BAB II PEMBAHASAN
2.1 Diabetes Melitus
Diabetes melitus (DM) adalah serangkaian penyakit terkait di mana tubuh tidak dapat mengatur jumlah gula (secara spesifik, glukosa) dalam darah. Diabetes melitus adalah
gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia yang berhubungan dengan abnormalis karbohidrat, lemak, dan protein yang disebabkan oleh penurunan sekresi insulin, atau keduanya dan menyebabkan komplikasi kronis mikrovaskular, makrovaskular, dan neuropati (Sukandar,dkk., 2008).
Penderita diabetes melitus mengalami kerusakan dalam produksi maupun sistem kerja insulin, sedangkan insulin sangat dibutuhkan dalam melakukan regulasi metabolisme
karbohidrat.Ketika tidak ada hormon insulin pada tubuh, maka senyawa glukosa tidak dapat masuk kedalam sel, akibatnya glukosa menumpuk pada aliran darah dan sel tidak
mendapatkan suplai glukosa untuk masuk kedalam metabolisme karbohidrat.Akibatnya, sel memecah senyawa lain seperti glikogen dan lemak untuk dirombak agar menghasilkan energi (Suriani, 2012).
Berbagai faktor penyebab diabetes melitus: 1. Genetik / keturunan
Penyebab diabetes melitus dikatakan sebagai penyakit yang bersifat multigenetik, artinya disebabkan oleh interaksi antar gen, sehingga tidak bisa ditentukan presentase faktor genetik penyebab penyakit ini. Namun, apabila salah satu atau kedua orang tua dari suatu subyek menderita diabetes, maka resiko menderita penyakit ini akan semakin tinggi bila dibandingkan dengan subyek dengan orang tua bukan penderita.
2. Sindrom ovarium polikistik (PCOS)
Sebanyak 6% dari seluruh wanita selama masa reproduksinya mengalami kelainan endokrin ini berupa peningkatan produksi androgen dan resistensi insulin.
3. Virus dan bakteri
ahli karena belum terdeteksi meskipun memegang peran penting dalam timbulnya diabetes melitus.
4. Bahan toksik / beracun
Beberapa bahan beracun yang mampu merusak sel beta adalah alloxan, pyrineuron (rodentisida), dan streptozoctin (produk dari sejenis jamur).
5. Diabetes Gestasional (diabetes kehamilan) akibat intoleransi glukosa selama kehamilan. Diabetes ini terjadi karena pada pertengahan kehamilan sekresi hormon pertumbuhan dan Hormon Chorionik Somatomamotropin (HCS) meningkat. Hormon ini meningkat untuk mensuplai asam amino dan glukosa ke fetus, sehingga kadar glukosa darah menjadi meningkat.
Penyebab lain diabetes melitus adalah faktor gaya hidup (makanan dan pola hidup yang kurang sehat), kadar kortikosteroid yang tinggi, kehamilan diabetes gestational, obat-obatan yang memperberat kerja pankreas, dan racun yang mempengaruhi atau efek dari insulin. Insulin adalah hormon yang diproduksi oleh sel beta pada pankreas (kelenjar yang terletak di belakang lambung) yang berfungsi memetabolisme glukosa menjadi glikogen dan menyimpannya di dalam hati dan jaringan otot (Maulana, 2008).
Tipe diabetes melitus yang paling banyak diderita adalah: 1. Diabetes Melitus Tipe 1
DM tipe 1 disebut juga Insulin Dependent Diabetes Melitus (IDDM), yaitu tidak kelainan pada pankreas yang menyebabkan insulin tidak dapat terekskresi. Hal ini dapat
disebabkan oleh reaksi autoimun yang menyerang antibodi terhadap sel pankreas. 2. Diabetes Melitus Tipe 2
DM tipe 2 disebut juga Non-Insulin Dependent Diabetes Melitus (NIDDM), yaitu insulin yang dihasilkan tidak dapat bekerja dengan baik karena terjadi penurunan jumlah reseptor insulin pada sel atau perubahan struktur reseptor yang mengakibatkan hanya sedikit glukosa yang dapat memasuki sel. Hal ini mengakibatkan beberapa sel mengalami kekurangan glukosa, sedangkan di sisi lain glukosa menumpuk dalam pembuluh darah dan menyebabkan berbagai komplikasi yang lebih serius.
