MINYAK ATSIRI JAHE (Zingiber officinale) PADA OTOT POLOS ILEUM MARMUT (Cavia cobaya) TERISOLASI: STUDI IN SILICO DAN IN
VITRO PADA RESEPTOR ASETILKOLIN MUSKARINIK 3 Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
Disusun Oleh M. TAMAM WAHYUDI
20120350007
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA
2016
MINYAK ATSIRI JAHE (Zingiber officinale) PADA OTOT POLOS ILEUM MARMUT (Cavia cobaya) TERISOLASI: STUDI IN SILICO DAN IN
VITRO PADA RESEPTOR ASETILKOLIN MUSKARINIK 3
Disusun Oleh M. TAMAM WAHYUDI
20120350007
Telah disetujui dan diseminarkan pada tanggal 30 Agustus 2016
Dosen Pembimbing
Hari Widada, M.Sc., Apt. NIK: 1977 0721 201004 173120 Dosen Penguji 1
Sabtanti Harimurti, M.Sc., Ph.D., Apt NIK: 1973 0223 201310 173127
Dosen Penguji 2
Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt NIK: 1986 1107 201310 173224 Mengetahui,
Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
ii Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Menyatakan dengan sebenarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.
Apabila di kemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.
Yogyakarta, 20 Agustus 2016 Yang membuat pernyataan,
iii
Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan. Maka apabila engkau telah selesai (dari suatu urusan), tetaplah bekerja keras untuk (urusan yang lain).
(QS. Al-Insyirah: 5-7)
Man Jadda Wajada
“Barang siapa bersungguh-sungguh maka dia akan berhasil” (Nabi Muhammad SAW)
“Tiadanya keyakinanlah yang membuat orang takut menghadapi tantangan; dan saya percaya pada diri saya sendiri.”
(Muhammad Ali)
“Banyak kegagalan dalam hidup ini dikarenakan orang-orang tidak menyadari betapa dekatnya mereka dengan keberhasilan saat mereka
menyerah.” (Thomas Alva Edison)
iv
v
“Uji Aktivitas Anti-emetik Minyak Atsiri Jahe (Zingiber officinale) pada Otot Polos
Ileum Marmut (Cavia cobaya) Terisolasi: Studi In Silico dan In Vitro pada Reseptor
Asetilkolin Muskarinik 3”. Shalawat serta salam semoga senantiasa terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW, serta keluarga dan para sahabatnya.
Penulisan Karya Tulis Ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada:
1. Allah SWT atas berkat, rahmat, dan karunia-Nya dalam memudahkan segala penelitian yang dilakukan.
2. dr. H. Ardi Pramono, Sp.An, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta yang telah memberi izin dalam pelaksanaan Karya Tulis Ilmiah ini.
3. Sabtanti Harimurti, Ph.D., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi. 4. Bapak Hari Widada, M.Sc., Apt selaku dosen pembimbing dan Ibu Sabtanti
Harimurti, Ph.D., Apt serta Bapak Puguh Novi Arsito, M.Sc., Apt selaku penguji atas bimbingannya.
vi
7. Teman-teman kontrakan HIMAHO (Kak Haikal, Kak Yan, Kak Deno, Kak Firda, Toyib, Mala, Icad) atas kegilaan dan motivasi yang kalian berikan selama hidup merantau di Jogja.
8. Mala Hikmawan Pramana, S. Farm selaku mentor Saya atas kerja samanya. 9. Rekan-rekan selama melakukan penelitian di Laboratorium Teknologi
Farmasi (Aditya Rizqi, Nazila, Ratih, Indah) atas kerja samanya.
10.Laboran Laboratorium Teknologi Farmasi FKIK UMY (Mas Satria dan Mbak Zelmi).
11.Teman-teman seperjuangan Aspartic (Farmasi UMY Angkatan 2012) atas
kebersamaan yang telah kita lalui selama 4 tahun ini, semoga kita semua menjadi orang-orang yang sukses dan berguna bagi masyarakat.
Semoga Allah SWT membalas dan melipatgandakan segala amal dan kebaikan yang telah diberikan, amin.
Yogyakarta, 20 Agustus 2016 Penulis
vii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN ... ii
MOTTO ... iii
PERSEMBAHAN ... iv
KATA PENGANTAR ... v
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR LAMPIRAN ... xi INTISARI ... Error! Bookmark not defined. ABSTRACT ... Error! Bookmark not defined. BAB I PENDAHULUAN ... Error! Bookmark not defined. A. Latar Belakang ... Error! Bookmark not defined. B. Rumusan Masalah ... Error! Bookmark not defined. C. Keaslian Penelitian... Error! Bookmark not defined. D. Tujuan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E. Manfaat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined. A. Mual dan Muntah ... Error! Bookmark not defined. 1. Definisi ... Error! Bookmark not defined. 2. Epidemiologi ... Error! Bookmark not defined. 3. Faktor-faktor Predisposisi ... Error! Bookmark not defined. 4. Terapi Farmakologis ... Error! Bookmark not defined. B. Reseptor Acetyl-Choline (ACh) ... Error! Bookmark not defined. C. Interaksi Obat dengan Reseptor ... Error! Bookmark not defined. D. Minyak Atsiri ... Error! Bookmark not defined. E. Jahe (Zingiber officinale) ... Error! Bookmark not defined. 1. Uraian Tanaman ... Error! Bookmark not defined. 2. Kandungan dan Manfaat Jahe (Zingiber officinale)Error! Bookmark not
defined.
BAB III METODE PENELITIAN... Error! Bookmark not defined. A. Desain Penelitian ... Error! Bookmark not defined. B. Tempat dan Waktu ... Error! Bookmark not defined. C. Variabel Penelitian dan Definisi OperasionalError! Bookmark not defined.
D. Instrumen Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 1. Alat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 2. Bahan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E. Cara Kerja ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MSError! Bookmark not defined.
2. Uji In Silico ... Error! Bookmark not defined.
3. Uji In Vitro pada Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined.
F. Skema Langkah Kerja ... Error! Bookmark not defined. G. Analisis Data ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MSError! Bookmark not defined.
2. Uji Molecular Docking dengan AutoDockTools 4.2Error! Bookmark
not defined.
3. Uji In Vitro Ileum Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... Error! Bookmark not defined. A. Hasil Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia GC-MS ... Error! Bookmark not defined.
2. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDockError! Bookmark not
defined.
x
Gambar 3. Prinsip Dasar Molecular Docking ... Error! Bookmark not defined. Gambar 4. Alat Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined. Gambar 5. Kerangka Konsep... Error! Bookmark not defined. Gambar 6.Skema Langkah Kerja Uji In Silico dan GC-MSError! Bookmark not defined.
Gambar 7. Skema Langkah Kerja Uji In Vitro ... Error! Bookmark not defined. Gambar 8. Kromatogram Minyak Atsiri Jahe (Zingiber officinale) ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 9. Kode dan Struktur Reseptor AsetilkolinError! Bookmark not defined.
Gambar 10. Preparasi Protein dan Ligan 0HK 2DError! Bookmark not defined. Gambar 11. Posisi Native Ligand ketika terikat ke reseptor ACh M3 ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 12.Pengaruh DMSO terhadap respon kontraksi otot polos ileum . Error! Bookmark not defined.
Gambar 13.Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Jahe ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 14.Posisi Zingiberene ketika terikat ke reseptor ACh M3 ... Error! Bookmark not defined.
Gambar 15. Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Atropin ... Error! Bookmark not defined. Gambar 16.Posisi senyawa Atropin ketika terikat ke reseptor ACh M3... Error! Bookmark not defined.
Gambar 17. Posisi native ligand dan zingiberene terikat ke reseptor ACh M3
... Error! Bookmark not defined. Gambar 18. Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Recovery
xi
Tabel 2. Cara pemberian dosis agonis asetilkolin . Error! Bookmark not defined. Tabel 3. Kandungan kimia senyawa minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale)
... Error! Bookmark not defined. Tabel 4.Nilai rata-rata pD2 asetilkolin karena pengaruh DMSO 100 µL ... Error! Bookmark not defined.
Tabel 5.Pergeseran nilai pD2 asetilkolin karena pengaruh jaheError! Bookmark not defined.
Tabel 6.Pergeseran nilai pD2 asetilkolin karena pengaruh atropin ... Error! Bookmark not defined.
xii not defined.
Lampiran 3. Data Uji Reversibilitas Minyak Atsiri JaheError! Bookmark not defined.
Lampiran 4. Hasil Uji Statistik terhadap Kontraksi Otot Polos Ileum ... Error! Bookmark not defined.
