IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(
Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.)
VIDA ELSYANA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2015
Vida Elsyana
RINGKASAN
VIDA ELSYANA. Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) merupakan tanaman semiparasit yang termasuk dalam famili Loranthaceae. Benalu cengkih telah digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk pengobatan kanker. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi senyawa antikanker ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara in vitro pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCM-B2).
Simplisia daun benalu cengkih diekstraksi dengan air menggunakan metode refluks dan etanol 70% dengan metode maserasi. Ekstrak etanol selanjutnya difraksinasi bertingkat menggunakan ekstraksi cair-cair dan diperoleh 3 fraksi, yaitu fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana. Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid.
Sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih diuji menggunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi
n-heksana masing-masing memiliki nilai LC50 sebesar 649.12 μg/mL dan 55.32
μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi n-heksana sebelas kali lebih berpotensi memiliki aktivitas antikanker dibandingkan fraksi etil asetat. Pengujian lebih lanjut dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana benalu cengkih.
Hasil analisis menggunakan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (Py-GC/MS) menunjukkan bahwa fraksi n-heksana daun benalu cengkih mengandung fitol dan metileugenol. Kedua senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antikanker.
Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana daun benalu cengkih diuji menggunakan metode pewarnaan Trypan Blue dan sel dihitung menggunakan hemasitometer Improved Neubauer. Pengujian fraksi n-heksana daun benalu cengkih dilakukan pada konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. Fraksi n-heksana daun benalu cengkih mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada konsentrasi 125 μg/mL dengan persentase penghambatan sebesar 38.69% pada sel lestari kanker K562 dan 41.5% pada MCM-B2. Benalu cengkih berpotensi menjadi antikanker alami.
SUMMARY
VIDA ELSYANA. Identification of anticancer compounds and antiproliferation activity assay of clove mistletoe leaves extracts (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.). Supervised by MARIA BINTANG and BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Clove mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) is semi-parasitic plant that belongs to Loranthaceae family. Clove mistletoe was used traditionally for cancer treatment in Indonesia. The purpose of this study was to identified anticancer compounds of clove mistletoe leaves extracts and to examine its antiproliferation activity on human myelogenous leukemia (K562) and canine benign mixed mamary (MCM-B2) cancer cell lines in vitro.
The leaves powder of clove mistletoe were extracted by water using reflux method and by ethanol using maceration method. Ethanol extract of clove mistletoe was then fractionated using liquid-liquid extraction and resulted ethanol fraction, etyl acetate fraction, and n-hexane fraction. Phytochemical screening showed the leaves powder of clove mistletoe contained flavonoids, saponins, tannins, and triterpenoid.
Cytotoxicity of clove mistletoe leaves extract was conducted using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Water extract, ethanol extract, and ethanol fraction had LC50 greater than 1000 μg/mL. Etyl acetate fraction and n-hexane fraction had
LC50 649.12 μg/mL and 55.32 μg/mL, respectively. This results suggested that
etyl acetate and n-hexane fractions had potent of anticancer activity in cancer cell lines. Nevertheless, n-hexane fraction eleven times more potent than etyl acetate fraction. Therefore, only n-hexane fractions was then considered for further examinations.
Analysis of active compounds using Pyrolysis Gas Chromatography/Mass Spectrometry (Py-GC/MS) revealed that n-hexane fraction contained methyleugenol and phytol. These compounds was known acts as anticancer.
Antiproliferation activity of n-hexane fraction of clove mistletoe was conducted using Trypan Blue Dye Exclusion Method and cells were counted using Improved Neubauer haemacytometer. The n-hexane fraction of clove mistletoe was tested at concentration 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. The results showed that n-hexane fraction could inhibited growth of K562 and MCM-B2 cancer cell line. The highest inhibition activity of K562 cell lines was 38.69%, while on MCM-B2 was 41.5%, this activity was achieved at concentration 125 μg/mL. Therefore, it was suggested that clove mistletoe had potential for natural anticancer.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS
ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH
(
Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Judul Tesis : Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Nama : Vida Elsyana NIM : G851130291
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS Ketua
Prof drh Bambang Pontjo P, MS PhD APVet Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Biokimia
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini ialah identifikasi senyawa antikanker dan uji aktivitas antiproliferasi ekstrak daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang, MS selaku ketua komisi pembimbing sekaligus ketua Program Studi Biokimia dan Bapak Prof drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, PhD.APVet selaku anggota komisi pembimbing atas saran dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi selaku penguji luar komisi dan Ibu Dr Suryani, SP, MSc selaku moderator pada ujian tesis atas saran untuk perbaikan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada seluruh staf Sekolah Pascasarjana (SPs) dan Fakultas MIPA IPB, khususnya Departemen Biokimia serta pranata laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB dan laboratorium kultur jaringan Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi FKH IPB. Penghargaan penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Dirjen Dikti) atas pemberian Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN) Tahun 2013.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua penulis, yaitu Bapak Maryoto dan Ibu Rukidah serta Kakak (Dedi Pramono dan Misgiyati) atas segala doa, motivasi, dan kasih sayangnya.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua rekan pascasarjana Biokimia 50, khususnya Tiana Fitrilia dan Sri Asih serta rekan-rekan kerja di Laboratorium Bioanalisis dan Laboratorium Kultur Jaringan, khususnya Nita Shinta Sari, Fitri Hardiani Fathonah, dan Ansenora Bekris. Penghargaan penulis juga sampaikan kepada Saudari Lailan Sahrina Hasibuan, MKom atas saran dan bantuannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2015
DAFTAR ISI
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih 8 Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih 8
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih 9
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih 9 Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih 10
4 PEMBAHASAN 11
Identitas Spesies Benalu Cengkih 11
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih 12 Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih 13
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih 13
Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih 15 Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih 15
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut 8 2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih 8 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih fraksi n-heksana daun benalu
cengkih 9
4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih 10 5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah
pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih 11
DAFTAR GAMBAR
1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih 9 2 Penurunan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian
fraksi n-heksana daun benalu cengkih 11
3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis 17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alur penelitian 22
2 Surat pernyataan hasil determinasi jenis benalu cengkih 23 3 Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih 24 4 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk
menentukan nilai LC50 26
5 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 33
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit paling mematikan di dunia. Tahun 2012, terdapat sekitar 14.1 juta kasus baru dan 8.2 juta kematian terkait kanker di seluruh dunia (WHO 2015). Kanker disebabkan oleh abnormalitas sel akibat adanya mutasi pada DNA (Garret 2001). Penyakit ini ditandai dengan perubahan sifat normal sel, yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh, dan membelah tanpa terkendali karena mampu memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut selanjutnya memiliki kemampuan menyusup dan merusak jaringan di dekatnya lalu menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan limpa (metastasis) (Haryanti & Katno 2011).
Pengobatan kanker secara konvensional dilakukan dengan pembedahan, radiasi, kemoterapi, dan terapi hormon (Dashora et al. 2011). Pengobatan kanker secara konvensional memiliki beberapa kelemahan. Pembedahan tidak dapat dilakukan untuk sel yang telah mengalami metastasis, radiasi seringkali berbahaya bagi sel-sel normal, dan kemoterapi belum memberi hasil optimal karena ketidakspesifikan kerja obat dan relatif mahal (Dashora et al. 2011; Fadhli et al.