2.2 Escherichia coli
Escherichia coli yang ditemukan oleh Theodor Escherich pada tahun 1886
besar manusia termasuk ke dalam keluarga Enterobacteriaceae. Enterobacteriaceae
merupakan kelompok bakteri batang gram negatif yang heterogen, dengan habitat alami di saluran intestinal manusia dan binatang. Escherichia coli merupakan bakteri yang berbentuk batang pendek (kokobasil), gram negatif, tidak berkapsul, umumnya mempunyai fimbiria, dan bersifat motil. Bakteri E. coli memiliki ukuran panjang ± 1-3 µm dan lebar ± 0,4-0,7 µm (Pelczar dkk, 2005).
E. coli pada umumnya diketahui hidup secara normal pada alat pencernaan. Namun, E.coli juga dapat bersifat oportunis dengan menyebabkan penyakit pada manusia apabila jumlah E. coli terlalu banyak atau berada di luar usus, misalnya pada infeksi saluran kemih dan infeksi luka (Hardiansyah dan Rimbawan, 2001). E.coli mempunyai antigen O, H, dan K. Pada saat ini telah ditemukan sekitar 150 tipe antigen O, 90 tipe antigen K, dan 50 tipe antigen H. E. coli memiliki waktu generasi yang cukup singkat yaitu berkisar 15-20 menit (Pratiwi, 2008).
Hampir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi dan mikrobiologi industri selalu melibatkan E. coli karena bakteri ini memiliki struktur genetik yang sederhana dan mudah untuk direkayasa. Bakteri ini juga merupakan media kloning yang paling sering dipakai, terutama dalam teknik DNA rekombinan. Banyak industri kimia mengaplikasikan teknologi fermentasi yang memanfaatkan E. coli misalnya dalam produksi obat-obatan (insulin, antiobiotik) dan bahan kimia berniali tinggi (1-3 propanediol, laktat). Secara teoritis, ribuan jenis produk kimia dapat dihasilkan dengan cara melakukan rekayasa genetika yang sedemikian rupa pada bakteri ini guna menghasilkan jenis produk tertentu yang diinginkan. Jika mengingat besarnya peranan ilmu bioteknologi dalam aspek-aspek kehidupan manusia, maka tidak bisa dipungkiri juga betapa besar manfaat E. coli bagi kita (Yalun, 2008).
Salah satu peranan E. coli di bidang kesehatan adalah sebagai bahan dalam
pembuatan insulin untuk pengobatan diabetes mellitus melalui proses rekayasa genetika atau teknik DNA rekombinan. Ketika E. coli bereproduksi, gen insulin akan direplikasi bersama dengan plasmid bakteri. Beberapa alasan penggunaan E. coli dalam pembuatan insulin antara lain (Rosalia, 2010):
E. coli memiliki rentang umur pendek Jumlah generasinya banyak
Lingkungan luar E. coli dapat dengan mudah dimodifikasi untuk mempengaruhi
ekspresi gen
Menghasilkan produk yang hampir mendekati dengan yang diinginkan (menyerupai insulin yang dihasilkan sel pankreas).
2.3 Insulin
Insulin merupakan suatu polipeptida yang mengandung dua rantai asam amino yang dihubungkan oleh jembatan disulfida. Hormon ini disintesa di dalam retikulum endoplasma kasar sel B pankreas, kemudian ditranspor ke apparatus golgi untuk dipaket dalam bentuk granul-granul, yang bergerak ke membran sel dan akhirnya kandungan granul dilepaskan dengan cara eksositosis. Insulin kemudian melewati laminal basal sel B dan kapiler dan fenestrata endotel kapiler untuk mencapai aliran darah Insulin disintesa sebagai bagian dari preprohormon. Dosis insulin dinyatakan dalam unit (U). Sediaan homogen human insulin mengandung 25-30 UI/mg. Insulin diberikan secara subkutan dengan tujuan
mempertahankan kadar gula darah dalam batas normal sepanjang hari yaitu 80-160 mg% setelah makan. Untuk pasien usia di atas 60 tahun batas ini lebih tinggi yaitu puasa kurang dari 150 mg% dan kurang dari 200 mg% setelah makan. Insulin dapat segera diberikan dalam keadaan dekompensasi metabolik berat, misalnya ketoasidosis, stress berat, berat badan yang menurun dengan cepat, adanya ketonuria (Dinar,2009).
Struktur kimia insulin :
Insulin merupakan polipeptida yang terdiri dari 2 rantai, yaitu rantai A dan rantai B Rantai A terdiri dari 21 asam amino, rantai B terdiri dari 30 asam amino
Kedua rantai trsebut dihubungkan oleh jembatan disulfida, yaitu pada A7 dengan B7
dan pada A20 dengan B19. Ada pula jembatan disulfida intra rantai pada rantai A yaitu pada A6 dan A11. Posisi ketiga jembatan tersebut selalu tetap.
