Pembuatan pepton dari bungkil kedelai dan limbah bir dengan enzim papain untuk media pertumbuhan bakteri

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

PEMBUATAN PEPTON DARI BUNGKU, KEDELAI DAN

LIMBAH BIR DENGAN ENZIM PAPAIN

UNTUK

MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI

OLEH

:

FACHRANIAH

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(90)

ABSTRAK

FACHRANIAH. Pembuatan Pepton dari Bungkil Kedelai dan Limbah bir dengan Enzim Papain Untuk Media Pertumbuhan Bakteri.. Di bawah bimbingan DEDI FARDIAZ dan TAM1 IDIYANTI.

Penelitian ini dilakukan dalam rangka memanfaatkan bungkil kedelai dan limbah pengolahan bir menjadi produk pepton untuk media pertumbuhan bakteri. Proses pembuatan pepton dilakukan dengan reaksi hidrolisis menggunakan papain kasar hasil produksi lokal.

Kondisi proses hidrolisis untuk masing-masing bahan

baku

ditenhlkan

seana

bertahap at& h t a n , dimulai dengan konsentiasi substrat, konsentrasi enzim, suhu, pH awal, dan waktu reaksi. Parameter penentu kondisi proses adalah jumlah kenaikan protein terlmt optimum yang ditentukan dengan metode spektrofotometri. Aktivitas enzim papain kasar yang digunakan sebesar 1164 unit. Unit didefinisikan sebagai jumlah pg tirosin yang tdentuk dari substrat kasein 1% pada suhu 40 OC, pH

6.5, dan inkubasi selama 5 menit. Karakteristik enzim memiliki nilai Vrn sebesar

2000unit dan nilai

Km

sebesar 0.8%. Kondisi proses hidrolisis untuk bungkil kedelai adalah : [S] = 3.7-

[El

= 0.4% suhu 60 OC, pH 6.2-6.3, dan waktu 5 jam. Kondisi

proses untuk limbah

bi

adalah: [S] = 4.76%, [El = 0.2%, suhu 60 OC, pH 5.8-5.9, dan

waktu 5 jam.

Rendemen hasil pepton bungkil kedelai didapatkan sebanyak 12.1% sedangkan pepton limbah bir sebesar 18.9%. Karakteristik pepton bungkil kedelai memiliki kelarutan 97.6%, N total 7.33, N amino 1.94, dan rasio ANlTN sebesar 26.47%,

sedangkan pepton limbah bir memiliki kelarutan 98.5%,

N

total 10.21, N amino 2.82

dan rasio A N m sebesar 27.62%. Pola kromatografi pada kolom kromatograti filtrasi gel

dari

kedua pepton yang dihasilkan, menunjukkan dalam waktu 5 jam sudah dihasilkan campuran peptida dengan berat molekul kecil lebih banyak sehingga dapat dimanfmtkan sebagai campuran media perhmbuhan bakteri. Karakteristik pepton yang dihasilkan dibandingkan dengan pepton standar yaitu Bacto peptone Difco dan Soy peptone Scharlau.

Efektivitas pepton terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Streptococcus aureus, dan Bacillus subtilis diamati melalui kurva pertumbuhan bakteri selama 24

(91)

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :

PEMBUATAN PEPTON DARI BUNGKIL KEDELAI DAN

LIMBAH BIR DENGAN ENZIM PAPAIN UNTUK MEDIA

PERTUMBUHAN BAKTERI

Adalah benar hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor, Mei 2002

FACHRANIAH

(92)

PEMBUATAN PEPTON DARI BUNGKIL KEDELAI DAN

LIMBAH BIR DENGAN ENZIM PAPAIN UNTUK

MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI

FACHRANIAH

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleb gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Pangan

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(93)

Judul Tesis : Pembuatan pepton dari bungkil kedelai dan limbah bir

dengan enzim papain untuk media pertumbuhan bakteri

Nama : Fachraniah

NBP

_:₉₉₂₁₁

Program Studi : Ilmu pangan

Menyetujui,

- - 1. Komisi Pembimbing

Ketua

Meneetahui. _"

2. Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Prof. Dr. Ir. B. ri Laksmi Jenie. MS.

(94)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Banda Aceh pada tanggal 26 Juli 1961 sebagai putri ke tujuh

dari bapak Tgk. H. Ahmad Abdullah (alm) dan ibu Hj. Hamdiah. Pendidiian sajana

ditempuh di j w s a n Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Teknologi Bandung, lulus pada tahun 1987. Kesempatan untuk melanjutkan

ke Program Magister Sains pada program studi Ilmu Pangan Institut Pertanian Bogor

diperoleh dengan beaskwa dari BPPS pada tahun 1999.

Penulis bekexja sebagai staf pengajar pada jurusan Teknik Kimia, Politeknik

Negeri Lhokseumawe, Aceh Utara sejak tahun 1987 sampai sekarang.

Penulis menikah dengan Ariefin pada tahun 1988 dan saat ini sudah memiliki dua

orang putra (Arifan Adha, 13 tahun dan Anizal Fachri, 10 tahun) dan seorang putri

(95)

PRAKATA

Puji dan syukur dipersembahkan kepada Allah SWT atas segala kekuatan dan

kemampuan yang diberikan kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Penelitian dilaksanakan sejak bulan Mei 2001 sampai Februari 2002 dengan biaya dari DIP P2K, LIPI- PUSPIPTEK- SERPONG, berjudul Pembuatan Pepton dari

Bungkil kedelai dan Limbah bir dengan Enzim Papain Untuk Media Pertumbuhan

Bakteri.

Untuk hasil karya ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada

Prof

Dr. Ir.

Dedi Fardiaz, MSc. dan Dra. Tami Idiyanti, MSc. yang telah memberikan bimbingan,

dorongan semangat, arahan, dan saran yang bermanfaat sejak awal penelitian sampai

pada tahap penyempurnaan tesis ini. Demikian juga kepada lembaga yang

memberikan beasiswa selama studi di S2 (BPPS), P2K LIPI atas semua bahan Eimia

dan fasilitas penelitian, serta Pemda NAD dan Yayasan Supersemar yang telah

membantu menambah dana penelitian. Terima kasih disampaikan juga kepada suami

tercinta, Ariefin dan anak-anakku tersayang Ifan, Aris, dan Rifa, atas ketulusan hati,

kesabaran dan pengorbanan waktu untuk tidak bersama dengan penulis, serta kasih

sayangnya yang menjadikan semangat bagi penulis dalam menyelesaikan studi di S2

IPB. Untuk ayabanda dan bunda serta kakak-kakak tercinta, atas doa dan

perhatiannya yang menyadarkan penulis untuk selalu menjadi orang yang berguna

dan berhdsil karya. Teman-teman di IPN angkatan '99 dan '00 khususnya Farid dan

Mira serta Siti dan Dedin yang dapat menjadi teman dalam segala kondisi. Yuyus,

(96)

selama penelitian berlangsung. Tidak lupa, terima kasih disampaikan kepada pihak

lainnya yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan tugas akhir.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan karya ilmiah ini sehingga kritik dan saran akan diterima dengan tangan terbuka, akhir kata penulis

berharap tesis ini dapat bermanfaat dalam mengembangkan alternatif produk pangan.

Bogor, Mei 2002

(97)

DAFTAR IS1

Halaman

DAFTAR TABEL ... vii

...

DAFI'AR GAMBAR ... Vlll DAFTAR LAMPIRAN ... X

TINJAUAN PUSTAKA

.

A Hidrolisis Protein ... 3 B

.

Protein Kedelai ... 8

.

C Pepton ... 12

.

D Protease Papain ... 13

.

E Khamir ... 17

METODOLOGI ... 21

HASIL DAN PEMBAHASAN

A . Aktivitas Enzim Papain

...

31 B

.

Komposisi Bahan Baku

...

32

C

.

Pemilihan Kondisi Hidrolisis

...

33 D . Produksi Pepton

...