Lampiran 5. Penambahan atom Hydrogen pada residu proteinError! Bookmark
not defined.
Lampiran 6. Proses preparasi parameter grid reseptor ACh M3Error! Bookmark
not defined.
Lampiran 7. Hasil skor docking pada reseptor ACh M3Error! Bookmark not
defined.
gastroesophageal reflux atau GERD. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengetahui pengaruh senyawa golongan minyak atsiri Jahe (Zingiber
officinale) dari tanaman obat Indonesia terhadap kontraksi otot polos ileum
yang diinduksi agonis asetilkolin.
Metode yang digunakan adalah in silico dan in vitro, yaitu dengan
melakukan molecular docking menggunakan aplikasi AutoDockTools dan
percobaan pada otot polos ileum hewan uji marmut (Cavia cobaya)
menggunakan alat organbath. Analisis molecular docking ini berupa
perbandingan skor docking dari ligan asli (Tiotropium), senyawa uji
(Zingiberene) dan obat pembanding (Atropine Sulfate). Minyak atsiri Jahe
diberikan dengan dosis 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million), sementara
agonisnya diberikan dengan seri kadar 10-8 - 10-2 M. Pada uji in vitro ini juga akan dipelajari sifat reversibilitasnya pada reseptor asetilkolin muskarinik (ACh M3).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa minyak atsiri jahe dosis 1 ppm dan 1,25 ppm mampu menghambat respon kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi oleh seri konsentrasi asetilkolin. Hal ini terlihat dengan terjadinya pergeseran kurva respon kontraksi otot polos ileum terisolasi ke arah kanan dengan pola tergantung dosis. Hasil visualisasi
docking menunjukkan bahwa senyawa uji dan ligan asli melekat pada residu
yang sama, yaitu tyrosine ke-529. Jahe juga memiliki ikatan energi yang lebih
kuat dibandingkan dengan Atropin sebagai senyawa pembanding. Dari hasil
docking senyawa marker dan percobaan pada otot polos ileum terisolasi dari
minyak atsiri jahe berpotensi sebagai agen antiemetik.
or liquid) above which is also called gastroesophageal reflux or GERD. The purpose of this study was to determine the effect of the compound class of essential oils Ginger (Zingiber officinale) on Indonesian medicinal plants
against smooth muscle contraction induced ileum agonist acetylcholine. The method used is in silico and in vitro, is to perform molecular
docking using AutoDockTools applications and experiments on smooth muscle of guinea pig ileum test animal (Cavia cobaya) using the tool organ
bath. Analysis of this form of comparative molecular docking of ligand docking original score (Tiotropium), the test compound (zingiberene) and a
comparator drug (Atropine Sulfate). Ginger essential oils given at a dose of 1 ppm and 1,25 ppm (part per million), while agonist given the rate series 10-8 - 10-2 M. In vitro tests have also examined the nature reversibility at muscarinic acetylcholine receptors (ACh M3).
The results of this study indicate that ginger essential oil dose of 1 ppm and 1,25 ppm is able to inhibit smooth muscle contraction response of isolated guinea pig ileum induced by acetylcholine concentration series. This was shown by a shift in the response curve isolated ileum smooth muscle contraction in the right direction with a dose-dependent pattern. Docking visualization results showed that the test compound and the native ligand attached to the same residues, namely tyrosine to-529. Ginger also has binding energy that is stronger than the Atropine as a comparison compound. From the results of docking marker compounds and experiments on isolated ileum smooth muscle of essential oils of ginger as a potential anti-emetic agent.
1 Mual adalah perasaan dorongan kuat untuk muntah. Muntah atau memuntahkan adalah memaksa isi perut naik melalui kerongkongan dan keluar dari mulut (UMMC, 2013). Penyebab mual dan muntah ini ada bermacam-macam seperti: alergi makanan, infeksi pada perut atau keracunan makanan, bocornya isi perut (makanan atau cairan) keatas yang juga disebut gastroesophageal reflux atau GERD (UMMC, 2013). Mual dan
muntah sejauh ini merupakan kejadian yang sering terjadi pada kondisi kesehatan selama kehamilan, dengan prevalensi diperkirakan sekitar 50 - 70 %. Kejadian yang sering terjadi berupa hyperemesis gravidarum (HG), telah
diperkirakan sebesar 0,5 - 2 % dari seluruh kehamilan (Svetlana et al, 1999).
Anti-emetik atau obat mual adalah obat yang digunakan untuk mengatasi rasa mual dan muntah. Antiemetik secara khusus digunakan untuk mengatasi mabuk perjalanan dan efek samping dari analgesik dari golongan opiat, anestesi umum, dan kemoterapi yang digunakan untuk melawan kanker, juga untuk mengatasi vertigo (pusing) atau migren (Mutschler, 1991).
elektrolit akibat sekunder dari muntah, anoreksia berat, memburuknya status gizi atau kehilangan berat badan.
Rimpang jahe memiliki bentuk yang bervariasi, mulai dari agak pipih, sampai gemuk (bulat panjang), dengan warna putih kekuning-kuningan hingga kuning kemerahan. Rimpang jahe mengandung minyak atsiri. Minyak atsiri adalah minyak yang mudah menguap dan memberikan bau khas pada jahe. Minyak atsiri mengandung komponen utama berupa senyawa zingiberen (C15H24) dan zingiberol (C12H26O4). Senyawa yang
menyebabkan rimpang jahe berasa pedas dan agak pahit adalah oleoresin
(fixed oil). Komponen utama oleoresin berupa senyawa gingerol
(C17H26O4), shogaol (C17H24O3), dan resin (Ali, et al., 2008).
Penelitian dan pengembangan obat bertujuan untuk mengembangkan agen terapi baru. Pada umumnya pengembangan obat dilakukan melalui studi farmakokinetik dan penelitian proses metabolisme obat yang melibatkan metode in vivo dan in vitro, sehingga pengembangan
obat membutuhkan waktu sekitar 15 tahun (Lin and Lu, 1997). Untuk
membantu penelitian dan pengembangan obat-obatan dengan waktu dan biaya yang efisien, saat ini berkembang metode baru yang melibatkan studi kimia komputasi sebagai langkah awal untuk melakukan skrining terhadap senyawa tertentu. Pengembangan senyawa obat baru dapat dilakukan dengan metode komputasi yaitu molecular docking. Molecular docking
adalah metode untuk memprediksi aktivitas struktur senyawa atau ligan
2007). AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi untuk penambatan molekuler yang bersifat non komersial. Aplikasi ini banyak digunakan (Rizvi et al, 2013) dan sangat bermanfaat dalam memprediksi ikatan antara
ligan dan suatu target biomakromolekuler (Morris et al, 2012).
Indonesia sebagai negara tropis diketahui memiliki keragaman hayati yang sangat tinggi, termasuk keragaman tanaman obat herbal. Menurut Badan POM RI tahun 2010, terdapat 1.000 jenis tanaman dinyatakan dapat digunakan sebagai tanaman obat, dimana baru 350 spesies yang telah banyak digunakan di kalangan masyarakat dan industri sebagai bahan baku obat, sehingga perlu dilakukan pengkajian lebih lanjut terhadap tanaman obat yang ada di Indonesia. Dengan melakukan penelitian bahan alam, dapat menambah keyakinan kita akan kekuasaan-Nya agar bisa memanfaatkan segala kenikmatan yang dilimpahkan Allah SWT di dunia ini.
Al-Qur’an menjelaskan dalam Surat Al-Insan ayat 17 yang berbunyi:
Artinya:“Di dalam surga itu mereka diberi minum segelas (minuman) yang
campurannya adalah jahe.” (Q.S Al-Insan: 17)
Nabi Muhammad SAW bersabda:
Artinya: “Tidaklah Allah menurunkan suatu penyakit, melainkan Dia
Dari ayat dan hadits tersebut di atas membuktikan bahwa betapa Maha Pengasih dan Maha Besar Allah SWT telah memberikan obat atas segala macam penyakit. Dan sudah seharusnya kita bersyukur atas rahmat dan karunia yang diberikan oleh Allah SWT. Oleh karena itu, akan dilakukan penelitian dan pengembangan obat dari tanaman obat Indonesia yaitu minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai anti-emetik. Penelitian
ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dari minyak atsiri Jahe (Zingiber
officinale) dengan menggunakan metode penambatan molekul (molecular
docking). Hasil penelitian ini akan dinyatakan dalam skor penambatan dan
visualisasi bentuk ikatan ligan dan reseptor pada uji in silico dengan
menggunakan aplikasi DS Visualizer, MMV (Molegro Molecular Viewer),
VMD (Visual Molecular Dynamics), AutoDock dan Pymol dan juga akan
diperoleh hasil dari uji in vitro berupa peak yang menggambarkan frekuensi
B. Rumusan Masalah
1. Apakah komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe (Zingiber officinale)?
2. Berapakah skor docking senyawa komponen utama dalam minyak atsiri
jahe apabila dibandingkan dengan beberapa ligan yang dapat bertindak sebagai antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3?