Kadang terjadi substitusi asam amino terutama pada rantai A posisi 8, 9, 10 namun tidak mempengaruhi bioaktivitas rangkaian tesebut (Depkes RI, 2005).
2.4 Fungsi Insulin
Peranan insulin sebagai hormon yang memodulasi ambilan glukosa secara umum telah banyak diketahui. Dalam kaitan dengan fungsi kardiovaskular, ternyata insulin juga memiliki peran penting dalam kondisi kardiovaskularm baik kondisi yang sehat maupun sakit. Insulin berperan dalam penggunaan glukosa oleh sel tubuh untuk pembentukan energi. Apabila tidak ada insulin maka sel tidak dapat menggunakan glukosa, sehingga proses metabolisme menjadi terganggu. Proses pembentukan energi yang difasilitasi oleh insulin terjadi sebagai berikut. Karbohidrat dimetabolisme oleh tubuh untuk menghasilkan glukosa, glukosa tersebut selanjutnya diabsorbsi di saluran pencernaan menuju ke aliran darah untuk dioksidasi di otot sketel sehingga menghasilkan energi. Glukosa juga disimpan dalam hati dalam bentuk glikogen kemudian diubah dalam jaringan adiposa menjadi lemak dan trigliserida. Insulin akan meningkatkan pengikatan glukosa oleh jaringan, meningkatkan level glikogen dalam hati, mengurangi pemecahan glikogen (glikogenolisis) di hati, meningkatkan sintesis asam lemak, menurunkan pemecahan asam lemak menjadi badan keton, dan membantu penggabungan asam amino menjadi protein. Insulin merupakan protein kecil dengan BM 5808 pada manusia mengandung 51 asam amino yang tersusun dalam 2 rantai (A dan B) yang terhubung oleh jembatan disulfida, di mana terdapat perbedaan spesies dalam dua rantai tersebut (Depkes RI, 2005).
2.5 Proses Pembuatan Insulin Manusia dengan Teknik DNA Rekombinan
insulin akan mengkode protein insulin. Pada dasarnya, proses produksi insulin dengan menggunakan bakteri E. coli melalui teknik DNA rekombinan atau rekayasa genetika terdiri dari 5 tahapan sebagai berikut:
a. Mengisolasi DNA insulin dan DNA plasmid
Isolasi DNA atau RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan penelitian sangat menentukan hasil kemurnian DNA
kromosom dan plasmid. Terdapat 3 langkah dalam pengisolasian bakteri, yaitu : 1. Menumbuhkan sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan untuk
mendapatkan DNA plasmid. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah, sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak ini kemudian dipurifikasi. 2. Teknik isolasi DNA plasmid dengan cara mensentrifugasi koloni bakteri dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil dan ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1
3. Langkah ketiga adalah melakukan prosedur digesti kromosom, plasmid, dan pUC19 dengan Eco RI
b. Memotong DNA insulin
Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti pisau bedah biologi, yang dapat mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misalnya
mengenali rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk
memutuskan pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari kromosom sebuah organisme, sehingga dapat memproduksi insulin.
1500 putaran/menit selama 30 menit. Pemutusan terjadi secara acak dilihat dari segi urutan DNA.
c. Menggabungkan molekul DNA
Setelah mendeskripsikan metode yang mungkin dipakai untuk memotong molekul DNA insulin, maka harus dipertimbangkan tentang cara bagaimana agar fragmen DNA insulin dapat digabungkan dengan DNA plasmid untuk menciptakan molekul rekombinan buatan. Di sini DNA ligase berperan untuk menggabungkan DNA plasmid dengan DNA insulin yang telah dipotong sebelumnya. DNA ligase adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida. E.coli dan fag T4 mengkode suatu enzim ligase DNA yang menutup takik unting tunggal di antara nukleotida yang berdekatan dalam untai DNA duplet. Temperatur optimum untuk ligase DNA yang bertakik adalah 370 C. Tetapi pada temperatur ini penggabungan ikatan nitrogen antara ujung-ujung yang berdekatan tidak stabil.
Gambar 2.2 Pemotongan dan Penggabungan DNA
rantai A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang menandakan pengakhiran sintesis protein. Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu. Gen sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah
dimasukkan ke dalam gen untuk enzim bakteri, yaitu B-galaktosidase, yang selanjutnya dibawa ke dalam plasmid vektor tersebut. Pada tahap ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli.
d. Memasukkan DNA ke dalam sel hidup (vektor)
Teknik memasukkan DNA ke dalam vektor meliputi 3 proses, yaitu pemotongan plasmid maupun DNA manusia dengan menggunakan enzim restriksi yang sama;
pencampuran fragmen DNA manusia dengan plasmid yang telah dipotong; dan penambahan enzim ligase untuk membentuk ikatan kovalen antara keduanya.