2012; Gamal & Septananda 2013; Wicaksono dan Permana 2013). Hal ini mendorong peningkatan penggunaan herbal untuk pengobatan alternatif kanker, karena obat herbal memiliki efek samping kecil, aman, dan tidak menyebabkan ketergantungan (Olaku & White 2011). Herbal tidak hanya bermanfaat untuk pengobatan kanker pada manusia dan hewan, tetapi juga sebagai titik awal penemuan senyawa aktif untuk pengembangan obat baru (Wahyuni et al. 2009). Indonesia yang kaya akan keanekaragaman hayati memiliki berbagai jenis tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai sumber antikanker baru (Artanti
et al. 2012).
Salah satu tumbuhan yang telah digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia sebagai antikanker adalah benalu (Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.) (Artanti et al. 2012). D. pentandra termasuk famili Loranthaceae. Benalu umumnya dinamai berdasarkan tanaman inangnya, misalnya benalu teh, benalu mangga, dan benalu cengkih (Suryanto & Wehantouw 2008). Benalu bersifat merugikan bagi tumbuhan inangnya namun berpotensi sebagai tanaman obat (Fajriah et al. 2007; Artanti et al. 2012; Anita et al. 2014). Benalu termasuk tanaman semiparasit maka bioaktivitas benalu diduga bergantung pada tanaman inangnya (Xiou et al. 2008).
Benalu yang hidup pada berbagai tanaman inang diketahui memiliki aktivitas sitotoksik dan antikanker. Benalu teh mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel Jurkat T (Hashimoto et al. 2007). Daniel et al. (2012) melaporkan bahwa fraksi etil asetat benalu sirsak memiliki aktivitas sitotoksik terhadap larva udang. Ekstrak batang benalu kapuk mampu menekan ekspresi protein mutan p53 pada kultur sel HeLa (Gamal & Septananda 2013). Ekstrak etanol benalu jeruk bersifat toksik terhadap Artemia salina L. dengan nilai LC50
2
benalu mangga mampu memperbaiki struktur jaringan kanker kolon (Wicaksono dan Permana 2013).
Salah satu benalu yang belum banyak diungkap potensinya adalah benalu cengkih. Terapi dengan meminum air rebusan daun benalu cengkih dilaporkan dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara (Puro 2012). Daun benalu cengkih juga memiliki aktivitas antiradikal bebas DPPH (Suryanto & Wehantouw 2008) dan mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus dan
Escherichia coli (Puro 2012). Penapisan kandungan kimia pada daun benalu cengkih menunjukkan adanya komponen senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid (Fitrilia et al. 2015). Komponen flavonoid telah diketahui berperan penting dalam pencegahan kanker (Ren et al. 2003). Belum ada penelitian terkait identifikasi senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi secara in vitro pada benalu cengkih.
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCM-B2) secara in vitro. Ekstrak benalu cengkih diharapkan mampu menghambat pertumbuhan sel kanker sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi bahan alam untuk pengobatan kanker.
Perumusan Masalah
Potensi dari benalu cengkih belum banyak diungkap dibandingkan jenis benalu lainnya. Penapisan komponen fitokimia pada akar, batang, daun, dan bunga benalu cengkih menunjukkan adanya komponen fenolik, flavonoid, saponin, dan tanin (Suryanto & Wehantouw 2008). Kandungan senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi dari ekstrak benalu cengkih secara in vitro belum diketahui.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi kandungan senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara
in vitro pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.
Manfaat Penelitian
3
Hipotesis
Ekstrak daun benalu cengkih mengandung senyawa antikanker. Ekstrak daun benalu cengkih juga menghambat pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian ini meliputi pengambilan sampel daun benalu cengkih (D. pentandra (L.) Miq.), pembuatan simplisia, penentuan kadar air, penapisan komponen fitokimia, dan ekstraksi dengan metode refluks dan maserasi. Tahap selanjutnya ialah uji sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak yang paling aktif dianalisis senyawa aktifnya dengan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (Py-GC/MS). Ekstrak juga diuji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna
trypanblue.
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB, Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor, dan Laboratorium Kultur Jaringan Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) IPB. Penelitian dilaksanakan dari Desember 2014 hingga Agustus 2015.
Bahan
Bahan yang diuji dalam penelitian ini adalah daun benalu cengkih yang diperoleh dari daerah Batanghari, Lampung Timur pada bulan Januari 2015. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian antara lain etanol 70%, etil asetat, n-heksana, akuades, amil alkohol, KOH, HCN 2N, pereaksi Wegner, Meyer, dan Dragendorff, FeCl3 10%, asam sulfat, asam asetat, Liebermann-Burchard, kista Artemia salina Leach, air laut, Tween80, akuabides steril, Dulbecco’s Modified
Eagle’s medium (DMEM), Fetal Calf Serum (FCS) 10%, antibiotik Penisilin-Streptomisin 1%, Fungizon, dan pewarna Trypan blue.
4
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah grinder, desikator, cawan porselen, oven, evaporator vakum, corong pisah, vorteks, lampu TL 14 watt, plat BSLT, aerator, shaker orbital, inkubator CO2, autoklaf, mikroplat
24-sumuran, mikroplat 96-24-sumuran, hemositometer Improved Neubauer, mikroskop cahaya, dan mesin GC/MS pirolisis (Shimadzu GCMS-QP2010).
Prosedur
Determinasi Jenis Sampel Benalu Cengkih
Sampel daun benalu cengkih dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi – LIPI, Cibinong Bogor untuk menentukan identitas spesies sampel.
Pembuatan Simplisia dan Penentuan Kadar Air Sampel
Bagian benalu cengkih yang digunakan ialah daun. Daun benalu cengkih yang diambil mulai daun keempat dari pucuk ke arah yang lebih tua.
Pembuatan Simplisia Daun benalu cengkih dicuci menggunakan air mengalir. Daun dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dan ditutup kain berwarna gelap. Pengeringan dilakukan selama 3x7 jam (hari ke 1,2,3) dengan cuaca normal. Pengeringan disempurnakan dengan oven pada suhu 40-45oC. Daun dibuat serbuk berukuran 40 mesh menggunakan grinder.
Penentuan Kadar Air Sampel Kadar air ditentukan berdasarkan metode SNI 01-2891-1992. Cawan kosong dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105°C selama 1 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Cawan ditimbang dan dicatat massanya. Sebanyak 1 gram sampel ditimbang di dalam cawan tersebut. Sampel dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam atau sampai massanya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0.003 gram). Cawan berisi sampel kering lalu didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang massa akhirnya. Kadar air sampel dihitung berdasarkan persamaan (1) sebagai berikut.
adar air % b y a
Keterangan:
x = massa cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = massa cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = massa cawan kosong (g)
Ekstraksi Sampel
5
Pembuatan Ekstrak Ekstrak air dibuat dengan cara merebus 40 g simplisia dengan 400 mL akuades selama 2 jam menggunakan refluks. Ekstrak etanol dibuat dengan cara merendam 40 g simplisia dengan 400 mL etanol 70% teknis dan diaduk menggunakan shaker orbital kecepatan 125 rpm selama 24 jam. Ekstraksi sampel dengan air dan etanol masing-masing dilakukan pengulangan tiga kali dengan pelarut baru. Ekstrak yang dihasilkan dipisahkan dari residunya menggunakan sentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Ekstrak diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC.