C. Keaslian Penelitian
Secara in vitro sebuah penelitian menggunakan intestine hewan uji
tikus (150 - 200 g) meneliti efektivitas dari Jahe (Zingiber officinale)
sebagai antispasmodic pada uji in vitro. Efek kontraksi dosis rendah jahe
pada eksogen asetilkolin (ACh) induksi spasmogenik dengan dosis 0.2 ml = 20 µg jahe / organbath menghasilkan peningkatan pada magnitude dari
induksi asetilkolin dari 0.91 ke 1.17, sedangkan dosis 0.4 ml = 40 µg jahe /
organbath menghasilkan penurunan pada magnitude dari induksi kontraksi
dari 0.61 ke 0.45 (Yassin et al, 2012). Dalam penelitian lain menemukan
bahwa jahe merupakan obat herbal yang menjanjikan sebagai antiemetik (Ernst* and Pittler, 2000). Sebuah penelitian lain juga meneliti tentang
pengaruh pemberian ekstrak jahe merah (Zingiber officinale roscoe varr
Rubrum) terhadap kadar glukosa darah puasa dan postprandial pada tikus
D. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe dengan metode GC-MS
2. Membandingkan skor docking senyawa komponen utama dalam minyak
atsiri jahe dengan skor docking beberapa antagonis reseptor asetilkolin
3. Mempelajari pengaruh minyak atsiri jahe terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi akibat induksi agonis reseptor asetilkolin
E. Manfaat Penelitian
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA A. Mual dan Muntah
1. Definisi
Mual adalah kecenderungan untuk muntah atau sebagai perasaan di tenggorokan atau daerah epigastrium yang memperingatkan seorang individu bahwa muntah akan segera terjadi. Mual sering disertai dengan peningkatan aktivitas sistem saraf parasimpatis termasuk diaphoresis, air liur, bradikardia, pucat dan penurunan tingkat pernapasan. Muntah didefinisikan sebagai ejeksi atau pengeluaran isi lambung melalui mulut, seringkali membutuhkan dorongan yang kuat (Dipiro et al., 2015).
2. Epidemiologi
Prevalensi mual dan muntah akibat kemoterapi tetap tinggi dan mempengaruhi kehidupan sehari-hari pasien di Italy, khususnya mual-muntah pada fase lambat (Ballatori et al, 2007). Rhodes dan Mc. Daniel
(2001), menyebutkan bahwa mual dan muntah masih terus menjadi hal yang paling menimbulkan stress diantara efek samping kemoterapi, meskipun perkembangan agen antiemetik saat ini lebih efektif.
3. Faktor-faktor Predisposisi
Mual dan muntah biasanya merupakan gejala yang bisa disebabkan oleh banyak hal. Kondisi ini adalah cara tubuh untuk membuang materi yang mungkin berbahaya dari dalam tubuh. Obat-obatan tertentu seperti kemoterapi untuk kanker dan agen anestesi sering menyebabkan mual muntah. (Porter et al, 2010).
Penyakit gastroenteritis adalah penyebab paling umum yang mengakibatkan terjadinya mual dan muntah. Gastroenteritis adalah infeksi yang disebabkan oleh bakteri atau virus di perut. Selain menyebabkan mual dan muntah, gastroenteritis biasanya juga menyebabkan diare (Porter
et al, 2010).
4. Terapi Farmakologis
B. Reseptor Acetyl-Choline (ACh)
Asetilkolin merupakan neurotransmiter utama saraf parasimpatis yang mengatur saluran pernapasan. Asetilkolin juga banyak dilepaskan oleh sel non-neuron, seperti sel epitel bronkus dan sel inflamasi (Wessler dan Kirkpatrick, 2001). Sistem pernapasan diatur oleh saraf parasimpatis. Semua aktivitas rangsangan saraf berawal dari aktivasi reseptor muskarinik yang terletak pada otot polos saluran pernapasan, saluran cerna, kelenjar submukosa, pembuluh darah dan sel saraf (Mak dan Barnes, 1990). Asetilkolin bertanggungjawab terhadap kontraksi otot polos, bronkokontriksi dan sekresi mukus. Pelepasan asetilkolin dari ujung saraf parasimpatis diatur oleh reseptor M2 (muscarinic
auto receptor) yang berada pada membrane sel saraf. Asetilkolin dapat
mengaktivasi reseptor muskarinik dan nikotinik. Efek pelepasan asetilkolin adalah terjadinya hiperaktivitas saluran pernapasan, saluran cerna, kontraksi otot polos, peningkatan sintesis dan sekresi mukus selama reaksi inflamasi, seperti penderita asma dan PPOK (Sonar dan Renz, 2009). Struktur kimia asetilkolin dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Struktur Kimia Asetilkolin
(sumber: Pubchem)
Subtipe yang terdistribusi pada otot polos adalah M2 dan M3 (Ikawati, 2008). Aktivasi reseptor M2 mengakibatkan penghambatan pelepasan asetilkolin dari pasca ganglion saraf parasimpatis, sehingga dapat menurunkan kontraksi otot polos (Barnes, 1989). Efek ini dapat dijelaskan melalui coupling reseptor
subtipe M2 dengan protein G1 yang akan menghambat adenilat siklase dan akan menghambat pelepasan ion kalsium dari retikulum sarkoplasma dengan cara mengaktivasi kanal kalium (Ehlert, 2003). Inaktivasi reseptor M2 akan mengakibatkan peningkatan sekresi asetilkolin dari pasca ganglion saraf parasimpatis yang mengakibatkan kontraksi otot polos (Sonar dan Renz, 2009). Reseptor M3 merupakan reseptor muskarinik yang paling luas distribusinya dalam berbagai organ, terutama pada otot polos dan kelenjar eksokrin. Reseptor ini memperantarai berbagai efek biologis seperti kontraksi bronkus, kontraksi kandung kemih, kontraksi saluran cerna, salivasi dan lakrimasi. Aktivasi reseptor M3 akan mengaktifkan sistem fosfolipase C yang akan memobilisasi kalsium (Ca) sehingga berperan dalam kontraksi otot (Ikawati, 2008).
C. Interaksi Obat dengan Reseptor 1. Obat agonis dan antagonis
harus berikatan dengan satu atau lebih molekul pasangan (coupling
molecule) yang terpisah dengan molekul yang memberikan efek.
Obat antagonis bekerja dengan cara menghambat reseptor berikatan dengan molekul lain. Misalnya, antihistamin bekerja dengan cara menyekat reseptor histamin sehingga tidak dapat berikatan dengan histamin atau agonis serupa yang dapat berikatan dengan reseptor tersebut. Contoh lainnya, penyekat reseptor asetilkolin seperti atropin yang menghambat jalan masuk asetilkolin pada reseptornya. Zat-zat antagonis seperti ini mengurangi efek dari histamin maupun asetilkolin (Katzung et
al., 2000).
2. Hubungan Konsentrasi Obat dengan Respon
Respon terhadap obat pada uji in vitro lebih mudah dan langsung
diamati daripada in vivo. Pada uji in vitro biasanya kenaikan konsentrasi
akan disertai dengan kenaikan respon hingga pada konsentrasi tertentu dihasilkan respon maksimum (Emax). Persamaan hubungan konsentrasi obat dengan respon terlihat pada persamaan 1 sebagai berikut:
� = � + ������ � C
50 … … … .
Semakin besar nilai pD2 berarti afinitas agonis tersebut dengan reseptor juga besar (Katzung, 1989).
Dengan adanya suatu antagonis pada sistem, kurva hubungan konsentrasi agonis dengan respon juga akan berubah. Pada antagonis kompetitif, kurva akan bergeser ke kanan. Sedangkan pada antagonis ireversibel, kurva akan bergeser ke bawah (Emax turun). Untuk menentukan sifat kompetitif dari suatu antagonis dapat digunakan persamaan Schild. Persamaan Schild berupa logaritma rasio EC50 dengan pengaruh antagonis terhadap EC50 tanpa pengaruh antagonis dikurangi dengan satu (sumbu Y) dan logaritma konsentrasi antagonis (sumbu X) diplotkan ke dalam kurva (Schild Plot) dan diperoleh persamaan Schild yang berupa persamaan garis lurus.