Gambar 2.3 Penyisipan DNA manusia ke dalam plasmid bakteri
e. Mengembangkan vektor dengan sisipan DNA yang direkayasa
dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersamaan dengan saat sel mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.
Gambar 2.4 Perkembangbiakan Bakteri
Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-galaktosidase dan dimurnikan.
Gambar 2.5 Penggabungan Rantai A dengan B-Galaktosidase
[image:9.612.153.480.466.603.2]Gambar 2.6 DNA Insulin
Secara umum, proses produksi insulin dengan vektor E. coli dijelaskan dalam skema berikut :
Gambar 2.7 Skema tahapan pembuatan insulin
[image:10.612.132.500.332.621.2]Insulin adalah suatu hormon yang secara alami dihasilkan oleh pulau pulau
langerhans pankreas. Insulin memungkinkan sel – sel tubuh mengabsorbsi glukosa dari darah untuk digunakan sebagai sumber energy, diubah menjadi molekul lain yang diperlukan, atau untuk disimpan. Insulin juga merupakan sinyal control untama konversi glukosa menjadi glikogen untuk penyimpanan internal di hati dan sel otot. Bila jumlah insulin yang tersedia tidak mencukupi, sel tidak merespon adanya insulin (tidak sensitif atau resisten), atau bila insulin itu sendiri tidak diproduksi oleh sel – sel beta akibat rusaknya sel–sel beta pada pancreas, maka glukosa tidak dapat dimanfaatkan oleh sel tubuh ataupun disimpan dalam bentuk cadangan makanan dalam hati maupun sel otot. Akibat yang terjadi adalah
peningkatan kadar glukosa dalam darah, penurunan sintesis protein, dan gangguan proses – proses metabolisme dalam tubuh. Hormon ini bekerja mengatur kadar glukosa dalam darah dengan cara mempermudah masuknya glukosa ke dalam semua jaringan tubuh.
Pemberian injeksi insulin secara teratur dalam meningkatkan kadar insulin dalam darah penderita dapat meminimumkan komplikasi. Pengobatan ini hanya mungkin
dilaksanakan bila insulin tersedia dalam jumlah besar dengan kemurnian dan mutu yang baik. Pemberian insulin kepada penderita diabetes hanya bisa dilakukan dengan cara suntikan, jika diberikan melalui oral insulin akan rusak didalam lambung. Setelah disuntikan, insulin akan diserap kedalam aliran darah dan dibawa ke seluruh tubuh. Disini insulin akan bekerja menormalkan kadar gula darah (blood glucose) dan merubah glucose menjadi energi. Perlu diperhatikan daerah mana saja yang dapat dijadikan tempat menyuntikkan insulin. Bila kadar glukosa darah tinggi, sebaiknya disuntikkan di daerah perut dimana penyerapan akan lebih cepat. Namun bila kondisi kadar glukosa pada darah rendah, hindarilah penyuntikkan pada daerah perut.
Secara urutan, area proses penyerapan paling cepat adalah dari perut, lengan atas dan paha. Insulin akan lebih cepat diserap apabila daerah suntikkan digerak-gerakkan.
Penyuntikkan insulin pada satu daerah yang sama dapat mengurangi variasi penyerapan. Penyuntikkan insulin selalu di daerah yang sama dapat merangsang terjadinya perlemakan dan menyebabkan gangguan penyerapan insulin. Daerah suntikkan sebaiknya berjarak 1 inchi (+ 2,5 cm) dari daerah sebelumnya. Lakukanlah rotasi di dalam satu daerah selama satu minggu, lalu baru pindah ke daerah yang lain.
a. Dosis
Semakin tinggi dosisnya maka semakin cepat aksinya.
b. Tempat injeksi
Pada umumnya insulin diberikan dengan injeksi menembus kulit. Pada pemberian intravena aksinya cepat, pad transdermal atau secara subkutan maka pada otot terjadi degradasi insulin 20-25%. Makanya harus diperhitungkan untuk mendapatkan dosis yang tepat. Kebanyakan insulin diinjeksikan pada perut (intrperional). Jarum untuk injeksi insulin kecil sekali dan pendek (0,5 - 1 cm). Dapat juga menggunakan implant pada dada yang dapat mensuplai insulin sedikit demi sedkit.
c. Kehadiran antibodi insulin
Hal ini terutama pada penggunaan hewan sebagai insulin. Jika digunakan insulin dari luar dikhawatirkan terjadi reaksi antigen antibodi maupun perusakan lain, kecuali pada penderita autoimun.
d. Aktivitas fisik