42

E . Karakterisasi Produk

...

44

...

F . Pola Kromatografi Pepton Pada Kolom Filtrasi Gel 47

...

G

.

Efektivitas Pepton Terhadap Pertumbuhan Bakteri 49

KESIMPULAN DAN SARAN

...

52

(98)

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Profil berat molekul hidrolisat protein pada penggolongan yang

berbeda ... 6

2 Komponen protein globulin kedelai ... 9

3 Komposisi rata-rata ekstrak khamir bir ... 18

...

4 Analisis proksimat beberapa autolisat khamir komersial 20

5 Komposisi kimia bungkil kedelai ... 32

6 Komposisi kimia limbah bir ... 32

(99)

DAFTAR GAMBAR

Skema hidrolisis enzimatis protein terdenaturasi ... Mekanisme reaksi hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim papain

.

Diagram tahapan penelitian

...

Diagram pembuatan pepton

...

Aktivitas enzim papain pada substrat kasein

...

Hubungan laju reaksi enzim terhadap substrat kasein ...

Kenaikan protein terlarut pada substrat bungkil kedelai ...

... Kenaikan protein terlarut pada substrat limbah bir

Hubungan laju reaksi enzim papain dan substrat bungkil kedelai

..

Hubungan laju reaksi enzim papain dan substrat limbah biu ... Kenaikan protein terlarut terhadap konsentrui enzim untuk

...

substrat bungkil kedelai

Kenaikan protein terlarut terhadap konsentrasi enzim untuk ... substrat limbah bir

Rasio substrat dan enzim untuk bungkil kedelai ... Rasio substrat dan enzim untuk limbah bir ...

Kenaikan protein terlarut terhadap suhu hidrolisis bungkil ... kedelai

Kenaikan protein terlarut terhadap suhu hidrolisis limbah bir

...

Kenaikan protein terlarut terhadap pH bungkil kedelai

...

Kenaikan protein terlarut terhadap pH limbah bii

...

Kenaikan protein terlarut terhadap waktu hidrolisis bungkil kedelai ...

(100)

20 Kenaikan protein terlarut terhadap waktu hidrolisis limbah bir

....

21 Pola kromatografi filtrasi gel pepton bungkil kedelai dan limbah bir

...

22 Pertumbuhan E

.

coli pada beberapa media pepton

23 Pertumbuhan S

.

aureus pada beberapa media pepton ...

24 Pertumbuhan B

.

subtilis pa& beberapa media pepton

...

(101)

DAFTAR LAMPIRAN

... 1 Spesifikasi papain kasar produk lokal

2 Penentuan aktivitas papain dengan metode Bergmeyer (1983) ...

3 Kuwa smdar protein ...

4 Hasil uji kenaikan protein terlarut pada

. .

penentuan kondisi proses hidrol~s~s ...

5 Data perturnbuhan bakteri pada beberapa media pepton ...

(102)

PENDAHULUAN

Latar belakang

Nitrogen adalah salah satu unsur utarna yang diperlukan untuk pertumbuhan

mikroorganisme. Sumber nitrogen tersebut dapat diperoleh dari senyawa organik dan

anorganik. Protein, pepton, dan asam amino seringkali digunakan dalam media

mikrobiologi. Banyak media kompleks yaitu media yang komposisi kimianya tidak

semua diketahui

serarn

_{spesifik mengandung pepton}_sebagai_{s " m k}_nitrogen._Pepton

adalah hidrdisat protein yang dibentuk dengan penghancuran enzimatis atau asam.

Kasein sangat sering digunakan sebagai substrat protein membentuk pepton, namun

substansi lainnya sejmti tepung kedelai juga seringkali digunakan.

Di Indonesia saat ini pepton masih diimpor dengan harga

ti&.

Laporan Biro Pusat Statist* (1998) menunjukkan bahwa impor pepton dan tunmamya untuk tahun

1997 mencapai 1.602.415 kg dengan nilai $ 3.362.761 US. Dilaporkan pula impor pepton dari bulan Juni hingga Agustus 1998 mencapai 862.123 kg dengan nilai $

3.759.272 US, dengan demikian dirasa periu untuk mengembangkan kemampuan

penelitian pembuatan pepton dengan memanfaatkan bahan, terutama limbah

berprotein tinggi.

Bungkil kedelai dan limbah pengolahan bir yang sebagian besctr adalah khamir

mengandung protein tinggi. Bungkil kedelai adalah sisa dari proses ekstraksi minyak

kedelai, kadar proteinnya sekitar 40% (Fardiaz & Yasni, 1998), sedangkan limbah

bi

(103)

dimanfaatkan sebagai sumber bahan baku pembuatan pepton yang nilai ekonominya

jauh lebih tinggi.

Papain adalah enzim kelompok hidrolase yang dapat mengkatalisis reaksi-reaksi

hidrolisis suatu substrat protein. Enzim protease ini pemakaiannya semakin luas

mulai dari industri makanan, kulit, deterjen, kosmetik, sampai farmasi. Papain dapat

diperoleh dari getah tanaman pepaya (Carica papaya LINN). Di Indonesia pepaya

tumbuh subur di seluruh wilayah nusantara.

Getah

dari buah pepaya sangat potensial sebagai penghasil enzim papain karena daya proteolitiknya yang tinggi dibandingkan

dari getah batang dan daunnya (Muhidin, 2000). Pusat Penelitian Kimia PUSPIPTEK

Serpong saat ini sudah dapat mengisolasi enzim papain kasar dengan aktivitas

proteolitik lebih tinggi dari standar produk Sigma. Atas dasar pemanfaatan limbah

dan enzim yang tnrsedia maka penelitian ini dilaksanakan.

Tujuan penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

1. Mendapatkan teknologi proses pembuatan pepton dari bungkil kedelai dan limbah

bir oleh enzim papain,

2. Mempelajari pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu, pH, dan

waktu terhadap proses hidrolisis protein bungkil kedelai dan limbah bir dengan

papain,

3. Membandingkan kualitas pepton yang dihasilkan terhadap pepton standar atau

(104)

TINJAUAN PUSTAKA

A. Hidroliiis protein

Hidrolisis protein pangan dilakukan untuk berbagai tujuan, yaitu memperbaiki

karakteristik nutrisi, menghambat kerusakan, memberi tekstur, meningkatkan atau

menurunkan kelmtan, menambah sifat pembusaan dan koagulasi, menambah

kapasitas emulsi, mencegah interaksi yang tidak diinginkan, menghilangkan of-

flavor d m bau, dan menghilangkan r a m atau bahan-bahan penghambat (Lahl &

Brauq 1994). Menurutnya hidrolisat prdein sebagai bahan pangan dibagi ke dalam

tiga generasi. Generasi pertama, hidrolisat kasein formula hipoalergenik yang sudah

dipasarkan selama lebih dari 40 tahun, dengan karakteristik 70% mol komposisi asam

amino bebas dan peptidanya tersusun oleh lebih dari 8 asam amino. Generasi kedua,

hidrolisat protein whey dengan 4040% mol asam amino dan peptidanya tersusun

-

oleh lebih dari '12 asarn amino, sudah dipasarkan lebih dari 10 tahun. Generasi ketiga,

hidrolisat protein whey yang didapat beberapa tahun yang laly dengan karakteristik

kurang dari 20% asam amino bebas dan peptidanya tersusun lebih dari IS asam

amino

Menurut Fennema (1996), hidrolisis protein pangan menggunakan protease dapat

mengubah sifat-sifat fbngsional protein asalnya. Sifat fungsional protein didefinisikan

sebagai sifat fisik dan kimia yang mempengmhi perilah protein dalam sistem

pangaxi selama proses pengolahan, penyimpanan, persiapan, dan pemakaian.