��� �� − = log[B] − log �… … … .
Keterangan:
dr : rasio EC50 dengan pengaruh antagonis terhadap EC50 tanpa
pengaruh antagonis [B] : konsentrasi antagonis
KB : konstanta disosiasi ekuilibrum
Persamaan tersebut merupakan suatu persamaan garis lurus dengan Y = log (dr - 1) dan X = log [B]. Sifat kompetitif dari suatu antagonis
dilihat dari intersep pada sumbu Y (pKB). Suatu antagonis dikatakan kompetitif apabila kondisi-kondisi berikut terpenuhi (regersi harus linear
dan slope yang dihasilkan sama). Pada pengambilan data seringkali
yang sama. Dalam hal tersebut nilai yang diamati adalah pA2. Nilai pA2 merupakan nilai yang sama dengan pKB namun bukan nilai KB yang sebenarnya (Kenakin, 1997). Nilai pA2 suatu antagonis kompetitif adalah
mendekati 1 (satu) (Janković et al, 1999).
D. Minyak Atsiri
Minyak atsiri adalah zat berbau yang terkandung dalam tanaman. Minyak ini disebut juga minyak menguap, minyak eteris, minyak esensial karena pada suhu kamar mudah menguap. Istilah esensial dipakai karena minyak atsiri mewakili bau dari tanaman asalnya. Dalam keadaan segar dan murni, minyak atsiri umumnya tidak berwarna. Namun, pada penyimpanan lama minyak atsiri dapat teroksidasi. Untuk mencegahnya, minyak atsiri harus disimpan dalam bejana gelas yang berwarna gelap, diisi penuh, ditutup rapat, serta disimpan di tempat yang kering dan sejuk (Gunawan dan Mulyani, 2004). Indonesia memiliki keragaman hayati yang sangat tinggi, termasuk keragaman tanaman obat yang mengandung golongan senyawa tertentu yang mempunyai efek farmakologis. Terdapat 1.000 jenis tanaman yang dinyatakan dapat digunakan sebagai tanaman obat, dimana baru 350 spesies yang telah banyak digunakan di kalangan masyarakat dan industri sebagai bahan baku obat (POM RI, 2010).
Minyak atsiri dapat bersumber pada setiap bagian tanaman yaitu dari daun, bunga, buah, biji, batang atau kulit dan akar atau rhizome. Berbagai
minyak atsiri. Khususnya di Indonesia telah dikenal sekitar 40 jenis tanaman penghasil minyak atsiri, namun baru sebagian dari jenis tersebut telah digunakan sebagai sumber minyak atsiri secara komersil (Riana, 2012).
Minyak atsiri bersifat mudah menguap karena titik uapnya rendah. Susunan senyawa komponennya kuat mempengaruhi saraf manusia (terutama di hidung) sehingga memberikan efek psikologis tertentu (baunya kuat). Minyak atsiri mempunyai rasa getir (pungent taste), berbau wangi sesuai
dengan bau tanaman penghasilnya dan umumnya larut dalam pelarut organik tetapi tidak larut dalam air (Riana, 2012).
E. Jahe (Zingiber officinale) 1. Uraian Tanaman
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta Sub-Divisi : Angiospermae Kelas : Monocotyledoneae Ordo : Zingiberales Genus : Zingiber Family : Zingiberaceae Species : Zingiber officinale
Gambar 2. Rimpang Jahe (Zingiber officinale)
(Sumber: Paimin, 2008)
Rimpang jahe (Zingiber officinale) seperti yang terlihat pada Gambar 2
mempunyai kegunaan yang cukup beragam, antara lain sebagai rempah, minyak atsiri, pemberi aroma, ataupun sebagai obat (Bartley dan Jacobs, 2000). Secara tradisional, kegunaannya antara lain untuk mengobati penyakit rematik, asma, stroke, sakit gigi, diabetes, sakit otot, tenggorokan, kram, hipertensi, mual, demam dan infeksi (Ali et al, 2008; Wang dan Wang 2005; Tapsell et al.
2006). Berdasarkan bentuk, warna, dan ukuran rimpang, ada 3 jenis jahe yang dikenal, yaitu jahe putih besar/jahe badak, jahe putih kecil atau emprit dan jahe sunti atau jahe merah. Secara umum, ketiga jenis jahe tersebut mengandung pati, minyak atsiri, serat, sejumlah kecil protein, vitamin, mineral, dan enzim proteolitik yang disebut zingibain (Denyer et al. 1994).
2. Kandungan dan Manfaat Jahe (Zingiber officinale)
Beberapa komponen kimia jahe, seperti gingerol, shogaol dan zingerone memberi efek farmakologi dan fisiologi seperti antioksidan, antiinflamasi, analgesik, antikarsinogenik, non-toksik dan non-mutagenik meskipun pada konsentrasi tinggi (Surh et al. 1998; Masuda et al. 1995; Manju
dan Nalini 2005; Stoilova et al. 2007). Minyak dalam ekstrak mengandung
seskuiterpen, terutama zingiberen, monoterpen dan terpen teroksidasi.
F. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS
GC-MS merupakan suatu teknik analisis yang terdiri dari 2 instrumen, yaitu Kromatografi Gas (GC) dan Spektrometer Massa (MS).
Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan fisik berbagai komponen atau campuran yang dipisahkan menggunakan fase gerak yang berupa gas pembawa inert dan fase diam padat (Gas Solid Chromatography/
GSC) atau cairan (Gas Liquid Chromatography/ GLC) pada suatu kolom
kromatografi (Kupiec, 2004). GC mulai dikembangkan dengan teknik yang canggih sejak dirintis oleh Martin dan Synge pada tahun 1952 dan telah digunakan untuk memisahkan campuran sampel yang kompleks yang bersifat mudah menguap (Crawford Scientific, 2015). GC menggunakan gas pembawa
(carrier gas) sebagai fase gerak untuk membawa sampel melewati kolom yang
hingga 4 mm (Crawford Scientific, 2015). Kolom dalam GC berada dalam oven yang digunakan untuk mengatur suhu. Proses pemisahan yang terjadi dalam GC diawali dengan memasukkan sampel dalam instrumen melalui GC inlet kemudian sampel akan diuapkan dan dibawa ke kolom kromatografi oleh gas pembawa. Campuran senyawa dalam sampel selanjutnya akan dipisahkan berdasarkan karakteristik molekul dan interaksinya dengan fase diam yang berada dalam kolom GC (Douglas, 2015). Senyawa yang tidak berinteraksi akan melewati kolom dengan lebih cepat (Douglas, 2015). Waktu yang diperlukan suatu senyawa hasil pemisahan untuk melewati kolom disebut dengan waktu retensi (retention time/Rt) sehingga faktor ini dapat menjadi
pembeda untuk berbagai senyawa hasil pemisahan sampel (Douglas, 2015). Spektrometer Massa (MS) adalah suatu teknik analisis yang digunakan untuk identifikasi suatu elemen yang belum diketahui dan untuk mengetahui struktur molekul (Van Bramer, 1998). Instrumen ini digunakan untuk analisis berbagai macam substansi kimia, trace metals, dan materi biologi [Japan
Electron Optics Laboratory (JEOL), 2006]. MS bekerja dengan membentuk
suatu muatan partikel/ion yang berasal dari substanti kimia yang akan dianalisis yang selanjutnya dilakukan penetapan massa partikel yang telah bermuatan oleh medan magnet (JEOL, 2006). Secara umum komponen instrumen MS meliputi ruang ionisasi, mass analyzer, dan detektor (JEOL,
impact (EI) dan chemical ionization (CI) (Crawford Scientific, 2015).
Komponen selanjutnya adalah mass analyzer (filter). Dalam komponen ini
mengandung medan magnet yang berfungsi untuk memisahkan ion-ion berdasarkan momentum mereka. Komponen ini memisahkan ion muatan positif berdasarkan massa yang bergantung pada penggunaan analisis (Bull, 2008). Ion tersebut dideteksi oleh detektor dan menghasilkan output berupa sinyal yang dapat dibaca. Luaran yang dihasilkan dari analisis ini adalah berupa spektrum yang ditunjukkan berdasarkan nilai massa fragmen (m/z). Semakin tinggi spektrum menunjukkan banyaknya fragmen yang terdeteksi. Detektor ini menghasilkan informasi pada komputer berupa data penampilan visual. Selain itu komputer juga mengatur operasi dari instrumen MS (Bull, 2008).
