Kloning Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Patogenisitas Xanthonzonas axonopodispv. glycines

KLONING GEN YANG TERLIBAT

DALAM

MEKANISME PATOGENISITAS

~ a n t h o m o n a s

axonopodis

pv.

glycines

oleh

ALINA AKHDIYA RUSMANA

9 7 2 6 6 / B I O

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

KLONING GEN YANG TERlLIBAT DALAM

MEKANISME PATOGENISITAS

Xanthomonas axonopodis

pv.

glycines

oleh

ALINA AKHDIYA RUSMANA

972660310

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains

pada

Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul : Kloning Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Patogenisitas Xanthonzonas axonopodispv. glycines

Nama : Alina Akhdiya Rusmaua

Nomor Pokok : 97266

Program Studi : Biologi

Menyetujni

1. Kon~isi pembimbing

Dr. Ir. Antonius Suwanto. M.Sc. Ketua

,,.' ," /

_.'

,I,'

.,.'

..'

2. Ketua Program Studi Biologi gram Pascasarjana

Dr. Ir. Dede Setiadi, MS.

ABSTRACT

Cloning of Gene Involved in Pathogenicity Mechanism of

Xantlioinonas monopodis

pv.

glycines

ALINA A. RUSMANA

Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of advisor), BUD1 TJAHJONO and MAGGY T. SUHARTONO (Coadvisor)

Phytopathogenic mechanism of Xarrtltoinonas axo~topodis pv.

glycincs (Xag) is complex and not really well understood. The objective of this work is to clone and identify pathogenicity genes of the bacterium as one approach to understand the mechanism. We have localized the putative pathogenicity gene from a non-pathogenic mutant of Xag M715. Southern hybridization analysis using 2.8 kb EcoRI from pYR103 as probe showed that the gene involved in pathogenicity is located within 2.0 kb PstI fragment. A 0.7 kb DNA fragment has been amplified using inverse PCR technique, and inserted into p ~ ~ M @ ' - ~ easy vector to produce a 3.7 kb recombinant plasmid (pAAO1). Southern hybridization analysis of the wild type (YR32) with pAAOl as a probe indicated a signal located at _k 3.0 kb PstI fragment. DNA sequence analysis indicated that the DNA fiagment has a 64% identity in 75 nucleotides overlap to a vir gene of Bacillzrs anthrcis.

RINGKASAN

ALINA AKHDNA RUSMANA. Boning gen yang dalam mekanisme

patogenisitas Xantltoi~zonns monoportis pv. glycines. Dibawab bimbingan

ANTONIUS SUWANTO (ketua komisi pembimbing), BUD1 TJAHJONO,

dan MAGGY T. SUHARTONO (anggota komisi pembimbing).

Xanthomonas monopodis pv. glycines (Xag) mempakan bakteri penyebab

penyakit bisul pada tanaman kedelai. Penyakit ini sangat memgikan dan diduga

terdapat selumh wilayah penanaman kedelai di dunia termasuk Indonesia.

Mekanisme patogenisitas Xanthomonas axonopodis pv. glycines sangat

kompleks dan belum banyak dipahami. Berdasarkan data yang diperoleh dari

penelitian yang dilakukan Daniels (1988) dengan teknik mutasi, diperkirakan

terdapat 20 sampai 100 gen yang terlibat dalam mekanisme fitopatogenitas

Xmthomonas. Oleh karena itu walaupun berbagai penelitian telah dilakukan

untuk mengetahui patogenitas Xag, namun masih banyak informasi yang

dibutuhkan untuk menerangkan mekanismenya (Rukayadi, 1998).

Xanthomonas axonopodis pv. glycines M715 mempakan salah satu mutan

yang menarik untuk diteliti lebih lanjut karena bersifat nonpatogenik dan HR-

pada daun tomat (Rukayadi, 1998). Mutan ini mempakan hasil mutasi transposisi

Xag YR32 menggunakan pYR103 ( p ~ ~ m i n i - ~ n 5 ~ m R - ~ p R ) .