Hidrolisis secara luas oleh protease non spesifik seperti papain menyebabkan

(105)

mengandung peptida dengan berat molekul rendah, terdiri dari lebih h a n g 2 atau 4

sekuen asam amino. Giese (1994) menyebutkan protease mengkatalisis pemutusan

ikatan peptida dan menghasilkan unit molekul lebih kecil atau peptida-peptida, dan

unit-unit yang lebih kecil akan lebih mudah larut. Kelarutan suatu peptida dianggap

sebagai proporsi nitrogen yang terkandung dalam produk protein yang terlarut dalam

kondisi spesifik. Kelaiutan protein adalah sifat fingsional pertama yang biasanya

ditentukan selama pengembangan dan uji bahan pangan protein baru (Zayas, 1997).

Kilara et al. (1996) menyatakan, kelarutan merupakan indikasi perubahan struktur

protein dan penggunaan istilah "kelarutan" digunakan dalam literatur protein pangan

sebagai kriteria untuk menentukan perubahan konformasi protein. Secara umum

diakui bahwa protein dengan nilai kelarutan tinggi mengindikasikan protein yang

serbaguna dan potensial dalam sistem pangan.

Ada 3 perubahan yang terjadi pada hidrolisis ikatan peptida yaitu kenaikan jumlah

gugus terionisasi COO-) sehingga produk lebih bersifat hidrofilik, penurunan

ukuran molekul rantai polipeptida sehingga sifat antigenisitas menurun tajam, dan

perubahan struktur molekul membentuk stmktur hidrofobik yang terbuka terhadap

lingkurlgan berair (Mahmoud, 1994). Zayas (1 997) menyatakan ha1 yang sarna yaitu,

hidrolisis ikatan peptida dalam protein dapat meningkatkan jumlah gugus bermuatan

dan sisi hidrofilik karena membukanya molekul protein, umumnya meningkatkan

kelarutan dan menurunkan viskositas dan diamati dengan meningkatnya derajat

hidrolisis. Dasar proses hidrolisis enzimatis adalah pemutusan ikatan peptida oleh

enzim dengan bantuan air, secara kimiawi digambarkan sebagai berikut (Peterson,

(106)

Konsep modifikasi protein secara enzimat is bukanlah ha1 yang baru, perolehan

kembali (recovery) protein dari bahan sisa atau limbah protein hewan sudah

mengalami perkembangan yang tinggi (Cowan, 1983).

Berlangsungnya proses hidrolisis diukur dengan rasio ANITN, jumlah amino

nitrogen yang ada dalam hidrolisat relatif terhadap jumlah nitrogen total dalam

substrat (Lahl & Braun, 1994). AN ditentukan dengan titrasi formaldehid dan

TN

ditentukan dengan kjeldahl. Pernyataan yang sama dinyatakan oleh Mahmoud (1994)

bahwa derajat hidrolisis atau pemutusan ikatan peptida yang terjadi pada protein

dapat digambarkan oleh rasio amino nitrogen dan total nitrogen atau persen ikatan

peptida yang terputus. Derajat hidrolisis digunakan dalam mengontrol proses

sehingga dapat menentukan dengan jelas sifat-sifat hidrolisat seperti kelmtan, sifat

kngsional dan rasa (j'hvor). Sifat fbngsional intrinsik seperti viskositas, pembusaan

dan emulsifikasi protein dapat dioptimasi dengan mengontrol proses (Peterson,

1981). Ukuran rantai polipeptida yang dihasilkan dapat divariasikan dengan mengatur

rasio enzim terhadap substrat dan mengubah-ubah waktu hidrolisis.

Mahmoud (1994) melaporkan sifat-sifat fisikokimia dan sifat fbngsional hidrolisat

protein pada produk-produk nutrisi. Hidrolisat protein yang digunakan dalam

formulasi nutrisi umumnya dibagi atas dua kategori, yaitu hidrolisis sebagian

dpartiaZ) dan hidrolisis secara keseluruhan (extensive). Masing-masing produk

memiliki sifat-sifat yang berbeda, yang mempengaruhi penggunaannya pada produk

akhir. Penggolongan hidrolisat protein berdasarkan berat molekul fraksi yang

(107)

Tabel 1. Profil berat molekul hidrolisat protein pada penggolongan yang berbeda*

Seleksi enzim atau campuran enzim seringkali menjadi dasar kemampuan

hidrolisis substrat menjadi produk yang diinginkan &ah1 & Braun, 1994). Untuk

formula terhidrolisis tinggi, rasio ANtTN umumnya 50 atau lebih besar, bahkan

untuk formula tertentu membutuhkan nilai AN/TN lebih besar dari 60. Larutan enzim

murni terbatas kapasitas hidrolisisnya, contohnya larutan enzim tanaman memiliki

batasan derajat hidrolisis dengan nilai rasio AN/TN maksimum sekitar 35. Daerah

yang lebar dari hidrolisat terhidrolisis sebagian didefinisikan dengan rasio ANITN yang bervariasi antara 2-67%.

Sifat fbngsional hidrolisat protein dipengaruhi oleh spesifisitas enzim proteolitik

yang digunakan, sifat fisik dan kimia protein bahan baku, dan kondisi hidrolisis.

Protease digolongkan menurut spesifisitas ikatan peptida yang diserangnya dan

mekanisme aksinya. Protease adalah enzim yang memiliki aktivitas endo-peptidolitik

yaitu memutuskan ikatan peptida di dalam rantai polipeptida protein. Stauffer (1989)

menyebutkan bahwa protease tidak akan menghidrolisis ikatan peptida jika gugus R

memiliki gugus amino bebas (gugus N terminal) atau jika R memiliki gugus karboksil (dalton)

< 500

>5000

(108)

bebas (gugus C terminal). Papain adalah protease sistein yang memiliki range pH dan

spesifisitas yang lebar.

Pada protein yang terdiri atas 20 asam amino yang berbeda, ada 380 ikatan peptida

yang berbeda yang dapat dibuat oleh protein dan dapat menjadi sasaran aksi enzim.

Enzim tertentu hanya memutuskan ikatan tertentu yang secara fisik cocok dengan

enzim. Pada protein alami (native), ikatan seringkali dilindungi dalam struktur tiga

dimensi dan hal ini dapat menghambat proses hidrolisis (Peterson 1981). Interaksi

kompleks antara sifat substrat dan sifat enzim dalarn hubungannya dengan pH,

temperatur, dan tujuan produk akhir menunjukkan bahwa kondisi proses hidrolisis

adalah spesifik untuk substrat dan enzim tertentu (Peppler, 1982).

Proses hidrolisis protein secara enzimatis dilakukan dengan melarutkan sejurnlah

tertentu bahan berprotein ke dalarn air dan selanjutnya ditambahkan sejumlah tertentu

enzim protease. Kondisi lingkungan hidrolisis seperti pH clan suhu diatur sekai

dengan lingkungan yang cocok bagi aktivitas enzim tersebut agar aktivitas enzim

optimum. Hidrolisis dilakukan dalam waktu tertentu untuk mendapatkan produk

sesuai dengan karakteristik yang diinginkan. Untuk menghentikan proses dapat

dilakukan dengan mengatur pH dan secara bersamaan mengatur temperatur karena

sebagian enzim sensitif atau rusak terhadap panas (Cowan, 1983). Cara lain untuk

menghentikan proses hidrolisis adalah memisahkan enzim dengan membran

ultrafiltrasi. Pembuatan hidrolisat protein dengan bantuan membran ultrafiltrasi tidak

hanya untuk menghentikan proses atau memisahkan enzim, tetapi juga memberikan

distribusi normal asam amino dan peptida pendek tanpa memerlukan derajat

(109)

produk komersial adalah temperatur, waktu, pH, dan rasio ANITN. Kondisi hidrolisis

dikontrol untuk mendapatkan karakteristik produk yang spesifik seperti distribusi

asam amino, distribusi berat molekul, dan jurnlah protein residu utuh. Waktu

hidrolisis berhubungan langsung dengan rasio AN/TN, sernakin panjang waktu

hidrolisis semakin tinggi nilai AN/TN. Penentuan berat molekul menggunakan

kromatografi dengan kolom filtrasi gel memberikan korelasi positif antara ukuran

molekul dan berat molekul.