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (GC-MS) adalah suatu teknik analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan kromatografi gas dengan detektor berupa spektrometer massa.
G. Uji In Silico
1. Molecular Docking
Proses penemuan, pengembangan, dan penelitian obat dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode seperti in vivo, in vitro, dan in silico.
Penelitian dengan metode in silico merupakan salah satu metode secara
komputasi yang menjadi subyek penelitian intensif selama dekade terakhir (Teodore et al, 2001). Penelitian secara in silico ini dapat dilakukan dengan
penambatan molekul atau molecular docking. Penambatan molekuler adalah
molekul ligan dengan protein yang menjadi targetnya pada uji in vitro
(Motiejunas and Wade, 2006).
Tujuan utama penambatan molekuler pada umumnya adalah pemodelan struktural secara akurat dan prediksi aktivitas suatu senyawa secara tepat (Kitchen et al., 2004). Penambatan molekuler juga digunakan untuk
memperoleh nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan afinitas yang paling tinggi (Kroemer, 2007).
Pada dasarnya cara kerja dari beberapa aplikasi tersebut digambarkan pada Gambar 3.
R : Reseptor
A : Ligan yang cocok dengan reseptor B : Ligan yang tidak cocok dengan reseptor
C : Ligan yang cocok dengan reseptor dalam konformasi yang lain
√ : Ikatan ligan cocok dengan reseptor
X : Ikatan ligan tidak cocok dengan reseptor
[image:36.595.151.508.350.479.2]~ : Ikatan ligan tidak begitu sempurna dengan reseptor
Gambar 3. Prinsip Dasar Molecular Docking
Ada banyak aplikasi yang umum digunakan untuk melakukan uji In
Silico dengan metode molecular docking, yaitu PLANTS (Protein-Ligand ANT
System), MVD (Molegro Virtual Docking), dan AutoDock (Korb et al., 2006).
Tahapan dalam melakukan penambatan molekuler secara garis besar terbagi menjadi dua tahapan, yaitu validasi metode docking dan simulasi
docking dengan ligan target. Masing-masing tahap tersebut terdiri dari tahap
preparasi ligan, preparasi reseptor, dan simulasi docking. Reseptor target
docking bisa diunduh dari situs www.pdb.org, situs ini menyediakan berbagai
macam reseptor berikut nativeligandnya.
Penggunaan penambatan molekuler ini dalam aplikasinya digunakan untuk memperoleh nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan afinitas yang paling tinggi (Kroemer, 2007). Prinsip dari penambatan molekuler ini umumnya adalah untuk mengetahui ikatan suatu molekul (ligan) dengan suatu protein (reseptor) sehingga dapat digunakan untuk gambaran secara kasar untuk memprediksi aktivitas suatu molekul (ligan). Aplikasi yang sering digunakan untuk penambatan molekuler salah satunya adalah AutoDockTools.
2. AutoDockTools
AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi untuk penambatan molekuler yang bersifat non-komersial. Aplikasi ini banyak digunakan (Rizvi
et al, 2013) dan sangat bermanfaat dalam memprediksi ikatan antara ligan dan
suatu target biomakromolekuler (Morris et al, 2012). Salah satu keberhasilan
dalam penemuan obat raltegravir sebagai inhibitor HIV integrase (Norgan et
al, 2011).
AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi penambatan molekuler yang menggunakan model kinematik. Hal tersebut berjalan ketika proses docking dimana suatu ligan secara acak mulai proses pencarian untuk
tempat ikatan dan mengeksplorasi untuk mendapatkan nilai translasi, rotasi, serta internal degrees of freedom sehingga akan menghasilkan konformasi
terikat (Teodoro et al, 2001).
AutoDockTools menggunakan metode stochastic Lamarckian
Genetic Algorithm (LGA) untuk mencari konformasi ligan secara komputasi
dan sekaligus meminimalkan fungsi scoring sehingga mendekati stabilitas
secara termodinamik antara ligan dan protein target (Morris et al, 2012). Untuk
eksperimen docking, aplikasi ini dapat memasukkan koordinat ligan dan
makromolekul serta memanfaatkan LGA untuk menghasilkan posisi ligan dan meminimalkan energi ikatan.
AutoDockTools menggunakan energi bebas medan gaya (force
field) secara semi empiris untuk mengevaluasi setiap konformasi selama
simulasi docking berlangsung (Morris et al, 2012). Pada awalnya ligan dan
evaluasi terhadap energi intermolekuler dari ikatan antara ligan dan protein target terhadap konformasi terikatnya (Morris et al, 2012).
Hasil dari AutoDockTools ini adalah berupa skor energi interaksi untuk menentukan konformasi yang baik maupun yang buruk. Skor docking tersebut diestimasikan sebagai harga ΔG atau binding energy yang memiliki
satuan dalam kkal/mol. Konformasi yang baik diketahui dengan melihat hasil
docking yang memiliki energi interaksi yang kecil pada ikatan antara ligan dan
protein target (Morris et al, 2012).
H. Uji In Vitro
Dalam penemuan obat baru dimulai dengan serangkaian penelitian dan salah satunya adalah uji untuk menentukan efek farmakologi pada sel atau yang biasa disebut dengan uji in vitro (Groneberg et al., 2002). Uji ini dapat
dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan yang terisolasi dari hewan. Dalam penelitian, model uji in vitro menggunakan sel atau jaringan memiliki
efikasi dan potensi yang tinggi terhadap target karena dapat menggambarkan sistem biologi yang dituju.
Gambar 4. Alat Organ Terisolasi Sumber:Ugo Basile
Dalam uji in vitro, organ yang biasa digunakan berasal dari otot, arteri,
jaringan uterine atau vas deferens, ileum, kolon, ventrikel, dan diafragma yang
berasal dari hewan seperti tikus, kelinci dan marmut (Panlab, 2013).
Perubahan yang terjadi pada tingkat jaringan atau organ karena pengaruh suatu senyawa kimia dapat dipelajari lebih mendalam dan akurat dengan cara mengisolasi suatu organ atau jaringan dari suatu sistem fisiologis. Organ atau bagian organ yang diisolasi akan mampu tetap bertahan hidup selama beberapa jam di luar tubuh jika organ dikondisikan tetap berada dalam lingkungan fisiologisnya, yaitu dengan cara pemberian cairan fisiologis dalam temperatur yang sesuai, asupan oksigen dan nutrien yang tepat dari luar. Rangsangan fisiologis dan farmakologis terhadap organ terisolasi selanjutnya dapat tercatat dengan menggunakan alat perekam yang tepat (Lullmann et al.,
Kerangka Konsep
Muntah merupakan cara tubuh untuk mengeluarkan zat yang merugikan. Muntah dapat disebabkan karena makan atau menelan zat iritatif atau zat beracun atau makanan yang sudah rusak. Muntah bisa terjadi selama kehamilan, terutama pada minggu-minggu pertama dan pada pagi hari. Banyak obat-obatan, termasuk obat anti kanker dan pereda nyeri golongan opiat seperti morfin, dapat menyebabkan mual dan muntah. Saat ini obat-obatan tradisional banyak digunakan karena menurut beberapa penelitian tidak terlalu menyebabkan efek samping, karena masih bisa dicerna oleh tubuh. Sementara ini banyak orang beranggapan bahwa penggunaan tanaman obat atau obat tradisional relatif lebih aman dibandingkan dengan obat sintesis. Upaya pengembangan senyawa obat bahan alam dari minyak atsiri jahe dilakukan dengan menganalisis kandungan kimia yang terdapat dalam minyak atsiri jahe dengan metode Kromatografi Gas (GC) dan Spektrofotometer Massa (MS), selanjutnya dilakukan uji in silico senyawa marker dari minyak atsiri jahe serta
beberapa senyawa pembanding yang memiliki aktivitas antagonis terhadap reseptor asetilkolin muskarinik 3 (ACh M3). Kemudian dilakukan uji in vitro
Gambar 5. Kerangka Konsep
Minyak Atsiri Jahe
MUAL MUNTAH
ANTIEMETIK
Obat Bahan Alam Obat Sintetis
Uji In Silico Uji In Vitro
Senyawa Marker
Molecular Docking
Organ Terisolasi GC-MS
Hipotesis
Berdasarkan kerangka konsep di atas, dapat dirumuskan hipotesis bahwa: 1. Komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe
yaitu peak yang memiliki luas area paling besar dengan metode GC-MS
2. Senyawa komponen utama dalam minyak atsiri jahe memiliki skor
docking yang paling rendah dengan beberapa ligan yang bertindak sebagai
antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3
1 A. Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian eksploratif (in silico dan GC-MS) dan eksperimental laboratoris (in
vitro) dari minyak atsiri jahe (Zingiber officinale) sebagai anti-emetik.