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengklon dan mengidentifikasi

gen yang terlibat dalarn mekanisme patogenisitas Xag sebagai salah satu cara

untuk mempelajari mekanismenya. Tahapan penelitian terdiii dari Lokalisasi

DNA pengapit, kloning, dan sekuensing DNA pengapit transposon.

Lokalisasi DNA pengapit transposon dilakukan dengan teknik hibridisasi

Southern menggunakan pelacak fragmen 2,8 kb EcoRI pYR103 yang membawa

gen resistensi kanamisin dan sebagian gen resistensi trimetoprim. Dari hasil

.

. analisa hibridisasi Southern DNA genom Xag M715 yang di-digest sempuma

dengan enzim PstI dengan menggunakan fragmen pYR103 tersebut sebagai

pelacak, diperoleh fragmen DNA bemkuran 2,O kb yang membawa DNA pengapit

PstI, maka di duga ada 2 fragmen DNA berukuran hampir sama (5 2,O kb) yang

masing-masing membawa salah satu sisi DNA pengapit.

Arnplifikasi DNA menggunakan teknik Inverse PCR dengan primer

spesifik Knl-Tn903

(5'-gAATATggCTCATAACAC-3')

dan primer universal

M13-Forward (5'-TgTAAAACgACggCCAgT- 3') menghasilkan fragmen DNA

pengapit berukuran 0,7 kb. DNA pengapit tersebut diligasikan dengan plasmid

vektor pGem@-T Easy membentuk plasmid rekombinan pAAOl (3,7 kb) dan

selanjutnya diiklonkan pada E. coli TOP10.

Analisa sekuen DNA pengapit melalui Web European Bioinformatics

Institute (EBI) fasta 3, menunjukkan kemiripan dengan gen vir dari Bacillz~s

anthracis dengan nilai 64% dari 75 nukleotida yang overlap.

Hibridisasi Southern pAAOl dengan DNA genom Xag YR32 yang di- digest sempurna dengan PstI menunjukkan bahwa gen Xag YR32 yang termutasi

terdapat pada fragmen berukuran 3,O kb.

Berdasarkan model hipotetik tentang hngsi protein hrp pada proses cell

signaling yang dikemukakan Fenselau et al. (1992), diduga mutasi pada Xag

M715 tejadi pada salah satu gen hrp yang menyandikan protein perangkat

ekskresi elicitor, gen regulator gen-gen elicitor atau gen penyandi elicitor

sehingga mengakibatkan kegagalan proses cell signaling. Kegagalan proses cell

signaling tersebut menyebabkan bakteri ini tidak mampu menimbulkan gejala

penyakit ataupun reaksi hipersensitivitas karena tidak dikenali lagi oleh tumbuhan

inang (compatible /incompatible).

Hasil analisa sekuen tersebut diperoleh berdasarkan analisa salah satu sisi

DNA pengapit, sehingga hasilnya bisa berbeda bila analisa dilakukan kembali

terhadap gabungan kedua sisi sekuen DNA pengapit. Oleh karena itu hasil analisa

sekuen ini belum dapat digunakan untuk mengidentifikasi secara tepat gen yang

tersisipi transposon. Karenanya diperlukan penelitian lebih lanjut untuk

melengkapi data sekuen yang telah ada sehingga informasi yang diperoleh

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jepara pada tanggal 8 Desember 1968 sebagai anak

pertama dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Zainuri Basri dan Ibu

1

Zulichah. Pada tanggal 22 Januari 1995 penulis menikah dengan Ir. Iman

Rusmana. Dari pernikaban tersebut penulis dikaruniai seorang anak laki-laki 4

bernama Zul Fadhli yang lahir pada tanggal 20 Oktober 1995 serta dua orang

anak perempuan bernama Kamila Nur Imani Putri dan Fadhila Nur Imani Putri

yang lahir pada tanggal 8 Oktober 1999.