B. Protein kedelai

Protein adalah komponen yang membentuk

+

40% total padatan kedelai. Sekitar

90% protein tersebut dapat diekstraksi dengan air dan mengendap pada pH 4.5

-

4.8,

disebut: globulin kedelai (Fukushima, '1991). Berdasarkan laju sedimentasi

ultrasentrifhgasi, -globulin kedelai disusun oleh 4 komponen yaitu 2S, 7S, 1 1 S, dan

15s dan yang paling utarna adalah 7 s dan 1 1 S. Kadar nitrogen, karbohidrat, dan

komposisi asam amino globulin 7 s dan 1 1 s berbeda, hal ini mempengaruhi struktur

dan sifat fbngsionalnya, terutama karena pengaruh radikal -SH dan ikatan S-S.

Globulin 7 s tidak memiliki radikal -SH dan memiliki 2 ikatan S-S, sebaliknya

globulin 11s memiliki 2 radikal -SH dan 20 ikatan S-S. Tabel 2 menunjukkan

komponen protein globulin kedelai.

Kilara et al. (1996) menyatakan kira-kira 80% protein kedelai memiliki bobot

molekul lebih besar dari 10.000, menunjukkan struktur berorde tinggi, atau ada

interaksi antar protein. Protein 7 s dan 11s dapat membentuk ikatan disulfida

(110)

viskositas meningkat. Kedua fraksi 7 s dan 1 1 S memiliki struktur kompleks kuartener

dan kecendenlngan yang tinggi ke arah reaksi asosiasi-disosiasi. Fraksi-fraksi

tersebut memiliki kandungan a-helik rendah dan struktur utarna adalah f! antiparalel

[image:110.579.75.505.240.433.2]

dan daerah tidak teratur.

Tabel 2. Komponen protein globulin kedelai

*

1 I I

ultrasentrifbgasi

I

imunologi

I

ultrasentrifbgasi

I

imunologi

I

(x 1000)

1

Komponen protein Kadar (%)

1

Berat molekul

I

I I I I

Globulin 2s

I I I I

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju dan terjadinya hidrolisis protein secara Globulin 7s

Globulin 1 1 S

enzimatis adalah spesifisitas substrat terhadap enzim, modifikasi rantai samping asam a-konglisinin

amino substrat protein, dan struktur tiga dimensi substrat protein (Fukushima, 1991). P-konglisinin

Glisinin

Produk. yang mengandung protein kedelai umumnya diberi perlakuan panas untuk 15.0

menginaktifkan berbagai faktor antinutrisi (Kilara et al., 1996). Daya cerna protein 34.0

41.9

kedelai oleh enzim dipengaruhi oleh kondisi selarna perlakuan panas kedelai. Protein 13.8

asalnya lebih tahan terhadap proteolisis tergantung pada derajat pembukaan struktur 18-33

27.9

40.0

(unfolding) molekul substrat protein. Gambar l a dan 1 b masing-masing menu~jukkan 180-210

300-350

(111)

a. hidrolisis enzimatis protein terikat (protein native)

Catalytic s i t e

'

a Active

a

6.'

Bindinc rite

center -.

b. hidrolisis enzimatis pada molekul protein terbuka (protein terdenaturasi)

Gdmbar 1. Skema hidrolisis enzimatis protein terdenaturasi (Fukushima, 1991)

Romagnolo et al. (1990) melaporkan analisis dengan SDS-PAGE, ada dua

komponen besar dalarn protein kedelai yaitu P-konglisinin dan konglisinin.

P-

konglisinin terpisah dalam 3 spot yang diperkirakm memiliki berat molekul masing-

masing 83.2, 72.4, dm 48.4 kDa. Glisinin memiliki 2 pita polipeptida yang

diidentifikasi sebagai sub unit asarn dan basa dengan perkiraan berat molekul 38.9

dan 20.7 m a . Dilaporkan pula bahwa P-konglisinin lebih mudah terdegradasi pada

rumen sapi dari glisinin. Resistensi glisinin terhadap degradasi ruminal diduga ada

(112)

dihubungkan dengan ikatan disulfida intermolekuler dan sebagian besar bagian dalam

molekul glisinin dilindungi oleh ikatan S-S. Dijelaskan pula gabungan gaya

elektrcrstatik dan hidrofobik terlibat dalam mempertahankan struktur tersier glisinin.

De

Rm

et al. (1995) menyatakan ha1 yang sama bahwa P-konglisinin dihidrolisis

lebih cepat dari glisinin pada fermentasi Tempe dengan Rhizopus oligo~porus. Lei et

al. (1983) melaporkan hasil analisis dengan elektroforetik dua dimensi, didapatkan

protein kedelai terdiri dari glisinin (13 komponen asam, 11 komponen basa), j3-

konglisinin (6 komponen), lektin (4 komponen), clan inhibitor tripsin Kunitz.

Muchtadi (1986) menyatakan bahwa perlakuan panas pada kedelai seperti

perebusan, dapat meningkatkan daya cerna protein kedelai disebabkan oleh hilangnya

antitripsin dalarn protein kedelai. Dengan kata lain inhibitor tripsin yang terdapat

pada protein kedelai labil terhadap panas. Bungkil kedelai adalah sisa dari proses

ekstraksi minyak kedelai. Proses ekstraksi minyak kedelai yang melibatkan panas

memberi nilai positif pada protein bungkil kedelai karena bahan penghambat tripsin

rusak oleh pemanasan sehingga protein bungkil kedelai diperkirakan akan lebih

mudah terhidrolisis dibandingkan protein kedelai utuh. Santosa et al. (1998)

melaporkan komposisi kimiawi bungkil kedelai yaitu kadar air, kadar abu, kadar

lemak, kadar protein, karbohidrat, asam fitat, antitripsin masing-masing sebesar (9.3;

4.0; 1.2; 45.1; 40.4; 1.8)0/0 dan 17.7unitImg. Dilaporkan pula pH suspensi cairan

(113)

C.

Pepton

Pepton dan proteosa dijelaskan dalam terminologi sebagai bahan antara peptida

dan protein. Proteosa didefinisikan sebagai kelompok turunan protein antara protein

asal dan pepton sedangkan pepton adalah campuran larut air dari proteosa dan asam

amino tuninan albumin, daging atau susu. Sifat-sifatnya antara lain larut dalam air,

tidak terkoagulasi atau tahan terhadap panas, tetapi dapat diendapkan dengan

amonium sulfa. dm seng sulfat Pepton digunakan sebagai nutrisi media dalarn

bakteriologi (Peterson & Johnson, 1978).

Pepton dapat dibuat dari bahan yang mengandung protein melalui hidrolisis asam

atau enzimatis. Pepton memiliki kemampuan yang berbeda dalam menunjang

pertumbuhan bakteri tergantung pada jenis protein yang digunakan dan proses

pembuatannya. Bridson & Brecker (1970) menyebutkan kandungan protein bahan

b a h pembuatan pepton untuk media perhunbuhan bakteri dapat bervariasi, dari

protein hewan dengan kadar 50-90% berat kering sampai pada protein beberapa

seralia yang mengandung protein h a n g dari 1%. Dijelaskan pula pepton adalah

hidrolisat protein yang dapat dibuat dari bahan-bahan berprotein seperti daging, ikan,

kasein, gelatin, keratin, tepung kedelai, khamir, biji kapas, biji bunga matahari, dan

lain-lain. Hidrolisis enzimatis protein tersebut dapat dilakukan dengan berbagai

enzim proteolitik atau protease. Protease mengkatalisis proses hidrolisis protein

kompleks menjadi larutan campuran polipeptida, dipeptida, dan asam amino yang

secara keseluruhan disebut pepton. Komposisi kimia pepton tidak diketahui secara

tepat. Produksi pepton dalam skala besar umumnya menggunakan papain, tripsin,

(114)

dengan ketat untuk memperoleh hasil maksimal dan kualitas hidrolisat standar. Ciri

yang paling penting dari pepton bakteri adalah penarnpakannya sebagai sumber

nitrogen untuk mendukung pertumbuhan bakteri. Analisis kimia hanya dapat

digunakan sebagai penunjuk yang tepat dalam mengevaluasi karakteristik pepton.

