1 BAB I
PENDAHULUAN
Glutation S-transferase (GST) merupakan sekelompok enzim yang memiliki peran utama sebagai katalis enzimatik pada detoksifikasi senyawa elektrofilik, yang sering bersifat sitotoksik, mutagenik, dan karsinogenik, melalui konjugasi dengan glutation (Josephy dkk, 1997; Mannervik dan Danielson, 1988). GST terdiri dari 6 kelas enzim sitosolik yaitu kelas alpha, mu, pi, theta, sigma dan zeta, dan 2 kelas GST yang terikat membran yaitu GST kelas kappa dari mitokondria dan GST mikrosomal (Morgenstern dan DePierre, 1983; Mannervik dkk, 1985; Meyer dan Thomas, 1995; Meyer dkk, 1991; Board dkk, 1997;Pemble dkk, 1996).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST berlebihan, sebagai contoh GST kelas pi sering dapat digunakan sebagai petunjuk adanya tumor. Pada tikus, enzim ini diekspresikan cukup tinggi pada preneoplastik nodul dan hepatoseluler karsinoma dibandingkan pada hati normal. Hal yang sama juga ditunjukkan pada tumor hepatik manusia (Van Bladeren dan Van Ommen, 1991). Dalam banyak kasus juga ditemukan peningkatan isoenzim kelas pi pada jaringan kanker payudara jauh lebih tinggi dibanding jaringan payudara normal pada pasien yang sama (Kelley dkk, 1994). Dilaporkan juga terjadinya ekspresi berlebih GST kelas pi pada kanker nasofaring (Jayasurya dkk, 2002). Pada tumor paru, dilaporkan juga terjadinya peningkatan berlebihan GST kelas mu (Black dan Wolf, 1991).
obat sitostatik tersebut diberikan bersama-sama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor GST, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat. Sebagai contoh adalah indometasin, obat antiinflamasi yang juga bersifat sebagai inhibitor GST, yang dikombinasi dengan klorambusil, maka akan terjadi peningkatan efektivitas klorambusil pada terapi jenis kanker tertentu (Hayes dan Pulford, 1995).
S
enyawa-senyawa fenol dalam tanaman (asam elegat, asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat) dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap enzim GST dengan substrat 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984). Senyawa flavonoid, yang juga merupakan senyawa fenol (fisetin, myricetin, kaempferol, quercetin, baicalein, quercitrin, chrysin, baicalin, morin, rutin, apigenin) dilaporkan juga dapat menghambat secara in vitro aktivitas enzim GST dengan substrat CDNB (Iio dkk, 1993).Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid, tanin dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
23 DAFTAR PUSTAKA
Backer, C.A. and Brink, B.R.C., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), Vol. III, NVP
Board, P.G., Baker, R.T., Chelvanayagam, G., and Jermin, L.S., 1997, Zeta, a novel class of glutathione transferases in a range of species from plants to human, Biochem. J., 328, 929-935.
Black, S.M. and Wolf, C.R., 1991, The role of glutathione-dependent enzymes in drug resistance, Pharmacol. Ther., 51, 139-154.
Commandeur, J.N.M., Stijntjes, G.J., and Vermeulen, N.P.E., 1995, Enzymes and transport systems involved in the formation and disposition of glutathione S-conjugates, Pharmacol. Rev., 47, (2), 271-330.
Clark, A.G., Smith, J.N., and Speir, T.W., 1973, Cross specificity in some vertebrate and insect glutathione-transferases with methyl parathion (dimethyl p-nitrophenyl phosphorothionate), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and S-crotonyl-N-acetylcystea-mine as substrates, Biochem. J., 135, 385-392.
Das, M., Bickers, D.R., Mukhtar, H., 1984, Plant Phenols as in vitro inhibitors of glutathione S-transferase, Biochem. Biophys. Res. Comm., 120, (2), 427-433.
Einbond, L., Reynertson, K.A., Luo, X. D., Basile, M.J., Kennely, E.J., 2004, Anthocyanin Antioxidants From Edible Fruits, Food Chem., 84, 23-28.