.

- Pendidikan dasar dan menengah diselesaikan oleh penulis di Jepara.

Tahun 1982 lulus dari SD Sultan Agung 5, tahun 1985 lulus dari SMP Sultan

Agung 3, d m tahun 1988 lulus dari SMA Sultan Agung 2. Tahun 1988

penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui program Penulusuran

Minat d m Kemampuan (PMDK). Tahun berikutnya penulis masuk ke

Jurusan Biologi FMIPA dan memperoleb gelar Sajana Sains pada tahun 1994.

Pada tahun 1997, penulis melanjutkan pendidikan pada Program Studi

Biologi, Sub-program Mikrobiologi, Program Pascasarjana Institut Pertanian

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahi robbil a'lamin atas rahmat dan kanmia Allah SWT penulis

dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Kloning Gen yang Tedibat dalam

Mekanisme Patogenisitas Xantlzomonas avonopodis pv. glycines.

Pada kesempatan ini penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan

yang setinggi-tingginya kepada Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. atas perhatian,

bimbingan, serta dorongan semangat sejak awal penelitian hingga penulisan

tesis ini.

Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan

kepada Dr. 11. Budi Tjahjono, M.Agr. atas bimbingan dan kesempatan yang

diberikan kepada penulis untuk turut serta dalam tim penelitian proyek RUT

VII.

Kepada Prof Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai anggota komisi

pembimbing dan Kepala Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Antar

Universitas (PAU) Bioteknologi IPB, penulis ucapkan terimasih atas bimbingan

dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menggunakan fasilitas

laboratorium selama pelaksanaan penelitian.

Terimakasih kepada Dr. Drs. Yaya Rukayadi, M.Si., dan semua anggota

tim penelitian Xanthomonns (Rina, Mbak Etty, Pak Heru dan Bu Ila), Irawan,

Pak Dwi, Mbak Nisa, Bu Yus, Pak Bowo, Esti, Puji, rekan-rekan lain serta para

teknisi di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU Bioteknologi IPB dan

Laboratorium Biologi Molekuler SEAMEO BIOTROP atas persahabatan dan

Kepada Bapak dan ibunda tersayang, suami tercinta Iman Rusmana dan

anak-anakku tersayang Fadhli, Mila, dan Dila penulis sampaikan teriinakasih

yang sedalam-dalamnya atas doa, kasih sayang, pengertian, serta dukungannya

selarna ini.

Semoga semua arnal kebaikan tersebut mendapat imbalan yang sepadan

dari Allah SWT. Amin.

DAFTAR IS1

Halaman

ABSTRACT

...

UCAPAN TERIMA KASIH

...

DAFTAR IS1

...

DAFTAR TABEL

...

DAFTAR GAMBAR

...

DAFTAR LAMPIRAN

...

...

PENDAHULUAN

...

Latar Belakang

Tujuan

...

TINJAUAN PUSTAKA

...

Taksonomi dan Biologi Xnnthontonru nxonopodis pv

.

glycines

...

Genetika Molekuler Xnnthomonas amnopurlis pv

.

g$cines

...

Biologi Molekuler Patogenisitas Xnnthotnonas

...

Aplikasi Teknik PCR dalam Genetika Moleknler

...

METODOLOGI

...

Waktu dan Tempat Penelitian

...

Tahapan Penelitian

...

Bahan dan Metode

...

Galnr bakteri dan plasmid

...

Media dan kondisi pertumbuhan

...

Isolasi DNA kromosom

...

...

Isolasi DNA plasmid

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dan ligasi fragmen DNA

...

Isolasi dan pemurnian fragmen DNA dari gel agarosa

Analisa hibridisasi Southern

...

Transformasi

...

Amplifikasi fragmen DNA dengau PCR

...

...

Sekuensing DNA

...

Analisa sekuen DNA