Analisis tipikal untuk identifikasi pepton adalah total nitrogen, total nitrogen

proteosa, nitrogen proteosa primer, nitrogen asam amino bebas, dan nitrogen amino.

Bailey (1992) menyatakan bahwa protein adalah molekul besar yang biasanya

mengaadung paling sedikit 50 residu asam amino d m kadang-kadang lebih dari 100.

Ciri paling penting dari protein adalah memiliki struktur tiga dimensi yang kompleks.

Dijelaskan bahwa protein memiliki struktur primer yaitu merupakan sekuen residu

asam amino, struktur sekunder yaitu bentuk yang dihubungkan dengan struktur

spesifik dalarn molekul, d m struktur tersier yaitu keseluruhan bentuk molekul tiga

dimensi. Peptida adalah molekul yang lebih kecil, biasanya mengandung h a n g dari

50 asam amino, wnurnnya tidak memiliki

stnrktur

3 dimensi yang kompleks.

Perbedaan antara peptida dan protein kadang-kadang tidak jelas khususnya pada

ukuran molekul 15 sampai 50 residu, komponen ini disebut sebagai polipeptida.

D. Pratease Papain

Secara umum protease dapat dibagi ke dalam dua golongan yaitu proteinase dan

peptidase. Proteinase mengkatalisis hidrolisis molekul protein menjadi fiagrnen-

fiagmen besar, sedangkan peptidase mengkatalisis fragmen polipeptida menjadi asam

amino (Suhartono, 1992). Dilihat dari letak pemutusan ikatan peptida, protease

(115)

ikatan peptida yang berada di dalam rantai protein sehingga dihasilkan peptida dan

polipeptida, sedangkan eksopeptidase menguraikan protein dari ujung rantai sehingga

dihasilkan satu asam amino dan sisa peptida. Ditinjau dari lingkungan daya kerjanya,

protease dapat digolongkan menjadi protease asam (bekerja pada pH asam), protease

netral (bekerja pada pH netral), dan protease alkalis (bekerja pa& pH basa).

Berdasarkan sifat kimia dan sisi aktifnya diienal empat golongan protease, yaitu

protease serin, protease sulfhidril, protease metal, dan protease asam

(Suhartono, 1992). Protease serin adalah enzim yang mempunyai residu serin pada sisi

aktifnya dan merupakan endopeptidase, protease sulfhidril adalah enzim yang

aktivitasnya bergantung pada adanya satu atau lebih residu sulfhidril pada sisi

aktifhya dan disebut juga sebagai protease ti04 protease metal adalah protease yang

aktivitasnya tergantung pada adanya logam, dan protease asam adalah enzim yang

-

keaktivannya disebabkan oleh adanya dua gugus karboksil pada sisi aktifhya.

Berdasarkan perjanjian internasional, semua protease termasuk ke dalam golongan

enzim yang diberi nomor 3.4.

Berdasarkan sifat-sifat kimianya, papain digolongkan sebagai protease sulfhidril

(Muchtadi et al., 1992). Papain adalah protein sederhana berupa sebuah rantai tunggal

polipeptida yang terdiri dari 212 residu asam amino dengan sistein-25 tempat gugus

aktif ti01 (-SH) esensial. Papain mempunyai titik isoelektrik pada pH 8.75 dan berat

molekul 21.000

-

23.700 dalton, mengandung unsur sulfur 1.2% (Leung, 1996).

Aktivitas papain dipengaruhi banyak faktor seperti suhy pH, kelcuatan ion, dan

tekanan, juga dipengaruhi oleh sisi aktifnya yang mengandung gugus sulfhidril.

(116)

tioester terbentuk sebagai produk intermediet. Mekanisme pembentukan tioester

antara gugus karboksil d m sulfhidril protein papain ditunjukkan pada Gambar 2,

[image:116.579.84.425.137.280.2]

R-COO-

Gambar 2. Mekanisme reaksi hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim papain (Cunningham, 1965 dalam Muchtadi et al., 1992)

Spesifisitas papain diketahui luas, tidak spesifik, dapat menghidrolisis protein,

peptida berukuran kecil, amida pada residu asam amino seperti arginin, lisin,

glutamin, histidin, glisin, dan tirosin. Papain aktif rnenghidrolisis golongan ester dan

amida dan dihambat oleh oligopeptida yang memiliki fenilalanin pada asarn amino

kedua di sisi karboksil. Kemampuan hidrolisis papain pada sebagian besar substrat

protein lebih ektensif dari protease lainnya seperti tripsin dan pepsin (Leung, 1996).

Belitz & Grosch (1999) menyatakan papain tennasuk protease sistein. Aktivitas

enzim ini berada pada daerah pH yang luas dan tergantung pada substrat (4.5-10)

dengan aktivitas maksimum pada pH 6-7.5. Residu sistein berada pada sisi aktif

Enzim papain sangat sensitif terhadap zat pengoksidasi seperti ion logam atau zat

pengemulsi, dapat diaktifkan oleh zat pereduksi seperti sistein dan zat pengkelat

seperti EDTA (etilen diamin tetra asetat). Papain merupakan enzim hidrolase yaitu

(117)

3.4.22 2. Analisis difraksi sinar-X menunjukkan bahwa molekul papain berbentuk

seperti telur dengan ukuran 36x36~48 Angstrom (Suhartono, 1992).

Papain kasar dapat diisolasi dari buah pepaya mentah dengan cara mengiris

permukaan buah, mengumpullcan getahnya dan dilanjutkan dengan pengeringan

menggunakan sinar matahari atau alat pengering. Leung (1996) menyebutkan kualitas

dan aktivitas papain kasar sangat bervariasi tergantung pada proses pengeringan.

Pengeringan dalam waktu singkat pada temperatur di bawah 50 OC menghasilkan

produk yang lebih bersih dan lebih aktif Aktivitas proteolitik papain juga

dipengaruhi oleh jenis buah, umur buah, dan penanganan pasca panennya (Muhidin,

2000). Buah pepaya berumur tiga bulan setelah berbunga atau tepat sebelum pektin

hadir akan menghasilkan papain yang paling baik atau disebut super papain kasar.

Teknik pengendapan dengan alkohol dapat menghasilkan perolehan papain dengan

aktivitas lebih tinggi dan menurunkan kadar impuritis logam pada produk akhir.

Suhartono (1989) menyatakan pH optimum papain adalah 4.5-7, suhu optimum

60-75 OC. Winarno (1986) menyatakan kestabilan enzim papain baik sekali pada

larutan yang mempunyai pH 5.0, pH optimal untuk substrat kasein adalah 7.0 dan

substrat gelatin 5.0. Papain mempunyai daya tahan panas lebih tinggi dari enzim lain.

Keaktifan enzim papain hanya menurun 20% pada pemanasan 70 OC selama 30 menit

pada pH 7.0. Papain dalam bentuk bubuk tahan terhadap panas kering 100 OC selama

3 jam (Leung, 1996). Temperatur optimal papain secara normal berada pada 60-70

0

C.

Papain banyak digunakan di bidang obat-obatan, f m a s i , dan kosmetik. Dalam

(118)

sebagsi penjernih bii dan hidrolisat protein (Winarno, 1986; Muchtadi et al., 1992;

Suhartono, 1992; Leung, 1996).

E.

Khamir

Khiamir termasuk fungi, tetapi dibedakan dari kapang karena bentuknya yang

terutarna uniseluler. Khamir dapat dibedakan atas dua kelompok berdasarkan

metabolismenya, yaitu bersifat fermentatif dan oksidatif Khamir fermentatif dapat

melakukan fermentasi alkohol, yaitu memecah glukosa melahi jalur glikolisis,

namun dapat bersifat oksidatif bila tersedia cukup oksigen (Fardiaz, 1992).