Fraksinasi Ekstrak Etanol Ekstrak etanol difraksinasi dengan pelarut n-heksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan etanol (polar) menggunakan corong pisah. Sebanyak 15 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 100 mL air hangat lalu dimasukkan dalam corong pisah. Ekstrak etanol difraksinasi dengan 100 mL n-heksana. Campuran dikocok perlahan setiap 10 menit dan diulang tiga kali kemudian didiamkan selama 30 menit hingga terbentuk fraksi n-heksana (atas) dan air (bawah). Fraksi n-heksana dipisahkan dan fasa air difraksinasi lanjut dengan 100 mL etil asetat. Fraksi etil asetat yang dihasilkan kemudian dipisahkan dan fraksi air ditambah 100 mL etanol sehingga diperoleh fraksi etanol. Ekstraksi setiap fraksi menggunakan 100 mL pelarut baru dan diulang hingga pelarut hampir tak berwarna. Ketiga fraksi diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dan dihitung berdasarkan persamaan (2) sebagai berikut.
endemen e stra % assa simplisia yang die stra si assa e stra yang dihasil an 100%
Uji Kualitatif Kandungan Fitokimia Sampel
Penentuan kandungan fitokimia sampel dilakukan berdasarkan metode Windarini et al. (2013) yang dimodifikasi.
Uji Alkaloid Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 mL HCl 2 N dan 9 mL akuades. Larutan dipanaskan selama 2 menit lalu didinginkan dan disaring. Filtrat diuji dengan tiga pereaksi alkaloid (Wagner, Meyer, dan Dragendorff). Adanya alkaloid ditandai dengan endapan coklat pada pereksi Wagner, endapan putih kekuningan pada pereaksi Meyer dan endapan merah hingga jingga pada pereaksi Dragendorff.
Uji Flavonoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 0.05 g serbuk magnesium dan 0.2 mL asam alkohol (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volum sama). Campuran tersebut ditambahkan 2 mL amil alkohol kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau kuning pada lapisan amil alkohol.
6 eter dalam cawan porselen kemudian diuapkan. Residu ditambahkan dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Adanya triterpenoid ditandai dengan warna merah hingga hijau.
Pengujian Sitotoksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Pengujian sitotoksisitas dilakukan berdasarkan metode McLaughlin et al.
(1998) yang dimodifikasi.
Penyiapan Larva Udang Penetasan larva dilakukan dengan cara merendam 10 mg kista udang dalam toples kaca berisi 1 L air laut yang telah disaring. Penetasan dilakukan pada suhu kamar dengan diterangi sinar lampu TL 14 watt dan diaerasi selama 24 jam. Larva udang digunakan untuk uji setelah 48 jam.
Pembuatan Larutan Uji Larutan uji terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fra si etanol. Larutan sto 2000 μg/mL masing -masing e stra dibuat dengan menambah an 20 mg e stra dengan 50 μL dicukupkan hingga 2 mL dengan penambahan air laut. Setiap konsentrasi ekstrak diuji sebanyak tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar di bawah sinar lampu TL 14 watt selama 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang hidup. Kontrol dilakukan dengan prosedur yang sama tanpa penambahan ekstrak.
Analisis Senyawa Antikanker
7
Uji Aktivitas Antiproliferasi
Uji aktivitas antikanker dilakukan berdasarkan metode Priosoeryanto et al.
(1995a).
Persiapan Media dan Ekstrak Sel lestari kanker dikultur menggunakan media pertumbuhan DMEM sebanyak 850 μL dalam mikroplat 24 sumuran. Media di setiap sumuran ditambahkan antibiotik (penisilin-streptomisin) 10 μL, fungizon 10 μL dan serum (FCS) 30 μL serta ekstrak sebanyak 50 μL. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak yang bersifat toksik berdasarkan uji toksisitas dengan BSLT. Variasi konsentrasi ekstrak ditentukan berdasarkan nilai LC50 dan diuji
sebanyak tiga kali ulangan.
Penanaman Sel Suspensi sel lestari kanker dalam ampul (cryovial) dicairkan (thawing) lalu dihomogenkan dengan vorteks. Sebanyak 50 μL sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 (kepadatan 7x106 sel/mL) ditanam ke dalam masing-masing sumuran yang telah berisi media bersuplemen dan ekstrak. Kontrol negatif dilakukan dengan medium DMEM dan kontrol positif menggunakan doksorubisin 100 μg/mL dengan prosedur yang sama. Volume total setiap sumuran adalah 1 mL. Semua perlakuan dilakukan dalam tiga kali ulangan. Sel lestari kanker diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Pemanenan dan Penghitungan Sel Sel dipanen setelah 3-4 hari yaitu ketika pertumbuhan sel dikontrol negatif telah menutupi sekitar 70% permukaan sumuran (konfluen). Sebanyak 100 μL sel lestari kanker dimasukkan ke dalam sumuran mikroplat ELISA yang telah berisi 5 μL pewarna trypan blue kemudian dihomogenkan. Sel sebanyak 5 μL ditetes an pada chamber hemasitometer lalu ditutup dengan cover slip. Sel dihitung menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah kamar hitung baik sel yang mati (biru) maupun sel hidup (bening). Hasil penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per mL suspensi dengan persamaan (3) berikut.
Jumlah sel/mL = Jumlah sel yang dihitung x Faktor volume x Faktor pengenceran Persentase aktivitas pertumbuhan dan penghambatan sel kanker dihitung dengan persamaan (4) dan (5) berikut.
% tivitas pertumbuhan umlah rataan sel dengan perla uan umlah rataan sel di ontrol negatif 100%
% Aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)
Analisis Statistika
8
3 HASIL
Identitas Spesies Benalu Cengkih
Determinasi dilakukan oleh Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor berdasarkan sampel daun benalu cengkih. Hasil determinasi menunjukkan bahwa spesies benalu yang diteliti adalah Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. dan termasuk ke dalam famili Loranthaceae.
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Analisis gravimetri menunjukkan bahwa simplisia daun benalu cengkih memiliki kadar air sebesar 9.14%. Rendemen ekstrak daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut dapat dilihat pada Tabel 1. Ekstraksi sampel dengan pelarut air menghasilkan rendemen ekstrak yang lebih tinggi dibandingkan etanol 70%. Rendemen fraksinasi paling tinggi diperoleh melalui penggunaan pelarut etanol.
Tabel 1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih
Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih dapat dilihat pada Tabel 2. Semua sampel menunjukkan hasil uji negatif terhadap alkaloid dan positif terhadap flavonoid dan triterpenoid. Saponin tidak dijumpai dalam fraksi etil asetat dan n-heksana. Hanya fraksi n-heksana yang tidak mengandung tanin.