B. Tempat dan Waktu 1. Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Laboratorium Teknologi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.
2. Waktu
Penelitian dilakukan pada bulan Februari - April 2016.
C. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian
Uji In Vitro
Variabel Bebas : Kadar minyak atsiri
Variabel Tergantung : Frekuensi kontraksi dan relaksasi dari organ terisolasi
Variabel Terkendali : Organbath, buffer Tyrode, Aplikasi
b. Skor Penambatan adalah nilai ikatan energi suatu senyawa terhadap proteinnya yang semakin minimum nilainya dianggap semakin baik dan memiliki afinitas yang lebih tinggi.
c. Kontraksi adalah keadaan dimana otot mengalami penegangan dan relaksasi adalah keadaan dimana otot kembali tenang.
D. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan untuk uji GC-MS pada penelitian ini adalah GCMS-QP2010S SHIMADZU. Alat yang digunakan untuk uji in silico
adalah seperangkat Personal Computer (PC/Laptop) SAMSUNG RV409
yang dilengkapi dengan perangkat lunak seperti sistem operasi dan aplikasi pendukung. Sistem operasi yang digunakan adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit dan Windows 8 Pro 64-bit, dan aplikasi pendukung yang digunakan adalah Microsoft Office 2013, ChemDraw 2010,
AutoDockTools 4.2, DS Visualizer, Molegro Molecular Viewer, dan
MarvinSketch. Alat yang digunakan untuk uji in vitro adalah 4400-Four
-Chamber IsolatedOrganbath, aplikasi iWorxLabScribe2 Data Recording
pembawa Helium. Bahan yang digunakan untuk uji in silico adalah protein
asetilkolin dalam bentuk berkas (file) dengan kode protein 4DAJ yang
diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org), native ligand
dari reseptor asetilkolin muskarinik3 (Tiotropium), senyawa marker
minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale), dan senyawa dari Atropin dalam
bentuk berkas (file) untuk pembanding. Bahan yang digunakan untuk uji
in vitro adalah marmut (Cavia cobaya), otot polos ileum marmut terisolasi,
larutan fisiologis buffer Tyrode (NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, CaCl2.2H2O,
NaH2PO4.2H2O, NaHCO3) grade p.a (pro analys) yang diperoleh dari
pabrik Merck Germany supplier CV. General Labora Yogyakarta,
glukosa, aquadest, Dimetil Sulfoksida (DMSO), gas karbogen (95% O2 dan 5% CO2), minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale), asetilkolin, dan obat
pembanding Atropine Sulfate.
E. Cara Kerja
1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS
Analisis ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan senyawa-senyawa yang ada dalam minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai
sebesar 70 eV dengan metode electron impact (EI).
Sampel uji mula-mula dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (methanol/etilasetat/n-heksan) secukupnya hingga diperoleh konsentrasi 1%. Selanjutnya 1 µl sampel tersebut diinjeksikan ke dalam instrumen GC. Hasilnya akan diamati melalui spektrum yang diinterpretasikan berdasarkan berat molekul dan waktu retensi (Rt) dari minyak atsiri jahe.
2. Uji In Silico
a. Instalasi Sistem Operasi Linux dan Aplikasi Pendukung
Instalasi sistem operasi Linux dilakukan karena aplikasi yang dibutuhkan untuk melakukan penambatan molekul pada umumnya hanya dapat dioperasikan pada Linux. Sistem operasi yang diinstall
adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit. Setelah instalasi Linux,
dilakukan instalasi aplikasi pendukung seperti Marvin Sketch untuk
preparasi ligan yang akan diuji, AutoDockTools 4.2 untuk melakukan penambatan molekul, Molegro Molecular Viewer untuk preparasi
protein dan visualisasi hasil penambatan (docking) dalam bentuk
virtual 2D dan DS Visualizer untuk preparasi protein dan visualisasi
MarvinSketch pada sistem operasi Linux.
c. Penyiapan Protein Target dalam Format PDBQT
Protein yang akan digunakan sebagai reseptor uji diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org) dalam format “.pdb”.
Berkas protein/reseptor yang digunakan dalam penelitian ini adalah asetilkolin dengan kode protein yaitu 4DAJ. Setelah protein diunduh lalu dilakukan preparasi protein target dalam format PDBQT. Hal ini berfungsi untuk mempersiapkan kebutuhan docking yang meliputi
ligan dan protein target. Hasil preparasi protein dilakukan preparasi lebih lanjut dengan aplikasi AutoDockTools dengan menambahkan atom hidrogen polar yang berfungsi untuk memberikan muatan parsial
(partial charges) dalam protein target tersebut. Selain itu target
protein perlu ditambahkan muatan melalui pilihan Kollman Charges
dan disimpan dalam format *.pdbqt.
d. Preparasi Ligan dalam Format PDBQT
Ligan yang digunakan dalam uji ini adalah senyawa marker
dari minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) yang akan diteliti sebagai
antiemetik. Struktur ligan didesain melalui aplikasi ChemDraw dan
dipilih dalam bentuk 3D SDF. File ligan tersebut dibuka melalui
kemudian dilakukan preparasi dalam hal Torsion Free dan Aromatic
Carbons dan disimpan dalam format *.pdbqt.
e. Preparasi Grid Parameter File
Proses ini merupakan proses lanjutan dari langkah sebelumnya. Aplikasi AutoDockTools yang masih terbuka kemudian dipilih bagian Grid dan dipilih ligan melalui fungsi Set Map Types dan
dilanjutkan penyiapan Grid Box. Grid Box merupakan penentuan area
untuk simulasi docking. Kemudian hasil grid disimpan dalam format
grid parameter file (*.gpf).
f. Preparasi Docking Parameter File
Proses ini diawali dengan memilih protein target dan ligan melalui pilihan docking pada aplikasi AutoDockTools. Proses docking
dapat dilakukan pengaturan melalui perintah Search Parameters dan
Docking Parameters. Selanjutnya pada bagian output dipilih
Lamarckian Genetic Algorithm dan disimpan dalam format docking
parameter file (*.dpf).
g. Simulasi Docking
Proses docking dilakukan dengan menggunakan AutoGrid 4.2
dan AutoDock 4.2 melalui Cygwin Terminal. File hasil preparasi
format *.dlg yang berisi informasi 10 konformasi dan file
complex.pdb untuk kebutuhan visualisasi hasil.
h. Validasi Molecular Docking
Validasi molecular docking bertujuan untuk menentukan
apakah protein yang digunakan untuk molecular docking-nya dapat
digunakan atau tidak. Validasi molecular docking ini dilakukan
dengan cara menentukan nilai RMSD. Nilai RMSD yang dikatakan valid adalah <2.00 Å.
3. Uji In Vitro pada Organ Terisolasi a. Penyiapan Larutan Buffer Tyrode
Larutan buffer Tyrode dibuat berdasarkan formula A dan B
(Vogel, 2002). Komposisi larutan dapat dilihat dalam tabel 1 berikut. Bahan-bahan pada tabel larutan A masing-masing ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar, dan dilarutkan dengan akuades hingga volume 1L. Bahan pada tabel larutan B ditimbang, kemudian dimasukkan ke labu takar, dan dilarutkan dengan akuades hingga volume 1L. Untuk membuat larutan buffer Tyrode, dibuat
MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O
2,14 g/L 2,64 g/L 0,65 g/L
b. Penyiapan Larutan Minyak Atsiri Jahe 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million)
Penelitian ini menggunakan minyak atsiri jahe sebagai senyawa uji. Larutan minyak atsiri jahe dibuat dalam konsentrasi 1% dalam pelarut DMSO. Sebagai senyawa uji, larutan jahe diberikan dalam dosis 1 ppm dan 1,25 ppm dan dimasukkan ke dalam organbath
yang berisi 20,0 mL larutan buffer Tyrode.
c. Pembuatan Larutan Asetilkolin Bromida
Larutan asetilkolin dibuat sebagai larutan stok asetilkolin konsentrasi 2 x 10-1 M dalam akuades. Asetilkolin memiliki bobot molekul sebesar 240,1 g/mol. Pengenceran larutan stok asetilkolin dilakukan dengan cara pengenceran bertingkat dari larutan stok asetilkolin 2 x 10-1 M sehingga diperoleh larutan asetilkolin konsentrasi (2 x 10-2; 2 x 10-3; 2 x 10-4; dan 2 x 10-5) M.
d. Pembuatan Larutan Atropin 10-6 (1 µM)
Larutan atropin (BM: 255,35) dibuat pada konsentrasi 2 x 10 -2 M. Sebanyak 25,5 mg serbuk atropin ditimbang menggunakan
[image:51.595.182.513.136.237.2]didapatkan dengan mengambil larutan atropin 2 x 10 M sebanyak 100 µL kemudian dimasukkan ke dalam organbath yang berisi 20 mL
larutan buffer Tyrode.
e. Preparasi Organ Ileum
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah menggunakan hewan uji marmut (Cavia cobaya). Selanjutnya marmut
dikorbankan dengan cara dislokasi tulang belakang kepala (cervix)
dan dilakukan pembedahan. Kemudian diambil bagian ileum dari marmut tersebut. Ileum yang telah diambil diletakkan ke dalam cawan fiksasi yang diisi larutan buffer Tyrode, kemudian dibersihkan.