Khamir dari jenis Saccharomyces uvarum atau S. carlsbergensis adalah khamir

fermentatif kuat yang umumnya digunakan pada fermentasi bir. Khamir turnbuh

berlipat ganda lebih dari 10 fold selama fermentasi, dan dipisahkan dari bir.

Walaupun seb.agian diperlukan - untuk penarnbahan pada fermentasi berikutnya,

sekitar

YI

merupakan limbah atau berlebih. Pemanfaatan limbah ini di Inggris antara

lain urltuk pakan ternak karena mengandung protein tinggi dan vitamin B, sebagian

dibuat dalam benhrk tablet untuk keperluan farmasi, namun umumnya digunakan

untuk menghasilkan ekstrak khamir, produk yang komersial sejak akhir abad 19

(Kelly, 1983). Ekstrak khamir secara sederhana didefinisikan sebagai konsentrat zat

terlarut yang diperoleh dari suatu perlakuan terhadap protein khamir, rnisalnya

hidrolisis asam atau penghancuran sel secara mekanik. Atmaka (1997) melaporkan

ekstrak khamir yang dihasilkan dari penghancuran sel secara mekanik dapat

memperbaiki sifat-sifat fbngsional proteinnya menjadi lebih baik. Jenis dan

(119)

melibatkan hidrolisis enzimatis rnaka tujuannya adalah untuk mendegradasi strulctur

makromolekul dari protein khamir menjadi zat terlarut dalarn jumlah rnaksimum pada

nilai komersial yang dapat diterima (Kelly, 1983). Komposisi ekstrak khamir dari

fermentasi bir ditunjukkan pada Tabel 3. Ditinjau dari nilai nutrisinya rnaka ekstrak

khamir cocok digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba dan produk flavor.

Tabel 3. Komposisi rata-rata ekstrak khamir bir

Umum -

*

**

Kadar air 27% 30%

Protein (Nx6.25) 44% 47.5%

Natrium klorida 11% td

Kadar abu 13% 10%

Lemak min min

Karbohidrat 6% 8.2%

Larutan 5% jernih, bening agak kecoklatan dengan pH sekitar 5.5

Kandungan vitamin B (mglg ekstrak)

Thiamin 20-70 18-40

Riboflavin 55-100 18-150

Piridoksin 12-16 25-35

Niasin 250-700 td

Asam amino (total protein (N x 6.25) setelah hidrolisis)

Esensial Tidak esensial

*

-

**

*

* *

Isoleusin 4.7 2.3

Leusin 7.0 3.0

Metionin 1.5 0.7

Fenilalanin 3.8 1.7

Treonin . 0.5 2.3 Triptofan 1.7 0.5

Valin 6.0 2.5

Lisin td 3.5

- AIanin Arginin Aspartat Sistin Glut amat Glisin Histidin Prolin Serin Tirosin

7.2 3.4 1.7 2.0 10.2 4.5

min 0.45 11.5 6.7 5.5 2.3 2.3 1.2

5.0 1.7 4.5 2.3 3.0 1.6

*Kelly (1 983)

**Bridson & Brecker (1970)

[image:119.584.80.478.227.727.2]

(120)

Sel khamir limbah industri bir dapat dimanfaatkan sebagai autolisat dan hidrolisat

khamir yang berfbngsi sebagai sumber pepton (Peppler, 1979). Rasa pahit dari

komponen hop dapat dihilangkan dengan mencuci sel dengan larutan sedikit basa satu

atau dua kali selanjutnya disentrifbgasi dan dikeringkan. Ekstrak khamir yang

mengandung resin hop dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Hidrolisis khamir umurnnya dilakukan dengan asam dan panas tinggi (Peppler,

1982), namun ha1 ini mendapat perhatian dewasa ini karena kandungan garam pada

produk akhir menjadi tinggi akibat penetralan

(Reed

& Nagodawithana, 1991).

Hidrolisis asam dapat menyebabkan beberapa asam amino membentuk rasemisasi

sehingga menyebabkan daya cerna protein berkwang karena ikatan peptida pada

residu asam amino D kurang efisien terhidrolisis oleh protease dan juga mendukung

kehilangan asam amino esensial. D prolin dilaporkan bersifat neurotoksik (Fennema,

1996). Kandungan lisinoalanin (LAL) pada produk protein pangan yang diperlakukan

dengan panas tinggi dan asarn didapatkan tinggi. LAL selain menurunkan asarn

amino lisin juga merupakan produk yang tidak bernilai gizi. Hidrolisis asam pada

suhu tinggi juga dilaporkan dapat menghasilkan produk samping 3MCPD

(mono~oro propandiol), yang b e h g s i sebagai prekursor 1,3 DCP (dikloro

propandiol) yang bersifat karsinogenik (Anonim, 200 1).

Menurut Peppier (1982), autolisat khamir dapat diperoleh dari proses autolisis

yaitu penghancuran sel oleh enzim yang ada di dalam sel dan merupakan proses

alamiah akibat dari penuaan sel, prosesnya relatif lama sehingga jarang digunakan

dalam industri. Pemanasan 45-65 OC dan agitasi dapat mempercepat proses autolisis.

(121)

ditunjukkan pada Tabel 4. Perbedaan dalam komposisi menunjukkan derajat

keragaman (degree of variability) dari komposisi khamir asalnya dan kondisi proses

[image:121.579.81.510.192.427.2]

yang berbeda.

Tabel 4. Analisis proksimat beberapa autolisat kharnir komersial*

Kadar air

1

3.4

1

3.1

1

3.4

Komposisi (wlv) A B

1 I I

Karbohidrat

1

27.3

1

19.3

1

20.5

-

C

Kadar abu

1

9.3

1

22.7

1

9.7

I I I

Lipid

(

0.2

1

0.3

1

0.1

Protein (Nx6.25)

I I I

Arnonium klorida

1

0.7

1

0.9

1

1 .O

Asam organik

I I I

*

Peppler (1982)

65.1

55.5 50.8

1.6

Ekstrak khamir pada dasarnya adalah campuran asam amino dan peptida, vitamin

larut air, dan karbohidrat. Karbohidrat utarna pada khamir adalah glikogen dan

trehalosa, substansi ini diubah menjadi glukosa oleh hidrolisis enzim pada saat

ekstraksi. Poliheksosa seperti glukan dan manan tetap berada dalam dinding sel dan

dapat tlipisahkan atau terbawa bersama zat tidak terlarut (Peppler, 1982).

Penambahan protease dapat meningkatkan produk akhir, peran protease adalah

untuk meningkatkan laju kelarutan dan produk akhir. Papain mempercepat pemutusan

ikatan lisin, arginin dan fenilalanin pada protein khamir (Kelly, 1983). Papain juga

(122)

METODOLOGI

Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Lab. Analisis Pusat

Penelitian Kimia (P2K)

LiPI

PUSPIPTEK Serpong. Penelitian berlangsung selama

kurang lebih 10 bulan dimulai dari bulan Mei 2001 sampai Februari 2002.

Bahan dan Alat

Bahan utarna yang digunakan dalam penelitian ini adalah bungkil kedelai yang

diperoleh dari LIP1 Bandung, limbah bir dari pabrik bir PT Multi Bintang Indonesia

di Jakarta, serta enzim papain (Refined Papain) hasil produksi P2K LIP1 Serpong.