9
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang dapat dilihat pada Tabel 3. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana
mampu mematikan 50% populasi larva udang pada konsentrasi lebih kecil dari 1000 μg/mL.
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih
Sampel Nilai LC50 μg/mL
Ekstrak air 1572.43
Ekstrak etanol 1673.72
Fraksi etanol 2157.16
Fraksi etil asetat 649.13
Fraksi n-heksana 55.32
Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (GC/MS pirolisis) digunakan untuk menganalisis kandungan senyawa aktif dalam sampel fraksi n-heksana benalu cengkih. Kromatogram dari hasil analisis GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncak-puncak spektrum yang menunjukkan kandungan senyawa dalam sampel fraksi n-heksana (Tabel 4). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan terbesar dalam sampel fraksi n-heksana benalu cengkih diikuti dengan asam palmitat dan metil linolenat.
10
Tabel 4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih Puncak
3 13.919 1.31 2,6-Dimetoksifenol
4 14.293 0.33 Metileugenol
5 15.226 2.31 2,4-Di-tert-butilfenol
6 15.580 1.56 Asam laurat
15 19.792 0.92 Etil n-heptadecanoat
16 20.436 0.83 Methyl trans-9,10-e
17 22.117 19.56 Dioktil ftalat
18 22.315 0.67
1H-Naftol[2,1-b]piran-8(4aH)- one,3-etenildekahidro-3,4a,7,7,10a-penta
19 22.606 0.52 Albikanol
20 26.050 2.03 Gliseril trioktanoat
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Pengaruh pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 disajikan pada Gambar 2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro. Jumlah sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tampak menurun seiring peningkatan konsentrasi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih yang diberikan.
11
Gambar 2 Penurunan sel lestari kanker K562 ( ) dan MCM-B2 ( ) setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih
Tabel 5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih
Keterangan : huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (p<0.05) pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
4 PEMBAHASAN
Identitas Benalu Cengkih
Determinasi tumbuhan dilaksanakan untuk menetapkan identitas suatu tumbuhan. Determinasi dalam penelitian ini penting dilakukan untuk menentukan dan memastikan jenis (spesies) benalu cengkih. Hal ini dikarenakan suatu jenis benalu dapat tumbuh pada beberapa inang yang berbeda atau beberapa spesies benalu yang berbeda dapat tumbuh pada inang yang sama (Artanti et al. 2012).
0
12
Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menetapkan identitas tumbuhan ialah dengan mencocokkan sampel tumbuhan dengan spesies herbarium yang telah dideterminasi. Determinasi benalu cengkih pada penelitian ini dilakukan dengan mengirimkan sampel daun ke Herbarium Bogoriense, Puslit Biologi, LIPI Cibinong Bogor. Herbarium Bogoriense dipilih sebagai lembaga yang melakukan determinasi karena koleksinya yang lengkap dan lokasi yang relatif dekat dengan tempat pelaksanaan penelitian.
Dendrophthoe pentandra (L.) Miq merupakan salah satu jenis benalu yang banyak dijumpai hidup pada berbagai tanaman di Indonesia (Marvibaigi et al. 2014). Dendrophthoe pentandra (L.) Miq selain dijumpai pada tanaman cengkih juga dilaporkan hidup pada tumbuhan inang lobi-lobi (Fajriah et al. 2007), teh, kepel, kedondong, srikaya (Artanti et al. 2012), sirsak (Daniel et al. 2012), kapuk (Gamal & Septananda 2013), langsat (Tristanti et al. 2013), dan mangga (Wicaksono & Permana 2013).
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Penentuan kadar air simplisia daun benalu cengkih yang telah dikeringkan bertujuan mengoreksi rendemen ekstrak yang diperoleh. Hasil pengukuran dengan analisis gravimetri diketahui simplisia daun benalu cengkih mengandung kadar air 9.14%. Hasil tersebut menunjukkan simplisia telah memenuhi syarat kadar air simplisia kurang dari 10% (BPOM 2014) sehingga dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme dan dapat disimpan dalam jangka waktu lebih lama. Kadar air yang rendah juga dapat mencegah berubahnya kandungan fitokimia sampel menjadi produ lain yang berbeda efe fama ologinya a’mun et al. 2006).
Rebusan daun benalu cengkih dilaporkan telah digunakan oleh masyarakat untuk terapi kanker (Puro 2012). Simplisia daun benalu cengkih pada penelitian ini diekstraksi dengan pelarut air menggunakan metode refluks untuk menguji bioaktivitas rebusan daun benalu cengkih. Simplisia juga diekstraksi dengan pelarut etanol 70% menggunakan metode maserasi. Etanol 70% dipilih sebagai pelarut untuk ekstraksi daun benalu cengkih karena sifatnya yang relatif aman, dan mampu menyari senyawa aktif dalam simplisia. Maserasi dipilih sebagai metode ekstraksi benalu cengkih karena tidak menggunakan suhu tinggi dalam proses ekstraksinya sehingga tidak akan merusak senyawa aktif yang terkandung dalam simplisia. Metode ini juga lebih sederhana, mudah dilakukan, dan murah dibandingkan dengan sokletasi dan perkolasi.
Ekstraksi sampel dengan pelarut air dan etanol 70% masing-masing menghasilkan rendemen ekstrak 17.83% dan 16.14% (Tabel 1). Ekstraksi dengan pelarut air menghasilkan rendemen lebih tinggi daripada etanol 70%. Air diketahui bersifat lebih polar dibandingkan dengan etanol. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia daun benalu cengkih bersifat polar sehingga lebih banyak tersari dengan pelarut air.
13 fraksi etanol paling tinggi dibandingkan fraksi etil asetat dan n-heksana. Ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia dalam ekstrak etanol bersifat polar.
Nilai rendemen ekstrak yang diperoleh selanjutnya dikoreksi dengan hasil analisis kadar air. Rendemen terkoreksi dari ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana daun benalu cengkih berturut-turut adalah 19.62%, 17.77%, 5.12%, 2.70%, dan 0.48%.
Rendemen ekstrak yang diperoleh pada penelitian ini rendah diduga karena menggunakan metode maserasi dalam ekstraksinya. Ekstraksi menggunakan maserasi tidak memungkinkan terjadinya sirkulasi pelarut baru secara otomatis dalam penyariannya. Hal ini menyebabkan pelarut jenuh sehingga kemampuan penyarian berkurang dan tidak sempurna (Prasetyorini et al. 2011).
Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Uji kualitatif kandungan senyawa fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih yang diambil dari daerah Batanghari-Lampung positif mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid, namun negatif terhadap alkaloid (Tabel 1). Fitrilia et al. (2015) meneliti ekstrak daun benalu cengkih dari Curup-Bengkulu juga melaporkan hasil yang sama. Benalu lobi-lobi juga positif mengandung triterpenoid dan negatif terhadap alkaloid (Fajriah et al. 2007). Hasil berbeda dilaporkan oleh Daniel et al. (2012) yaitu ekstrak benalu sirsak tidak mengandung triterpenoid, namun positif terhadap alkaloid. Hal ini memperkuat pernyataan a’at 2005) dan Marvibaigi et al. (2014) bahwa kandungan fitokimia benalu bervariasi bergantung pada jenis tanaman inang.
