent stable lipase from a newly isolated Staphylococcus aureus strain. Journal
of Molecular CatalysisEnzymatic 56: 237–245.
Jellouli K, Bellaaj OG, Ayed HB, Manni L, Agrebi R, Nasri M. 2011. Alkaline protease from Bacillus licheniformis MP1 Purification, characterization and potential application as a detergent additive and for shrimp waste deproteinization. Process Biochemistry 46: 1248–1256.
Li XL, Zhang WH, Wang Y, Dai YJ, Zhang TH, Wang Y. 2014. A high detergent performance, cold-Adapded lipase from Pseudomonas stutzeri PS59 suitable For detergent formulations. Journal Moleculer Catalysis
Enzymatic 16-24.
Liu CH, Huang CC, Wang YW, Chang JS. 2012. Optimizing lipase production from isolated Burkholderia sp. Chemical Engineers 43 (511–516).
21
Maharana A, Ray P. 2015. A novel cold-active lipase from psychrotolerant
Pseudomonas sp. AKM-L5 showed organic solvent resistant and suitable
for detergent formulation. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 120: 173–178.
Nandini KE, Rastogi NK. 2009. Reverse micellar extraction for downstream processing of lipase: Effect of various parameters on extraction. Process
Biochemistry 44: 1172–1178.
Palmieri GC, Bianco G, Cennamo P, Giardina G, Marino M, Monti, Sannia G. purification, characterization and functional role of a novel extracellular protease from pleurotus ostreatus. Environ Microbiol. 67: 2754.
Patel V, Nambiar S, Madamwar D. 2014. An extracellular solvent stable alkaline lipase from Pseudomonas sp. DMVR46: Partial purification, characterization and application in non aqueous environment. Process
biochem.
Salihu A, Alam MZ. 2015. Solvent tolerant lipases: A review. Process
Biochemistry 50: 86–96.
Setapar SHM, Aziz SNM, Harun NH, Azizi CYM. 2012. Review on the extraction of biomolecules by biosurfactant reverse micelles. APCBEE
Procedia 3: 78 – 83
Silva WOB. 2005. Production and extraction of an extracellular lipase from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Process Biochem. 40(1): 321-326.
Storm S, Aschenbrenner D, Smirnova I. 2014. Reverse micellar extraction of amino acids and complex enzyme mixtures. Separation and Purification Technology 123: 23–34
Tonova K, Larazova z. 2008. Reversed micelle solvents as tools of enzyme purification and enzyme-catalyzed conversion. Biotechnology Advances. 26: 516–532 current chromatography using a reverse micelle solvent system. Food
Chemistry 129: 925–93
Yu YC, Chu Y, Ji JY. 2003. Study of the factors affecting the forward and back extraction of yeast-lipase and its activity by reverse micelles. Journal of
22
23
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian
Produksi enzim lipase yeast M2
Pemurnian lipase yeast M2 dengan metode reverse micellar extraction
Karakterisasi lipase yeast M2 sebagai biodeterjen
Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas dan
stabilitas lipase
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas lipase
Analisis protein lipase dengan
24
Lampiran 2 Kurva Standar pNP
Konsentrasi mg/ml Absorbansi
0 0
0.1 0.032
0.2 0.109
0.3 0.162
0.4 0.224
0.5 0.261
0.6 0.316
0.7 0.351
0.8 0.403
0.9 0.452
25
Lampiran 3 Kurva Standar BSA
konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi
0 0
0,05 0,061
0,1 0,134
0,15 0,177
0,2 0,24
0,25 0,29
0,3 0,358
0,35 0,422
y = 1,88x - 0,01 R² = 0,9916
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
A
bsorbansi
26
Lampiran 4 Komposisi gel SDS-PAGE (Akrilamid 12%)
Komposisi Separating Gel Stacking Gel
1.5 x Tris HCl pH 8.8 – 10 % SDS 1.25 mL -
Penulis dilahirkan di Payakumbuh pada tanggal 31 Juli 1992 sebagai anak dari pasangan ayah Suhardinata (Alm) dan ibu Nusrawati. Pendidikan sarjana (S1) ditempuh di Departemen Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu pendidikan Sumatera Barat 2012. Pada tahun 2013, penulis diterima di program studi Biokimia (BIK) pada Program Pascasarjana IPB dengan beasiswa Fresh Graduate DIKTI tahun 2013.
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar magister sains penulis melakukan penelitian dengan judul “Pemurnian Dan Karakterisasi Lipase Dari
Yeast M2 Sebagai Biodeterjen”. Penelitian ini dibimbing oleh Dr Syamsul Falah
27
dan Dr Budiasih Wahyuntari. Artikel penelitian ini juga telah diterima di Jurnal Sains Teknologi Indonesia (JSTI).