Untuk keperluan analisis digunakan beberapa bahan kimia dari Merck yaitu : asam

trikloro asetat (TCA), kalium natrium tartrat, natrium hidroksida, ternbaga suIfat,

peraksi Folin-Ciocalteu, tirosin, Bovin Serum Albumin (BSA), asam sulfat, kalium

sulfat, asam borat, asam klorida, natrium tiosulfat, natrium karbonat. Beberapa

indikator pendukung analisis adalah fenolftalin, larutan amilum, metil merah dan

metilen blue. Bahan untuk campwan media pertumbuhan bakteri adalah agar nutrien

(NA)

dan

beef ekstrak Difco. Sebagai pembanding produk digunakan dua pepton

standar yaitu bacto peptone Difco clan soy peptone Scharlau. Untuk paking kolom

kromatografi digunakan Superdex 75 (Pharmacia bioteh) dan bufer asetat pH 5.6.

Bakten Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Bacillus subtilis diperoleh dari

(123)

Peralatan yang digunakan untuk persiapan produk dan analisis adalah : timbangan

analitik (Scaltec), erlenmeyer sebagai wadah proses hidrolisis, shaker-water incubator

(Certomat

W R

B Braun Int.), sentrihs (Beckman), Spektrofotometer UV/Vis

(Hitachi U-2000), pH meter (704 Metrohm), ultrafilter stirred cell (Amicom), Freeze-

dryer (Dura Dry

MP

Pharmacia bioteh), chemistry analyzer (YSI 2700 SELECT),

kromatografi Akta explorer (Pharmacia biotech), stop watch, colony counter (Leica

Quebec: Darkfield), seperangkat alat Kjeldahl, autoklaf (SIBATA SI 2301), cawan

petri, laminar air flow 185 1 SIN 19755-93 (Forma scientific), recipro shaker (I3

Braun [nt.), berbagai ukuran pipet Eppendorf dan Finnpipette, mikroburet (Duran)

dan alat-alat gelas lainnya.

Metode Penelitian

~enditian dilakukan dalam beberapa tahapan kerja secara benuutan yaitu:

penentuan aktivitas enzim papain kasar, karakteristik Vm dan Km nya.

analisis proksimat bahan baku (kadar air, kadar abu, protein dan glukosa)

penentuan kondisi optimal proses hidrolisis dengan variabel konsentrasi substrat,

konsentrasi enzim, pH, suhu dan waktu. Parameter yang digunakan adaIah

kenaikan jumlah peptida terlarut optimum.

Karakterisasi produk yaitu kelarutan dalam air, N total, N amino, dan rasio AN/

TN,

serta pola kromatografi pepton pada kolom filtrasi gel.

Pengujian efektikitas produk terhadap pertumbuhan bakteri melalui pengamatan

absorbans pada panjang gelombang 660 nm selam 24 jam dan dilanjutkan dengan

(124)

Rangkaian kerja secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 3.

+

*

Optimasi kondisi hidiolisis (jumlah peptida terlarut optimum)

Konsentrasi substrat Konsentrasi enzim Suhu

*

PH Waktu BungIul kedelai

(Analisis proksimat)

Produksi pepton pada kondisi optimum

.

*

Karakterisasi produk Kelarutan Rasio ANITN

Pola kromatografi

I

AE Vm Km

I

Papain kasar

4

Efektivitas produk sebagai media pertumbuhan bakteri Kuva pertumbuhan 24 jam

Angka lempeng total

Limbah bir

(Analisis proksimat)

[image:124.579.79.498.129.693.2]

(125)

Aktivitas enzim papain

Aktivitas enzim papain diukur pada substrat kasein dengan cara membuat larutan

segar papain dan kasein masing-masing 0.1 dan I%, pH substrat diatur sampai 6.5

dengan beberapa tetes HCl 0.lM, selanjutnya 0.6 ml substrat disiapkan ddam 6

tabung reaksi (untuk sampel dan blanko dengan 3 ulangan). Ke dalam blanko

ditambahkan 0.2 rnl bufer fosfat pH 6.5 dan semua substrat diinkubasi pada water

bath suhu 40 OC seima 1 menit, kemudian 0.2 ml enzim ditambahkan pada masing-

masing tabung sampel dengan perbedaan waktu 15 detik (mengguoakan stopwatch).

Reaksi dibiarkan tepat 5 menit untuk masing-masing tabung reaksi clan dihentikan

dengan menambahkan 2 ml TCA 0.1M. Ke dalam tabung sampel ditambahkan 0.2 ml bufer fosfat pH 6.5 dan ke dalam tabung blanko ditambahkan 0.2 ml enzim,

waterbath dimatikan dan campwan diaduk (vorteks), selanjutnya disentrifbs pada

3000 rpm selama 20 menit. Filtrat diambil masing-masing sebanyak 0.6 ml dan

dimasukkan ke dalam 6 tabung reaksi yang berisi 2 ml NaOH 1h4, selanjutnya semua

tabung ditambahkan 0.4 ml larutan folin 1: 2 (pengenceran dengan akuades),

divorteks dan dibiarkan 20 menit untuk menstabilkan warna biru yang terbent.uk.

Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang (h) 578 nm. Tirosin

digunakan sebagai standar dan kwva standar menghasilkan persaman garis lurus (y =

0.0667~

+ 0.0165) dimana y adalah absorbans dan x adalah konsentrasi. Aktivitas

enzim dihitung sebagai :

Keterangan : AE = aktivitas enzim (unit) Abs = absorbans

(126)

Analisis proksimat

Bungkil kedelai dikecilkan ukurannya dengan crusher sehingga 1010s 50 mesh.

Limbah bir dalam bentuk krim disentrifbgasi pada 6000 rpm selama 20 menit dan

dicuci dua kali dengan akuades, endapan dikeringkan dalam oven vakum 55 'C

selama 20 jam dan bubuk kering diseragamkan 1010s 50 mesh. Analisis kadar air

ditentukan dengan metode oven 105 OC selama 20 jam. Analisis kadar abu ditentukan dengan pengabuan (bahan hasil analisis kadar air) pada 600 'C selama 6 jam. Kadar

protein ditentukan dengan metode mikro kejldahl. Kadar glukosa ditentukan secara

langsung dengan alat Biochemistry analyzer.

Penentuan kondisi hidrolisis optimum

Untuk menentukan kondisi hidrolisis dilakukan secara bertahap dimulai dengan

variabel jumlah substrat, jumlah enzim, suhu, pH, d m waktu.

Penentuan konsentrasi substrat optimum

Sejumlah bahan ditimbang duplo (0.5; 1; 1.5; 2; 3; 4; dan 5 gram), dimasukkan ke

dalam 14 erlenrneyer (7 tabung untuk sampel dan 7 tabung untuk blanko). Masing-

masing, ditambahkan akuades sehingga volume menjadi 40 ml. Semua tabung

dimasukkan dalam shaker-waterbath 60 OC selama 5 menit. Larutan stok enzim

papain (20%) dipersiapkan segar. Ke dalam 7 tabung sampel dimasukkan 5 ml larutan

stok enzim dengan selang waktu antar tabung 15 detik, sedangkan ke dalam 7 tabung

blanko dimasukkan 5 ml air. Hidrolisis dilakukan selama 1 jam dan reaksi dihentikan

dengm menambahkan 5 ml TCA 1M ke dalam semua tabung dalam selang waktu

(127)

larutan didinginkan dan disentrifbgasi pada 3000 rpm, 4 OC selama 20 menit. Filtrat

ditentukan jumlah protein terlarutnya dengan metode Lowry. Jumlah substrat pada

112 kecepatan maksimum digunakan sebagai dasar penentuan kondisi reaksi optimum

selanjutnya.

Penentuan konsentrasi enzim optimum

Sejumlah substrat optimum yang didapat dari tahap sebelumnya dihidrolisis

dengan beberapa konsentrasi enzim yaitu 0.01, 0.05,O. 1,0.2,0.4,0.6, dan 0.8% pada

suhu 60°C selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan sama seperti pada penentuan

konsentrasi substrat optimum.

Penentuan suhu optimum

Sejumlah substrat optimum yang diperoleh sebelumnya- dilakukan hidrolisis

dengan sejumlah enzim optimun pada beberapa suhu yaitu 40, 50,60, 70, dan 80°C.