Hasil penapisan ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia yang terdapat pada masing-masing ekstrak bergantung pada kepolaran ekstrak. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol (polar) mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid. Fraksi etil asetat (semipolar) mengandung flavonoid, tanin, dan triterpenoid. Fraksi n-heksana hanya mengandung flavonoid dan triterpenoid. Hal ini sesuai dengan pernyataan Artanti et al. (2012) bahwa pelarut yang digunakan untuk ekstraksi akan menentukan kandungan fitokimia ekstrak benalu.
Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk menentukan sifat sitotoksik suatu senyawa atau ekstrak sebelum diuji menggunakan sel lestari kanker (Artanti et al. 2012; Sumakrianti et al. 2013). Sitotoksisitas senyawa atau ekstrak ditentukan berdasarkan respon kematian 50% populasi larva udang (LC50). Suatu ekstrak tumbuhan dianggap toksik terhadap
larva udang apabila memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 1000 μg/mL (Meyer et al.
1982). Tingkat toksisitas tersebut menunjukkan potensi aktivitasnya sebagai antikanker. Metode BSLT telah teruji memiliki korelasi yang baik dengan aktivitas sitotoksik menggunakan sel lestari kanker (McLaughlin et al. 1998).
Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang dapat dilihat pada Tabel 2. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol tidak mengindikasikan adanya toksisitas terhadap larva udang karena memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Ketiga sampel tersebut diasumsikan tidak
14
sesuai dengan penelitian Artanti et al. (2012) yang menyebutkan bahwa ekstrak air D. pentandra dari inang kepel, kedondong, srikaya, dan teh juga tidak bersifat sitotoksik.
Uji BSLT lazim digunakan dalam penapisan pendahuluan untuk deteksi komponen antikanker. Hasil penelitian ini membuktian bahwa air rebusan daun benalu cengkih tidak mengindikasikan adanya potensi antikanker sehingga diduga tidak efektif digunakan untuk pengobatan kanker. Kurang aktifnya air rebusan daun benalu cengkih diduga karena rusaknya kandungan fitokimia akibat penggunaan panas saat ekstraksi.
Nilai LC50 ekstrak air dan ekstrak etanol yang lebih besar dari 1000 μg/mL
menunjukkan bahwa kedua ekstrak ini relatif aman dikonsumsi untuk manfaat lain misalnya antioksidan. Fitrilia et al. (2015) melaporkan bahwa ekstrak air dan ekstrak etanol daun benalu cengkih memiliki nilai inhibition concentration 50% (IC50) masing-masing 11.39 μg/mL dan 6.82 μg/mL. Aktivitas antioksidan ekstrak
air dan ekstrak etanol tersebut tidak berbeda nyata dengan α-tokoferol (IC50 6.08
μg/mL). Adanya aktivitas antioksidan diduga dapat berperan dalam mencegah terjadinya kanker.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana masing-masing pada konsentrasi 649.13 μg/mL dan 55.32 μg/mL mampu mematikan setengah populasi larva udang (Tabel 2). Hal ini mengindikasikan adanya toksisitas kedua fraksi pada larva udang sehingga diduga berpotensi memiliki aktivitas antikanker. Berdasarkan nilai LC50, fraksi n-heksana sebelas
kali lebih berpotensi dibandingkan dengan fraksi etil asetat. Fraksi n-heksana diasumsikan memiliki bioaktivitas terbaik sehingga identifikasi kandungan senyawa antikanker dan pengujian aktivitas antiproliferasi pada sel lestari kanker selanjutnya dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana.
Aktivitas sitotoksik fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana lebih aktif dibandingkan dengan ekstrak etanol (Tabel 2). Hasil ini sejalan dengan penelitian Pisutthanan et al. (2004) yang menunjukkan bahwa fraksinasi mampu membantu menghilangkan sebagian besar fraksi yang tidak aktif sehingga menghemat waktu dan biaya dalam menemukan senyawa aktif.
Kematian larva udang karena pemberian ekstrak benalu cengkih diduga berkaitan dengan kandungan fitokimianya. Hal ini dipastikan dengan tidak adanya larva udang yang mati pada kelompok kontrol sehingga kematian larva udang bukan disebabkan kelaparan atau faktor lainnya. Flavonoid dan triterpenoid pada konsentrasi tertentu bersifat toksik sehingga diduga menjadi penyebab kematian larva udang.
15
Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih
Senyawa yang berpotensi sebagai antikanker pada fraksi n-heksana diidentifikasi menggunakan GC/MS pirolisis. Hasil analisis GC/MS pirolisis dari fraksi n-heksana berupa kromatogram yang ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncak spektrum yang muncul dan tampak saling tumpang tindih. Hal ini diduga
karena kondisi ekstrak yang belum murni. Berdasarkan waktu retensinya,
teridentifikasi sebanyak 20 senyawa dalam sampel fraksi n-heksana (Tabel 4). Senyawa-senyawa tersebut termasuk ke dalam golongan utama, yaitu fenolik, asam lemak, ester asam lemak, dan diterpen.
Hasil analisis GC/MS pirolisis menunjukkan bahwa senyawa dengan kelimpahan terbanyak dalam fraksi n-heksana ialah dioktil ftalat (19.56%) diikuti dengan asam palmitat (19%) dan metil linolenat (18.04%). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan tertinggi, namun studi literatur menunjukkan bahwa dioktil ftalat tidak memiliki bioaktivitas. Senyawa golongan asam lemak seperti asam laurat, asam stearat, dan asam palmitat diketahui memiliki sifat antikanker dan senyawa ester asam lemak berperan sebagai antioksidan (Sim et al. 2010).
Fitol merupakan senyawa diterpen alkohol asiklik dan biasa dijumpai pada minyak essensial beberapa tanaman aromatik. Fitol diketahui memiliki beberapa bioaktivitas seperti antimikrob, antikanker, dan antiinflamasi (Sermakkani & Thangapandian 2012; Silva et al. 2013).
Neofitadiena juga termasuk senyawa golongan diterpen. Penelitian Fajriah
et al. (2007) juga melaporkan adanya kandungan neofitadiena pada ekstrak etil asetat benalu lobi-lobi (D. pentandra). Neofitadiena diketahui memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, dan antimikrob (Palic et al. 2002).
Penelitian ini berhasil mengungkap adanya kandungan metileugenol pada fraksi n-heksana benalu cengkih (Tabel 4). Metileugenol termasuk komponen penyusun alami dari minyak essensial yang berasal dari tanaman aromatik seperti cengkih (Syzygium aromaticum) (Yi et al. 2015). Ini membuktikan bahwa kandungan benalu dipengaruhi oleh metabolit tanaman inangnya akibat dari sifat semiparasit benalu sehingga bioaktivitas benalu juga bergantung pada tanaman inangnya (Xiao et al. 2008).
Senyawa 2,6-Dimetoksifenol dan 2,4-Di-tert-butilfenol termasuk golongan fenolik. 2,4-Di-tert-butilfenol secara struktural berkaitan dengan antioksidan BHA (butylated hydroxyanisole) (Sim et al. 2010) dan memiliki aktivitas antioksidan (Yoon et al. 2006).
Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Benalu Cengkih
Hasil BSLT dan analisis GC/MS menunjukkan bahwa fraksi n-heksana berpotensi memiliki aktivitas antikanker. Pengujian aktivitas antiproliferasi dilakukan untuk mengonfirmasi kemampuan fraksi n-heksana dalam menghambat pertumbuhan sel lestari kanker secara in vitro. Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana diuji pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel kanker payudara anjing (MCM-B2).
Nilai LC50 fraksi n-he sana dari BSLT di etahui sebesar 55.32 μg/mL.
16
konsentrasi tengah dalam seri variasi konsentrasi uji. Variasi konsentrasi sampel yang digunakan ialah 0, 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro (Gambar 2). Perlakuan dengan pemberian fraksi n-heksana secara nyata (p<0.05) mampu menghambat pertumbuhan kedua sel dibandingkan dengan kontrol negatif. Aktivitas penghambatan ekstrak meningkat seiring dengan peningkatan kosentrasi ekstrak yang digunakan namun tampak berbeda pada kedua sel lestari kanker. Hasil ini sesuai dengan penelitian Priosoeryanto et al. (2004) yang menyatakan bahwa aktivitas antikanker ekstrak bergantung pada jenis sel lestari kanker yang digunakan.
Aktivitas penghambatan pada sel lestari kanker K562 dengan pemberian fraksi n-heksana konsentrasi 25, 50 dan 75 μg/mL tampa tida berbeda nyata (p>0.05). Aktivitas penghambatan yang tidak berbeda nyata juga tampak pada onsentrasi 100 dan 125 μg/mL. Hal ini diduga arena de atnya rentang konsentrasi uji yang digunakan sehingga antara konsentrasi yang satu dengan lainnya memberikan pengaruh tidak berbeda nyata.
Sel lestari kanker K562 merupakan sel blast yang memiliki karakteristik diferensiasi sel sangat rendah (highlyundifferentiated) pada seri granulositik dan sulit untuk matang menjadi sel fungsional (Lozzio & Lozzio 1979; Koeffler & Golde 1980). Selanjutnya penelitian Priosoeryanto (1995a) menyatakan bahwa sel lestari kanker MCM-B2 kemungkinan berasal dari sel induk (stem cell) atau sel atipikal sehingga sel-selnya belum terdiferensiasi. Hal ini ditunjukkan dari hasil observasi in vitro sel ini memiliki morfologi dan imunohistokimia yang homogen. Diferensiasi sel ini secara in vivo dapat terjadi dalam beberapa cara, namun diferensiasinya rendah pada kultur sel secara in vitro (Priosoeryanto 1995b). Karakteristik sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tersebut diduga menjadi penyebab terhambatnya pertumbuhan sel-sel ini sehingga jumlah selnya menurun ketika diganggu pertumbuhannya secara in vitro dengan pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih.
Perbedaan aktivitas penghambatan fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih juga diduga disebabkan oleh adanya perbedaan reseptor membran maupun inti sel pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Perbedaan reseptor berpengaruh pada jumlah senyawa aktif ekstrak daun benalu cengkih yang mampu terikat pada sel lestari kanker. Semakin banyak tersedia reseptor sel lestari kanker yang mampu mengikat senyawa aktif maka aktivitas penghambatan menjadi tinggi sehingga jumlah sel lestari kanker menurun. Perbedaan reseptor ini juga diduga menyebabkan perbedaan respon sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 terhadap fraksi n-heksana daun benalu cengkih dan doksorubisin.
17 Analisis GC/MS pirolisis pada fraksi n-heksana menunjukkan adanya senyawa fitol yang dilaporkan memiliki aktivitas antikanker (Tabel 4). Fitol diduga berperan dalam menghambat proliferasi sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Hal ini karena fitol dilaporkan mampu menginduksi terjadinya kematian sel terprogram (apoptosis) pada sel Huh7 dan HepG2 (Kim et al. 2015).
Mekanisme apoptosis oleh fitol terjadi melalui aktivasi caspase-9/3 (Kim
et al. 2015). Enzim caspase diketahui berperan penting sebagai perantara utama terjadinya apoptosis (Chang & Yang 2000). Jalur caspase diaktivasi oleh sitokrom c, yaitu protein proapoptosis dalam mitokondria yang pelepasannya diatur oleh famili protein Bcl2 (Bax dan Bad). Jalur caspase ini diawali dengan pengaktifan procaspase 9 menjadi caspase 9. Caspase 9 berperan sebagai inisiator apoptosis yang akan mengaktivasi caspase 3 sebagai efektor apoptosis. Caspase 3 selanjutnya bertugas memecah protein penting di dalam sel sehingga memicu terjadinya fragmentasi DNA dan menyebabkan kematian sel lestari kanker (Li et al. 2013). Mekanisme fitol dalam menginduksi terjadinya apoptosis ditunjukkan pada Gambar 3.
Gambar 3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis (Li et al. 2012)
18
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) memiliki aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 sebesar 55.32
μg/mL. Fraksi n-heksana juga menunjukkan aktivitas antiproliferasi terhadap pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada pemberian fraksi n-heksana daun benalu ceng ih onsentrasi 125 μg/mL, yaitu sebesar 38.69% 562 dan 41.50% (MCM-B2). Analisis dengan GC-MS pirolisis mengungkap adanya metileugenol dan fitol dalam fraksi n-heksana benalu cengkih yang diketahui berperan sebagai antikanker sehingga benalu cengkih berpotensi dikembangkan sebagai antikanker alami.
Saran
Pengujian aktivitas antiproliferasi pada sel normal dan sel lestari kanker lain akan memperkaya informasi bioaktivitas ekstrak benalu cengkih. Pemurnian ekstrak perlu dilakukan untuk memperoleh senyawa yang lebih murni dan berpotensi sebagai antikanker serta penelusuran mekanisme kerja senyawa antikankernya.
DAFTAR PUSTAKA
Anita A, Khotimah S, Yanti AH. 2014. Aktivitas antibakteri ekstrak daun benalu jambu air (dendropthoe pentandra (L.) Miq) terhadap pertumbuhan
Salmonella typhi. Jurnal Protobiont. 3(2) : 268-272.
Artanti N, Firmansyah T, Darmawan A. 2012. Bioactivities evaluation of indonesian mistletoes (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) leaves extracts.
JAPS. 2(1) : 24-27.
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2014. Persyaratan mutu obat tradisional.
Chang HY, Yang X. 2000. Protease for cell suicide : functions and regulation of caspase. Microbiol Mol Biol Rev. 64:821-846.
Daniel, Saleh C, Padin MSL. 2012. Uji bioaktivitas beberapa fraksi dari ekstrak daun benalu sirsak (Dendrophthoe cf. Pentandra [L.] Miq.) yang berasal dari Kalimantan Timur. Mulawarman Sci. 11(1) : 83-93.