Habig, W.H., Pabst, M.J., and Jakoby, W.B., 1974, Glutathione S-transferase, the first enzymatic step in mercapturic acid formation, J. Biol. Chem., 249, (22), 7130-7139.
Hayes, J.D. and Pulford, D.J., 1995, The glutathione S-transferases supergene family : regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance, Crit. Rev. in Biochem. and Mol. Biol., 30 (6), 445-600.
Hsieh, CC.H., Liu, L.F., Tsai, S.P., and Tam, M.F., 1999, Characterization and cloning of avian-hepatic glutathione S-transferases, Biochem. J., 343, 87-93.
Igarashi, T., Satoh, T., Iwashita, K., Ono, S., Ueno, K., and Kitagawa, H., 1985, Sex difference in subunit composition of hepatic glutathione S-transferases in rats, J. Biochem., (Tokyo), 98, 117-123.
Iio, M., Kawaguchi, H., Sakoto, Y., Otonari, J., and Nitaha, H., 1993, Effects of polyphenols, including flavonoids, on glutathione S-transferases and glutathione reductase, Biosci. Biotech, Biochem., 57, (10), 168-160.
Jayasurya, A., Yap, W.M., Tan, N.G., Tan, B.K.H., and Bay, B.H., 2002, Glutathione S-transferases π expression on nasopharyngeal cancer, Arch Otolaryngol Head Neck Surg., 128, 13961399.
Josephy, P.D., Mannervik, B., Montellano, P.O., 1997, Molecular Toxicology, p.158-170, Oxford University Press, New York.
Kelley, M.K., Engqvist-Goldstein, A., Montali, J.A., Wheatly, J.B., Schmidt Jr., D.E., and Kauvar, L.M., 1994, Variability of glutathione S-transferases isoenzyme patterns in matched normal and cancer human breast tissue, Biochem. J., 304, 843-848.
Khotimah, Khusnul D.S. ,2004. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kloroform dan Metanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora. L.) Terhadap Staphyloccus Aureus,Shigella Dysentriae dan Escherichia Coli, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta: Surakarta
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagen, J. Biol. Chem., 193, 265-275.
Lundgren, B., Meijer, J. and DePiere, J.W., 1987, Characterization of the induction of cytosolic and microsomal epoxide hydrolases by 2-ethylhexanoic acid in mouse liver, Drug Metab.Dispos., 15, 114-121.
Mannervik, B., Alin, P., Guthenberg, C., Jensson, H., Tahir, M.K., Warholm, M., and Jornvall, H., 1985, Identifiction of three classes of cytosolic glutathione transferases common to several mammalian species: Correlation between structural data and enzymatic properties, Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A, 82, 7202-7206.
Mannervik, B. and Danielson, U.H., 1988, Glutathione transferases-stucture and catalytic activity, CRC Crit. Rev. Biochem., 23, 283-337.
25 Meyer, D.J. and Thomas, M., 1995, Characterization of rat spleen
prostaglandin H D-isomerase as a sigma class GSH transferase, Biochem. J., 311, 739-742.
Morgenstern, R. and DePierre, J.W., 1983, Microsomal glutathione transferase, purification in unactivated form and further characterization of the activation process, substrate specificity and amino acid composition, 1983, Eur. J. Biochem., 134, 581-593.
Pemble, S.E., Wardle, A.F., and Taylor, J.B., 1996, Glutathione S-transferase class Kappa: characterization by the cloning of rat mitochondrial GST and identification of a human homologue, Biochem. J., 319, 749-754.
Ploemen, J.H.T.M., Van Ommen, B., and Van Bladeren, P.J., 1990, Inhibition of rat and human glutathione S-transferase isoenzymes by ethacrynic acid and its glutathione conjugate, Biochem. Pharmacol., 40, (7), 1631-1635.
Van Bladeren, P.J. and Van Ommen, B., 1991, The inhibition of glutathione S-transferases: mechanisms, toxic consequences and therapeutic benefits, Pharmacol. Ther., 51, 35-46.