Setelah itu dibersihkan juga dari jaringan-jaringan lain yang masih menempel (jaringan lemak). Lalu pada ileum ini selanjutnya diikat dengan benang. Ujung benang bagian bawah diikatkan pada bagian tuas organbath dan ujung bagian atas diikatkan pada bagian yang
terhubung dengan transduser. Organbath sebelumnya telah
dikondisikan sehingga suhunya mencapai 37°C.
f. Uji Aktivitas Minyak Atsiri Jahe Terhadap Agonis Reseptor Fisiologis
Uji aktivitas minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) terhadap
dan dilakukan ekuilibrasi sampai diperoleh kondisi stabil (30 menit). Selanjutnya, dilakukan pemberian agonis ke dalam organbath dan
respon kontraksi yang terjadi akan tercatat pada rekorder. Pemberian agonis dilakukan sampai dicapai kontraksi maksimum (100%). Pengukuran kontraksi dilakukan dua kali, dimana antara pengukuran pertama dan kedua dilakukan pencucian organ selama 30 menit dengan penggantian larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Pada
kontraksi kedua, setelah dilakukan pencucian organ dan kondisi organ telah stabil, selanjutnya dilakukan pemberian minyak atsiri Jahe
(Zingiber officinale) dosis 1 ppm dan 1,25 ppm. Selanjutnya,
diberikan agonis ke dalam organ bath dengan konsentrasi bertingkat
organbath (ml) log 10) (M) 0,100 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 2.10-8 2.10-8 2.10-7 2.10-7 2.10-6 2.10-6 2.10-5 2.10-5 2.10-4 2.10-4 2.10-3 2.10-3 2.10-2 2.10-2 10-10 3.10-10 10-9 3.10-9 10-8 3.10-8 10-7 3.10-7 10-6 3.10-6 10-5 3.10-5 10-4 3.10-4
g. Uji Reversibilitas
Uji reversibilitas dilakukan untuk melihat kemampuan organ untuk kembali pada kondisi semula, atau pada kondisi sebelum dilakukannya pengenalan agonis reseptor. Uji reversibilitas ini dilakukan pada setiap uji aktivitas agonis reseptor (histamin, asetilkolin, ß2-adrenergik dan serotonin). Uji reversibilitas terhadap ileum dilakukan setelah kontraksi dan pencucian organ akibat pemberian agonis dan minyak atsiri. Ileum dicuci selama 30 menit dengan penggantian larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Setelah
[image:54.595.177.512.136.415.2]h. Uji Pelarut Dimetil Sulfoksida (DMSO)
Uji pengaruh DMSO dilakukan setelah pengenalan agonis reseptor asetilkolin. Sebelumnya, organ yang telah dicuci selama 30 menit dengan pengganti larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Jumlah
Uji In Vitro
Organ Terisolasi
Uji Senyawa Marker
Terhadap Reseptor
Uji Pelarut
Uji Reversibilitas
[image:56.595.121.510.152.361.2]Analisis Data
Gambar 2. Skema Langkah Kerja Uji In Vitro Instalasi Operasi Linux
Aplikasi Pendukung Ligan uji
Protein Target
AutoDockTools
MarvinSketch DS Visualizer
Molegro Molecular Viewer
Molecular Docking
[image:56.595.121.479.410.658.2]Analisis Data
Gambar 1.Skema Langkah Kerja Uji In Silico dan GC-MS
(Zingiber officinale) yang telah terbukti memiliki aktivitas pada reseptor
asetilkolin dilakukan dengan cara melihat spektrum hasil pemisahan instrumen GC yang berupa peak berdasarkan nilai waktu retensi (Rt).
Selanjutnya dalam output MS, peak masing-masing nilai waktu retensi
(Rt) yang muncul diinterpretasikan berdasarkan nilai m/z senyawa-senyawa yang diperoleh.
2. Uji Molecular Docking dengan AutoDockTools 4.2
Hasil uji molecular docking menggunakan aplikasi AutoDockTools
4.2 diperoleh data file dengan format *.dlg dan file complex.pdb. File
dengan format *.dlg dibuka melalui aplikasi AutoDockTools 4.2 dan berisi 10 konformasi ikatan antara ligan dan protein target. Dari 10 konformasi yang terbentuk pada kompleks ikatan ligan dan protein, selanjutnya semua kompleks dihapus kecuali kompleks yang diketahui memiliki hasil yang terbaik. Dari hasil tersebut kemudian dipilih 1 konformasi yang memiliki energi ikatan yang paling rendah untuk kemudian dianalisa interaksinya.
Uji molecular docking ini dilakukan pada senyawa marker dari minyak
atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai antiemetik pada reseptor
asetilkolin. Analisis dilakukan dengan membandingkan energi ikatan
Untuk validasi hasil docking digunakan aplikasi AutoDock Vina. Hasil
docking dinyatakan valid apabila menghasilkan nilai RMSD <2.00 Å.
3. Uji In Vitro Ileum Organ Terisolasi
Data yang diperoleh dalam penelitian in vitro berupa data kontraksi
atau relaksasi ileum pada rekorder. Data tersebut diubah menjadi data persentase (%) respon terhadap respon maksimum yang dicapai oleh agonis. Selanjutnya, data % respon dibuat kurva hubungan antara logaritma konsentrasi antagonis terhadap % respon.
Nilai EC50 (konsentrasi agonis yang dapat menghasilkan respon sebesar 50% dari respon maksimum) agonis reseptor, dengan atau tanpa pengaruh minyak atsiri jahe dihitung berdasarkan kurva hubungan konsentrasi terhadap % respon/ EC50 dihitung berdasarkan persamaan 3. Nilai EC50 ini selanjutnya ditransformasi ke dalam bentuk pD2, dimana pD2 adalah nilai dari - log EC50 (persamaan 4) dan selanjutnya data disajikan dalam bentuk tabel kelompok perlakuan agonis (dengan atau tanpa pengaruh minyak atsiri jahe) dan nilai rata-rata pD2 agonis ±
Standard Error (pD2 ± SE). Pergeseran nilai pD2 dianalisis secara statistik
16 X1 : Log. konsentrasi dengan respon tepat di bawah 50%
X2 : Log. konsentrasi dengan respon tepat di atas 50% Y1 : % respon tepat di bawah 50%
Y2 : % respon tepat di atas 50%
pD = −Log. ��50… … … …
4. Analisis Statistika Minyak Atsiri Jahe sebagai Antagonis Reseptor Asetilkolin
Minyak atsiri jahe ditetapkan sebagai antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3 apabila inkubasi otot polos ileum marmut terisolasi dengan minyak atsiri jahe mengakibatkan penurunan nilai pD2 asetilkolin. Semua data pD2 asetilkolin terdistribusi normal dan memiliki varian yang homogen (p > 0,05). Distribusi data pD2 asetilkolin dianalisis dengan menggunakan uji normalitas (metode Kolmogorov-Smirnov). Penurunan nilai pD2 selanjutnya dianalisis dengan metode statistik parametric, yaitu menggunakan uji One Way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji LSD
1 A. Hasil Penelitian
1. Analisis Kandungan Kimia GC-MS
Analisis kandungan kimia metode GC-MS dilakukan untuk identifikasi senyawa yang terdapat pada minyak atsiri Jahe (Zingiber
officinale) karena terbukti sebagai anti-emetik. Fase diam yang digunakan
adalah AGILENT HP 5MS dengan panjang kolom 30 meter dan diameter internal 0,25 mm. Sedangkan fase gerak yag digunakan adalah Helium dengan kecepatan alir 0,53 mL/menit. Dalam instrumen MS digunakan metode pengion electron impact dengan energi 70 Ev. Hasil pengujian
[image:60.595.112.513.479.643.2]GC-MS minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) dinyatakan dalam kromatogram
Gambar 8 dan kandungan senyawa dapat dilihat pada Tabel 3.