Hidrolisis dilakukan selarna 1 jam dan perlakuan selanjutnya sama dengan pada

penentuan konsentrasi substrat dan enzim optimum.

Penentuan pH Optimum

Pada substrat, enzim, suhu optimum yang diperoleh sebelumnya dilakukan

hidrolisis selama 1 jam dengan beberapa kondisi pH awal (5; 5,5; 6; 6,5; 7; 75; 8).

(128)

Penentuan waktu Optimum

Pada konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu, dm pH optimum dilakukan

hidrolisis selama 20 jam dan selanjutnya dilakukan sama seperti diatas.

Produksi Pepton

Diagram pembuatan pepton dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini.

Bahan baku

I

*

Disuspensikan dalam akuades

I

*

Hidrolisis pada kondisi tertentu

I

*

Inaktivasi enzim (90 OC, 5 menit)

I

+

Ultrafiltrasi dengan membran 10 kDa MWCO

I

t

Permeat dikenng bekukan

I

+

Pepton bubuk kering

Gambar 4. Diagram pembuatan pepton

Pepton dihasilkan pada kondisi hidrolisis optimum dan untuk menginaktifkan

enzim dilakukan pemanasan pada 90°C selama 5 menit. Filtrat pepton dipisahkan

[image:128.584.73.495.209.770.2]

(129)

Ultrafiltrasi dilakukan untuk mendapatkan fraksi berberat molekul

<

10 kDa.

Ultrafiltrasi dilakukan dengan menggunakan stirred ultraJiltration cell pada suhu 5-

10 "C dengan tekanan 1-2 bar. Tekanan tersebut dicapai dari tekanan gas nitrogen

yang dialirkan dari tabung gas.

Karakterisasi Produk

Total Nitrogen

Analisis total nitrogen dilakukan dengan metode mikro kjeldahl (AOAC, 1984).

Sejumlah contoh (0.2-0.5g) dimasukkan kedalam labu kjeldahl yang berisi beberapa

batu didih, ditambahkan O.15g &SO4 clan 15mg HgO serta 7.5ml HzS04 pekat.

Larutan dididihkan sampai berwarna jemih (f 1 jam). Setelah dingin ditambahkan

50ml akuades dan labu dipindahkan ke alat destilasi. Dalam keadaan tersarnbung, ke

dalam labu segera ditambahkan 35 ml NaOH 40%. Destilat ditampung dalam 15 ml

asam borat 3% yang telah ditetesi indikator (metil merah

+

metilen blue 2:l dalam

allcohol). Kelebihan asam borat selanjutnya dititrasi dengan HCl 0.1N yang sudah

distandarisasi dengan Na2C03 (a ml). Blanko dilakukan dengan cara yang sama (b

ml). Total nitrogen dihitung sebagai :

[Total N(% ) = [{(a-b) x N HCl x 0.014)lg contoh] x 100%

1

Amino nitrogen

Analisis amino nitrogen dilakukan dengan metode titrasi Cu (Pope & Stevens,

1939). Sejumlah contoh ( 0. l g dilarutkan dalam lOml akuades kemudian disentrifbs

(130)

takar 25m1, ditambahkan 4 tetes timolftalin dan beberapa tetes NaOH 1N sampai

berwarna biru muda, selanjutnya ditambahkan 15ml suspensi Cu-fosfat (larutan

CuClz 4- N a s H n + bufer borat 1: 2: 2), selanjutnya ditambah akuades sampai tanda

batas. Endapan dipisahkan dengan cara sentrifbgasi. Filtrat dipipet sebanyak 5m1,

ditambahkan 0.25ml asam astetat dan 0.5g KI (berwarna kuning muda). Larutan

dititrasi dengan larutan Natrium tiosulfat sampai mendekati titik akhir, lalu

ditambahkan 4 tetes indikator amilum dan titrasi dilanjutkan sampai warna biru tepat

hilang.

ml tiosulfat x (N tiosulfat 1 0.0 1) x 0.28 Kadar N amino =

L

x faktor pengenceran

mg contoh.

Pola kromatografi filtrasi gel

,. _{Pola kromatografi pepton dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografl}

filtrasi gel ukuran 1.5 x 30 cm berisi superdex 75. Eluennya adalah bufer asetat pH

5.6, laju alir 1.25mVmenit dan konsentrasi protein dibuat 10%.

Efektivitas produk pada pertumbuhan bakteri

Untuk menguji pertumbuhan bakteri, media uji dibuat dengan melarutkan 0.5%

pepton dan 0.3% beef extract dalam akuades dan sterilisasi medium dilakukan pada

suhu 121°C selama 20 menit. Ke dalam media dimasukkan 0.51111 biakan bakteri

secara aseptis, kemudian diinkubasi pada shaker reciprocal 120rpm, 30°C selama 24

jam. Pengamatan kekeruhan (Ohtransmitans) diamati setiap 1 jam. Selanjutnya

(131)

pemupukan 0. lml setiap pengenceran tertentu dari bakteri yang tumbuh 24 jam pada

media pepton uji pada media agar nutrien, dan diinkubasi 24 jam. Jumlah koloni yang

tumbuh dihitung sebagai cfidml.

[~umlah cfu/ml = (Jumlah koloni )/(faktor pengenceran x 0.1)

1

Proteixr Terlarut

Analisis protein terlarut dilakukan dengan metode spektrofotometri (Lowry, 195 1).

Sampel larutan (filtrat hasil hidrolisis) diambil sebanyak 0.25 ml dimasukkan ke

dalarn tabung reaksi dan volume ditepatkan menjadi 5 ml dengan akuades. Dari

masing-masing tabung reaksi diambil 0.25 ml dan ditambahkan 2.75m1 pereaksi

Lowry C (50 rnl Lowry A

+

1 ml Lowry B), diaduk dan selanjutnya ditambahkan

0.25 ml pereaksi Lowry D, segera diaduk merata sesudah penambahan dan dibiarkan

selama 3 0 d t sampai terbentuk warm biru yang stabil. Absorbansi diukur pada h

500nrn. Persamaan kurva standar BSA adalah y = 0.0219

+

0.5855x, dimana :

y = absorbans

x = konsentrasi BS A (mg/ml)

Lowry A berupa carnpuran larutan natrium karbonat 2% dalam larutan NaOH 0. IN,

Lowry B adalah larutan tembaga sulfat 0.5% dalam larutan NaK-tartrat 1%.

Perhitungan kadar protein terlarut adalah:

Abs - 0.0219

Protein terlamt (mg/ml) = x faktor pengenceran

(132)

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Aktivitas Enzim Papain

Enzrm yang digunakan adalah papain (reJned papain) yang diisolasi dari getah

buah pepaya dan dilakukan pengendapan dengan alkohol, selanjutnya dilakukan

pengeringan pada pengering kabinet dengan suhu 55°C. Papain yang digunakan

berbentuk bubuk putih kekuningan. Penentuan aktivitas proteolitik enzim papain

dilakukan dengan menggunakan substrat kasein 1% pada pH 6.5, suhu 40°C dan

inkubasi selama 5 menit. Nilai aktivitas yang diperoleh sebesar 1164 unit. Unit dalam

ha1 ini didefinisikan sebagai jumlah pg produk (tirosin) yang terbentuk per menit dari

substrat kasein pada kondisi uji.

Hasil analisis melalui pendekatan kurva Lineweaver-Burk diperoleh karakteristik

dari papain yang digunakan adalah Vm sebesar 2000 unit dan Km = 0.8%. (Gambar 5 & 6). Nilai tan sudut yang dibentuk oleh garis lurus = KmNm sedangkan

perpotongan garis lurus pada sumbu tegak = 1 N m dan perpotongan garis lurus pada

sumbu datar = -1Km (Winarno, 1986).

1 5 0 0 -

1 3 0 0 -

P c

2 1 1 0 0 -

3

0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 3

K a s e i n (%)

(133)

[image:133.584.171.433.133.268.2]