Van der Aar, E.M., 1997, Structure-activity relationship and active site characterization of glutathione S-transferase, Ph.D Thesis, Division of Molecular Toxicology, Department of Pharmacochemistry, LACDR-Vrije Universiteit, Amsterdam.
Utami, W., Da’i, M., Sofiana, Y.S., 2005. Uji Aktivitas Penangkap Radikal dengan Metode DPPH serta Penetapan Kandungan Fenol dan Flavonoid dalam Ekstrak Kloroform, Ekstrak Etil Asetat, Ekstrak Etanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.), Pharmacon, 6, (1), 5-9..
Utami, W., 2007, Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.) terhadap Aktivitas Glutation S-Transferase Ginjal Tikus secara In Vitro dengan Substrat 1–Kloro-2,4-Dinitrobenzen, Laporan Penelitian Reguler LP2M UMS, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.) TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
RINGKASAN
Glutation S-Transferase (GST) merupakan suatu famili enzim multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi (Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST berlebihan. sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid, tanin dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
iv asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat.. Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari kecepatan pembentukan produk konjugat GSH dan substrat, secara spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
0
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak DaunDewandaru
Ekstrak
100 0,125 75,88 30,14
150 0,083 50,38 53,57
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan. Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak ini kemungkinan karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk., 1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat memberikan aktivitas yang berbeda pula.
vi ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST) have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin (BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
PRAKATA Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.) TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. 3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
viii
DAFTAR LAMPIRAN……….. xii
BAB I. PENDAHULUAN……… 1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA……… 3
1.Glutation (GSH)……… 3
2.Glutation S-Transferase ……….. 4
3.GST dan resistensi obat antikanker……… 5
4.Manipulasi GST pada sel tumor………. 6
5.Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………. 6
6.Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)……… 6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN……… 9
1.
Tujuan Penelitian……….… 92. Manfaat Penelitian……… 9
BAB IV. METODE PENELITIAN……….……… 10
1. Rancangan Penelitian……….. 10
2. Variabel Penelitian………... 10
3. Bahan dan Alat ………... 10
4. Jalannya Penelitian……….. 11
a. Penyiapan simplisia daun dewandaru. ………. 11
b. Pembuatan ekstrak daun dewandaru ………... 11
d. Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ... 12
e. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus………... 13
f. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ………... 14
5. Cara Analisis………. 14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………... 15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru………. 15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus……….... 16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………. 18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus... 19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru... 20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……… 27
A. Kesimpulan………... 27
B. Saran………... 27
DAFTAR PUSTAKA………. 28
LAMPIRAN……… 31
x Halaman Tabel 1. Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ... 17 Tabel 2. Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus... 18 Tabel 3. Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus... 22 Tabel 4. Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
Tikus... 23
Halaman
Gambar 1. Struktur Glutation (GSH) ………... 3
Gambar 2. Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)... 7
Gambar 3. Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB... 7
Gambar 4. Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB)... 8
Gambar 5. Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB... 8
Gambar 6. Skema Ekstraksi Daun Dewandaru... 13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST dengan Substrat CDNB ... 21
Gambar 8. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST dengan Substrat DCNB ... 21
xii Halaman Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)…… 31
Lampiran 2. Data Perhitungan Rendemen………. 32
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA………... 33
Lampiran 4. Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...………. 34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB……… 35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.) TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
ii HALAMAN PENGESAHAN
LAPORAN HASIL PENELITIAN DOSEN MUDA
1. Judul Penelitian : Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.) terhadap Aktivitas Glutation S-Transferase Paru Tikus secara in Vitro
2. Bidang Ilmu Penelitian : MIPA/Farmasi
3. Ketua Peneliti
a. Nama lengkap : Wahyu Utami, S.Si., M.Si., Apt b. Jenis Kelamin : P
c. NIK : 875
d. Pangkat/Golongan : Penata Muda / IIIa
e. Jabatan : Asisten Ahli
f. Jabatan Struktural : Dosen
g. Fakultas/Jurusan : Farmasi
4. Jumlah Tim Peneliti : 1 Orang
5. Lokasi Penelitian : Lab. Ilmu Hayati UGM
Lab. Kimia Instrumen Farmasi UMS
6. Waktu Penelitian : 8 bulan
7. Biaya : Rp. 10.000.000,00
Surakarta, September 2008 Mengetahui, Ketua Peneliti, Dekan Fakultas Farmasi
Dra. Nurul Mutmainah, M.Si.,Apt Wahyu Utami, S.Si.,M.Si.,Apt
NIK. 831 NIK. 875
Menyetujui,
Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat Universitas Muhammadiyah Surakarta
RINGKASAN
Glutation S-Transferase (GST) merupakan suatu famili enzim
multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan
senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat
digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi
(Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer
dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST berlebihan.
sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya
akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru
dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor
GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk
flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat
1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun
dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat
CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
Penelitian dilakukan dengan fraksi sitosol paru tikus sebagai sumber GST
iv asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat..
Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari kecepatan pembentukan produk konjugat GSH dan substrat, secara
spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan
dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas
GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak
dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu
konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru
tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
0
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan
etanol daun dewandaru mampu menghambat GST. Ekstrak kloroform mempunyai
nilai IC50 yang paling kecil, ini menunjukkan bahwa potensi penghambatannya
besar. Ekstrak kloroform mempunyai potensi penghambatan yang paling besar
jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetat maupun ekstrak etanol yaitu dengan
nilai IC50 77,964 µg/ml diikuti dengan ekstrak etanol (160,0135 µg/ml) dan
ekstrak etil asetat (299,305 µg/ml) (Tabel 1). Menurut Iio dkk., (1993) senyawa
flavonoid terbukti mampu menghambat aktivitas GST pada liver tikus secara in
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan
tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak DaunDewandaru
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan.
Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak ini kemungkinan
karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid
yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena
kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun
telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk.,
1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan
jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat
memberikan aktivitas yang berbeda pula.
Lebih lanjut dari hasil penelitian ini, dapat dimungkinkan bahwa ekstrak
daun dewandaru dapat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas obat sitostatik
vi ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST) have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin (BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of
remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB
as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
PRAKATA Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas
segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA
HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan
senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai
kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker
untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan
berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu
Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh
dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
viii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL………. i
HALAMAN PENGESAHAN………... ii
RINGKASAN……… iii
DAFTAR LAMPIRAN……….. xii
BAB I. PENDAHULUAN……… 1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA……… 3
1.Glutation (GSH)……… 3 2.Glutation S-Transferase ……….. 4
3.GST dan resistensi obat antikanker……… 5
4.Manipulasi GST pada sel tumor………. 6
5.Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………. 6
6.Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)……… 6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN……… 9
1.
Tujuan Penelitian……….… 92. Manfaat Penelitian……… 9
BAB IV. METODE PENELITIAN……….……… 10
1. Rancangan Penelitian……….. 10
2. Variabel Penelitian………... 10
3. Bahan dan Alat ………... 10
4. Jalannya Penelitian……….. 11
a. Penyiapan simplisia daun dewandaru. ………. 11
c. Penyiapan fraksi sitosol paru tikus…...
d. Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ...
11
12
e. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus………... 13
f. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ………... 14
5. Cara Analisis………. 14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………... 15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru………. 15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus……….... 16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………. 18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus... 19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru... 20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……… 27
A. Kesimpulan………... 27
B. Saran………... 27
DAFTAR PUSTAKA………. 28
x DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ... 17
Tabel 2. Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus... 18
Tabel 3. Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak DaunDewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus... 22
Tabel 4. Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak DaunDewandaru pada
Konjugasi GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur Glutation (GSH) ………... 3
Gambar 2. Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)... 7
Gambar 3. Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB... 7
Gambar 4. Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB)... 8
Gambar 5. Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB... 8
Gambar 6. Skema Ekstraksi Daun Dewandaru... 13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST dengan Substrat CDNB ... 21
xii DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)…… 31
Lampiran 2. Data Perhitungan Rendemen………. 32
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA………... 33
Lampiran 4. Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...………. 34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB……… 35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