1 12.929 2870044
α-Pinene
2 13.756 13400520 Camphene
3 15.803 1237383 5-Hepten-2-One
4 16.004 1923625 ß-Myrcene
5 17.836 3132269
Limonene
6 17.938 3220556 1,8-Cineole
7 21.219 1312800
α-Terpinolene
8 24.103 2320000
[image:61.595.115.516.136.745.2]10 27.147 5828598 2,6-Octadienal
11 27.706 7200878 trans-Geraniol
12 28.320 8682446
2,6-Octadienal
13 35.881 16685386
α-Curcumene
14 36.317 25358805 Zingiberene
15 36.450 1805857
α-Amorphene
16 36.602 6893275
α-Farnesene
17 36.699 7845261
1-methyl-4-(5- methyl-1-
methylene-4-hexenyl)
18 37.238 16042618
yaitu sebesar 25358805 terdapat pada nomor peak 14 yaitu senyawa
Zingiberene dengan waktu retensi (menit) 36.317. Zingiberene adalah
senyawa paling utama dalam minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale).
2. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDock
Penambatan molekul (molecular docking) merupakan penelitian
dengan metode komputasi yang bertujuan untuk mendeteksi interaksi suatu ligan dengan suatu reseptor. Hasil dari penambatan molekul ini adalah berupa skor penambatan dan hasil visualisasi secara virtual 3D. Skor
penambatan yang dianggap baik adalah skor yang nilainya lebih kecil, karena menggambarkan senyawa yang diuji secara penambatan molekul tersebut akan melekat dengan sangat baik dengan reseptornya dan tidak membutuhkan banyak energi untuk berikatan. Setelah didapatkan skor penambatan yang baik, dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi VMD (Visual Molecular Dynamics). Aplikasi VMD akan menunjukkan
bentuk ikatan dari suatu senyawa dengan reseptornya secara 3D. Aplikasi VMD juga dapat digunakan untuk mendeteksi bentuk ikatan dan jarak dari struktur yang diuji dengan reseptornya.
a. Proses Pemilihan Reseptor Target
Sebelum dilakukan uji penambatan molekul pada senyawa marker
reseptor 4DAJ yang tersaji pada Gambar 9.
Kode
Protein Native Ligand Struktur Reseptor
Struktur Native Ligand
[image:64.595.151.512.194.362.2]4DAJ Tiotropium C19 H22 N O4 S2
Gambar 2. Kode dan Struktur Reseptor Asetilkolin
Native ligand yang terdapat pada reseptor asetilkolin muskarinik
(ACh M3) adalah tiotropium. Senyawa ini merupakan golongan antagonis kolinergik yang memiliki inti tropan.
b. Preparasi Protein dan Ligan Asli (Native Ligand)
Setelah berkas protein diunduh, dilakukan preparasi berkas protein dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer. Tahap ini merupakan tahap
Gambar 3. (A). Preparasi Protein (B). Ligan 0HK 2D
Senyawa ligan asli diambil dari berkas protein dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer dengan cara menghapus seluruh komponen protein
dan menyisakan senyawa ligan aslinya. Senyawa ligan asli disimpan dengan format “ligan.pdb”. Senyawa ligan asli berfungsi sebagai pembanding untuk senyawa uji maupun senyawa pembanding kontrol positif.
c. Preparasi Ligan Uji
Preparasi ligan uji dilakukan dengan cara menggambarkan struktur ligan (senyawa marker) yang akan diuji dengan menggunakan aplikasi
MarvinSketch. Ligan uji yang digunakan dalam uji molecular docking ini
adalah senyawa minyak atsiri Zingiberene yang dapat ditemukan pada
rimpang jahe (Zingiber officinale). Senyawa minyak atsiri Zingiberene ini
AutoDock. AutoDock adalah program docking non-komersial yang sangat
baik dan banyak digunakan untuk melakukan penambatan molekuler. AutoDock merupakan sebuah aplikasi yang digunakan untuk menentukan target atau sasaran dari protein yang akan diuji. AutoDock juga digunakan untuk melihat skor ikatan (binding energy score) dari senyawa yang diuji
terhadap reseptor target.
Pada aplikasi AutoDock, berkas “target.pdb” yang sudah dipreparasi dimasukkan dan pada menu Edit dan klik submenu Delete Water untuk menghapus air pada berkas “target.pdb”. Kemudian Edit lagi dan klik submenu Hydrogen untuk menambahkan atom hydrogen pada residu protein (Lampiran 5).
Preparasi parameter grid dilakukan untuk membatasi ruang gerak
dari ligan yang akan diuji. Ruang grid yang digunakan sebesar 1 Å dan
untuk membatasi agar ligan tidak keluar dari posisi ligan aslinya maka digunakan besar dimensi dari x, y dan z masing-masing dimensi sebesar 40 (Lampiran 6).
e. Visualisasi Hasil Validasi dan Molecular Docking
Setelah didapatkan skor penambatan, kemudian akan dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer. DS Visualizer
dioperasikan dalam sistem operasi Windows dan Linux.
Dari hasil visualisasi menggunakan aplikasi DS Visualizer, skor
docking ligan asli dari reseptor Asetilkolin Muskarinik (ACh M3) yg paling
baik yaitu sebesar -9,1 dengan nilai RMSD 0,913 (<2.00Å) yang terletak pada konformasi ke 2. Pada hasil visualisasi menunjukkan bahwa ligan asli mengikat pada beberapa residu dari protein target (Gambar 11) yaitu
tyrosine ke 529 (TYR529), aspartic acid ke 147 (ASP147), tyrosine ke 148
(TYR148), valine ke 155 (VAL155), alanine ke 238 (ALA238), alanine ke
[image:67.595.155.511.446.664.2]235 (ALA235), asparagine ke 507 (ASN507).
reseptor ACh M3, sehingga penelitian ini ditujukan untuk mengamati pengaruh minyak atsiri jahe dosis 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million)
terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi oleh asetilkolin. Minyak atsiri jahe dilarutkan dalam dimetil sufoksida (DMSO), sehingga penelitian ini memerlukan uji pelarut untuk menjamin bahwa pengaruh minyak atsiri jahe terhadap kontraksi otot polos ileum hanya disebabkan oleh minyak atsiri jahe saja. Sebagai uji pendahuluan dilakukan uji pengaruh DMSO terhadap kontraksi otot polos ileum yang diinduksi oleh asetilkolin. Jumlah DMSO yang digunakan adalah sebanyak 100 µL yang disesuaikan dengan volume maksimal pemberian minyak atsiri jahe ke dalam organbath. Pengaruh DMSO terhadap otot
polos ileum yang diinduksi oleh asetilkolin dan berikut pergeseran nilai pD2 tersaji pada Gambar 12.
Gambar 5. Pengaruh DMSO terhadap respon kontraksi otot polos ileum yang diinduksi asetilkolin. Kurva hubungan konsentrasi asetilkolin terhadap respon kontraksi otot polos ileum, dengan atau tanpa pengaruh DMSO 100 µL (n=6, rata-rata ± SEM)
Tabel 2. Nilai rata-rata pD2 asetilkolin karena pengaruh DMSO 100
µL (n=6, rata-rata ± SEM). Berdasarkan uji signifikansi dengan
One Way ANOVA, dilanjutkan dengan uji LSD pada taraf
kepercayaan 95%, tidak menunjukkan adanya perbedaan bermakna (p>0.05) antara pD2 kontrol dan DMSO.
No Kelompok Perlakuan pD2 Emaks (%)
1 Kontrol Asetilkolin 4,22 ± 0,41 100 ± 0,00
2 DMSO 100 µL 4,28 ± 0,45 100 ± 0,00
b. Pengaruh Minyak Atsiri Jahe terhadap Reseptor Asetilkolin Kontraksi Otot Polos Ileum
organbath sebesar 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million). Minyak atsiri
jahe diberikan 5 menit sebelum pemberian seri kadar asetilkolin (10-8 - 10 -2 M). Data yang diperoleh dari uji ini adalah kurva hubun