19 Fadhli H, Teruna HY, Jose C. 2012. Uji toksisitas ekstrak kulit batang pulai basung (Alstonia spatulata BL) dengan metode brine shrimp lethality test. J Ind Che Acta. 3 (1) : 10-15.
Fajriah S, Darmawan A, Sundowo A, Artanti N. 2007. Isolasi senyawa antioksidan dari ekstrak etil asetat daun benalu Dendrophthoe pentandra L. Miq yang tumbuh pada inang lobi-lobi. Jurnal Kimia Indonesia. 2(1):17-20 Fitrilia T, Bintang M, Safithri M. 2015. Phytochemical screening and antioxidant
activity of clove mistletoe leaf extract (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
IOSR J Pharm. 5(8):13-18.
Gamal, Septananda E. 2013. Potential analysis of cottonwood parasite (Dendropthoe pentandra) stem extract in decreasing of mutant P53 protein expression on cervical cancer cell (HeLa Cells) in vitro. JIMKI. 1(2): 11-15 Garret MD. 2001. Cell cycle control and cancer. Curr Sci. 81(5) : 515-522.
Haryanti S, Katno. 2011. Aktivitas sitotoksik Ocimum sanctum L pada sel kanker kolon WiDr. Simposium Nasional XV PERHIPBA
Hashimoto T, Vicas S, Suzuki T, Sambongi K, Kanazawa K. 2007. Benalu teh induces apoptosis in jurkat T cells. OCHA. HB-P-702.
Kim CW, Lee HJ, Jung JH, Kim YH, Jung DB, Sohn EJ, Lee JH, Woo HJ, Baek NI, Kim YC et al. 2015. Activation of caspase-9/3 and inhibition of epithelial mesenchymal transition are critically involved in antitumor effecr of phytol in hepatocellular carcinoma cells. Phytother Res. 29(7):1026-31. Koeffler HP, Golde DW. 1980. Human myeloid leukemia cell linea : a review.
Blood. 56(3) : 344-350.
Li Y, Shuai Z, Jiang XG, Xiao YH. 2013. Curcumin inhibits human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation through regulations of Bcl-2/Bax and cytochrome c. Asian Pac J Cancer Prev. 14(8):4599-4, 602.
Li Z, Xu X, Huang Y, Ding L, Wang Z, Yu G, Xu D, Li W, Tong D. 2012. Swainsonine Activates Mitochondria-mediated Apoptotic Pathway in Hu-man Lung Cancer A549 Cells and Retards the Growth of Lung Cancer Xen-ografts. Int J Biol Sci. 8(3):394-405. doi: 10.7150/ijbs.3882
Lozzio BB, Lozzio CB. 1979. Properties adn usefulness of the original K-562 human myelogenous leukemia cell line. Leukemia Res. 3(6):363-370.
a’at S. 2005. Tanaman obat untu pengobatan an er bagian 4, tera hir .
Jurnal Bahan Alam Indonesia. 4(1) :244-252.
a’mun, Suhirman S, Manoi F,. Sembiring BS, Tritianingsih, Sukmasari M, Gani A, Tjitjah, Kustiwa D. 2006. Teknik pembuatan simplisia dan ekstrak purwoceng. [Laporan Pelaksanaan Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik]. 314-324.
Marvibaigi M, Supriyanto E, Amini N, Majid FZA, Jaganathan SK. 2014. Preclinical and clinical effect of mistletoe against breast cancer (review article). BioMed Res Int. doi :10.1155/2014/785479.
McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Inform Jl. 32 : 513-524
20
Olaku O, White JD. 2011. Herbal therapy use by cancer patient : a literature review on case report. Eur J Cancer. 47(4) : 508-514. doi:10.1016/j.ejca. 2010.11.018.
Palic R, Stojanovic G, Alagic S, Nikolic, Lepojevic Z. 2002. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil and CO2 extracts
of the oriental tobacco, Prilep. Flav Frag J. 17(5):323-326. DOI: 10.1002/ffj.1084.
Pisutthanan S, Plianbangchang P, Pisutthanan N, Ruanruay S, Muanrit O. 2004. Brine shrimp lethality activity of Thai medicinal plants in the family Meliaceace. Naresuan Univ. J. 12(2):13-18.
Prasetyorini, Wiendarlina IY, Peron AB. 2011. Toksisitas beberapa ekstrak rimpang cabang temulawak (Curcumaxanthorrhiza Roxb.) pada larva udang
(Artemia salina Leach.). Fitofarmaka. 1(2):14-21.
Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K. 1995a. Establishment of a cell line (MCM-B2) from a benign mixed tumour of canine mammary gland. Res Vet Sci. 58 : 272-276.
Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K. 1995b. Transplantation of a cell line derived from a canine benign mixed mammary tumour into nude mice. J Comp Path. 113 : 383-388.
Priosoeryanto BP, Gunanti, Huminto H, Sumarny R. 2004. Aktivitas anti-proliferasi dan anti-invasi dari ekstrak kloroform dan metanol daun nusa indah putih (Mussaenda philippica) pada sel lestari tumor secara in vitro. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner.
Puro I. 2012. Kajian aktivitas antibakteri daun gatel (Laportea Decumana
(ROXB.) WEDD.) dan daun benalu cengkih [Skripsi]. Bogor (ID) : IPB. amadhan H. 2013. nalisis inhibisi enzim α-glukosidase dan sitotoksisitas
ekstrak air-etanol benalu jeruk (Loranthus spp.) [Skripsi]. Bogor (ID) : IPB. Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids : promising
anticancer agent. Medicin Res Rev. 23(4) : 519-534.
Sermakkani M, Thangapandian V. 2012. GC-MS analysis of Сassia italica leaf methanol extract. Asian J Pharm Clin Res.5(2):90-94.
Silva RO, Sousa FBM, Damascenoa SRB, Carvalhoa NS, Silva VNG, Oliveira FRMA, Sousa DP, Araga KS, Barbosa ALR, Freita RM et al. 2013. Phytol, a diterpene alcohol, inhibits the inflammatory response by reducing cytokine production and oxidative stress. Fund Pharmacol. doi: 10.1111/fcp.12049
Sim KS, Sri Nurestri AM, Norhanom AW. 2010. Phenolic content and antioxidant activity of crude and fractionated extracts of Pereskia bleo (Kunth) DC. (Cactaceae). Afr J Pharm Phamacol. 4(5):193-201.
Sukmarianti NW, Suaniti NM, Swantara IMD. 2013. Identifikasi dan uji aktivitas antikanker ekstrak spons Ianthella basta terhadap larva Artemia salina L.
Cakra Kimia (Indones J App Chem). 1(1):14-19.
Suryanto E, Wehantouw F. 2008. Aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak fenol dari benalu cengkih. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 6(5) : 185-188.
21 diinduksi karbon tetraklorida (CCl4). Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT. 2 (3) : 75-78.
[WHO] World Health Organization. 2015. Prevalence of cancer worldwide. [Internet]. [diunduh 27 September 2015].Tersedia pada http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.
Wahyuni FS, Lusianti M, Almahdy, Dachriyanus. 2009. Isolasi senyawa sitotoksik terhadap sel kanker payudara dari kulit batang Garcinia griffithii
T. Daners. Jurnal Farmasi Indonesia. 4(4) : 177 -187.
Wicaksono MH, Permana S. 2013. Potensi fraksi etanol benalu mangga (Dendrophthoe pentandra) sebagai agen anti kanker kolon pada mencit (Mus musculus Balb/c) setelah induksi Dextran Sulvat (DSS) dan Azoxymethane (AOM). Jurnal Biotropika. 1(2) : 75-79.
Windarini LGE, Astuti KW, Warditiani NK. 2013. Skrining fitokimia ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Jurnal Farmasi Udayana. 1(2) : 1-8.
Xiao YJ, Chen YZ, Chen BH, Chen JH, Lin ZX, Fan YL. 2008. Study on cytotoxic activities on human leukemia cell line HL-60 by flavonoids extracts of Scurrula parasitica from four different host trees . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 33(4):427-32.
Yi JL, Shi S, Shen YL, Wang L, Chen HY, Zhu J, Ding Y. 2015. Myricetin and methyl eugenol combination enhances the anticancer activity, cell cycle arrest and apoptosis induction of cis-platin against HeLa cervical cancer cell lines. Int J Clin Exp Pathol. 8(2):1116-1127.
22
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Daun Benalu Cengkih
Ekstraksi
Refluks Maserasi
Uji toksisitas terhadap larva udang (BSLT)
Fraksinasi
Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi etanol
Ekstrak/fraksi potensial
Uji antiproliferasi terhadap sel lestari kanker
Identifikasi senyawa dengan GC/MS pirolisis
24
Lampiran 3 Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih
Keterangan : Gambar dari kiri ke kanan = ekstrak etanol 70%, ekstrak air, fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana
Pengujian Ekstrak
Alkaloid
Dragendrof
Meyer
Wagner
25 Lampiran 3 Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih (lanjutan)
Pengujian Ekstrak
Saponin
Tanin
Triterpenoid
26
Lampiran 4 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk menentukan nilai LC50 Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.01 -1567.861 -9170.081 -666.478
0.55 1742.062 1098.160 6986.804
0.6 1914.422 1199.543 7818.665
0.65 2092.571 1303.216 8679.574
0.7 2280.312 1411.590 9587.725
0.75 2482.915 1527.798 10568.506
0.8 2708.523 1656.531 11661.323
27 Confidence Limits (lanjutan)
95% Confidence Limits for Konsentrasi Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.9 3302.377 1993.187 14540.079
0.91 3382.294 2038.322 14927.657
0.92 3469.114 2087.320 15348.743
0.93 3564.577 2141.158 15811.787
0.94 3671.194 2201.243 16328.979
0.95 3792.791 2269.721 16918.889
0.96 3935.653 2350.112 17612.018
0.97 4111.283 2448.862 18464.213
0.98 4344.752 2580.015 19597.175
0.99 3272.189 2194.766 8831.423
2. Ekstrak etanol Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.01 75.248 -1246.843 396.738
28
Confidence Limits (lanjutan)
95% Confidence Limits for Konsentrasi Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.25 1210.266 897.303 2469.062
0.3 1313.395 971.56 2777.914
0.35 1408.959 1037.575 3066.913
0.4 1499.640 1098.470 3342.888
0.45 1587.375 1156.198 3611.085
0.5 1673.719 1212.142 3875.900
0.55 1760.062 1267.413 4141.387
0.6 1847.797 1323.027 4411.699
0.65 1938.478 1380.041 4691.555
0.7 2034.042 1439.709 4986.898
0.75 2137.171 1503.711 5306.008
0.8 2252.010 1574.595 5661.737
0.85 2385.868 1656.808 6076.794
0.9 2554.293 1759.757 6599.524
0.91 2594.972 1784.554 6725.848
0.92 2639.165 1811.467 6863.107
0.93 2687.758 1841.028 7014.061
0.94 2742.028 1874.010 7182.687
0.95 2803.923 1911.586 7375.047
0.96 2876.642 1955.681 7601.095
0.97 2966.041 2009.823 7879.061
0.98 3084.882 2081.693 8248.670
0.99 3272.189 2194.766 8831.423
29 Confidence Limits
95% Confidence Limits for Konsentrasi Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.01 37.177 -7242.812 443.766
0.25 1542.499 1007.331 13571.286
0.3 1679.274 1088.602 15432.408
0.35 1806.016 1161.856 17159.070
0.4 1926.282 1230.059 18798.812
0.45 2042.641 1295.135 20386.191
0.5 2157.155 1358.501 21949.082
0.55 2271.669 1421.331 23512.510
0.6 2388.028 1484.729 25101.568
0.65 2508.294 1549.872 26744.369
0.7 2635.036 1618.175 28475.982
0.75 2771.811 1691.556 30344.994
0.8 2924.117 1772.937 32426.560
0.85 3101.647 1867.438 34853.237
0.9 3325.021 1985.904 37906.988
0.91 3378.973 2014.456 38644.623
0.92 3437.584 2045.450 39445.986
0.93 3502.030 2079.503 40327.155
0.94 3574.006 2117.504 41311.314
0.95 3656.095 2160.807 42433.790
0.96 3752.539 2211.635 43752.601
0.97 3871.105 2274.060 45373.974
0.98 4028.717 2356.947 47529.403
0.99 4277.134 2487.397 50926.815
30 Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.01 -459.285 -856.057 -233.400
0.91 1287.943 1063.370 1682.147
0.92 1318.587 1087.757 1725.021
0.93 1352.282 1114.519 1772.216
0.94 1389.914 1144.348 1824.985
0.95 1432.833 1178.300 1885.236
0.96 1483.258 1218.107 1956.108
0.97 1545.249 1266.935 2043.343
0.98 1627.656 1331.686 2159.465
31 Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
32
Confidence Limits (lanjutan)
95% Confidence Limits for Konsentrasi Probability Estimates Lower Bound Upper Bound
PROBIT 0.95 148.198 115.281 216.125
0.96 154.174 119.799 225.474
0.97 161.520 125.335 236.988
0.98 171.286 132.665 252.323
33 Lampiran 5 Analisis statistika menggunakan SPSS 16.0
1. Sel lestari kanker K562
ANOVA
Sum of
Squares df Mean Square F Sig. Jumlah_sel Between Groups 40644.381 6 6774.063 15.123 .000
Within Groups 25084.889 56 447.944
Total 65729.270 62
Means for groups in homogeneous subsets are displayed
2. Sel lestari kanker MCM-B2
ANOVA
Sum of
Squares df Mean Square F Sig. Jumlah_sel Between Groups 49223.937 6 8203.989 34.317 .000
Within Groups 13387.778 56 239.067
Total 62611.714 62
34
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Desa Banarjoyo Kecamatan Batanghari, Lampung Timur, pada tanggal 10 Agustus 1989. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara, dari pasangan Maryoto dan Rukidah. Penulis menempuh pendidikan sarjana di Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan MIPA, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan (FKIP) Universitas Lampung dan lulus tahun 2011. Penulis sempat bekerja sebagai staf pengajar kimia di SMK Muhammadiyah Sekampung Lampung Timur dan IPA Terpadu di SMP Muhammadiyah Sekampung Lampung Timur.
