Ruru Awana

BAB III

METODE PENELITIAN 1.1 Obyek Penelitian

Obyek yang diteliti dalam penelitian ini adalah :

1. Aktivitas penurunan kadar glukosa secara in-vitro ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau) dengan menggunakan metode Nelson-Somogyi

2. Kandungan total flavonoid pada ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau) yang dianalisa menggunakan spektrofotometer visibel

1.2 Sampel Dan Teknik Sampling

Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau) yang diperoleh dari daerah Gunungpati kota Semarang, Jawa Tengah

Teknik sampling yang digunakan pada penelitian ini adalah teknik acak sederhana (simple random sampling) setiap anggota populasi mempunyai peluang yang sama.

1.3 Variabel Penelitian

Konsentrasi dari ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau) adalah 40, 80, 120, 160, 200 dan 240 ppm 2. Variabel Terikat

a. Aktivitas penurunan glukosa ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau).

b. Kandungan total flavonoid dari ekstrak etanol dan fraksi etil asetat daun dandang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau) dalam satuan mg/100 g

3. Variabel Terkontrol

a. Metode ekstraksi adalah maserasi dengan pelarut etanol 96%

b. Berat sampel serbuk daun dandang gendis untuk ekstraksi adalah 200,0 gram c. Konsentrasi larutan standar glukosa adalah 60 ppm

d. Ekstraksi dengan pelarut etanol 1:5

e. Metode penentuan aktivitas penurunan kadar glukosa yaitu dengan Nelson-Somogyi menggunakan spektrofotometer Visibel

1.4 Teknik Pengumpulan Data

Data aktivitas penurunan kadar glukosa diperoleh dari hasil pengukuran absorbansi masing-masing larutan uji dengan berbagai konsentrasi secara spektrofotometer Visible pada panjang gelombang maksimal

Data kandungan flavonoid total didapat dari hasil pengukuran absorbansi dari masing-masing larutan uji dengan berbagai konsentrasi secara spektrofotometer Visible pada panjang gelombang maksimal. Kemudian dilakukan uji statistic menggunakan SPSS versi 16 untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan.

1.5 Alat dan Bahan

1.5.1 Alat yang Digunakan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini untuk ekstraksi maserasi adalah beaker glass (Herma), batang pengaduk dan neraca analitik (Sartorius), kertas saring. Alat untuk uji kualitatif adalah tabung reaksi (Pyrex), rak tabung, pipet tetes, lempeng Silika Gel GF 254 (Merck), pipa kapiler, chamber, penutup dan UV 254 nm. Alat untuk pengukuran kadar glukosa dan spektrofotometer visibel (Shimadzu UV Vis Mini-1240), neraca analitik (Sartorius), pipet volume (Pyrex), labu takar (Pyrex), corong kaca (Herma), pipet tetes dan tabung reaksi (Pyrex). Alat untuk identifikasi jenis flavonoid adalah spektrofotometer visibel (Shimadzu UV Vis 1700 series). 1.5.2 Bahan yang Digunakan

96% (Merck). Bahan untuk fraksinasi menggunakan ekstrak etanol daun dandang gendis, akuades, n-heksan, dan etil asetat. Bahan untuk identifikasi kandungan ekstrak adalah NaOH teknis, larutan gelatin 0,5%, K4[Fe(CN)6] dan serbuk Zn (Farco) sedangkan untuk KLT bahan yang digunakan adalah silica gel GF254 (Merck), n-butanol (Merck), akuades, ammonia pekat (Bratachem). Bahan untuk pengukuran kadar glukosa meliputi reagen Nelson yang terdiri dari larutan Nelson A dan Nelson B serta reagen Arsenomolibdat. Reagen Nelson A terdiri dari Na2CO3, K-Na-C4H4O6.4H2O, NaHCO3, dan akuades. Reagen Nelson B terdiri dari CuSO4.5H2O, H2SO4, akuades , dan reagen Arsenomolibdat terdiri dari (NH4)6Mo7O24.4H2O, H2SO4, Na2AsO4.7H2O dan akuades. Bahan untuk penetapan kadar flavonoid simplisia antara lain: etanol, kertas saring, akuades, NaOH, AlCl3 p.a, HCl, baku kuersetin p.a.

1.6 Prosedur Kerja

1.6.1 Determinasi Daun Dandang Gendis

1.6.2 Penyiapan Simplisia

Dipilih daun dandang gendis segar yang masih utuh dan berwarna hijau tua, dipanen pada siang hari agar kandungan senyawa aktif dalam keadaan yang maksimal. Daun dicuci dengan menggunakan air mengalir lalu dikeringkan di bawah sinar matahari dengan menggunakan kain hitam selama 4 hari. Daun yang sudah kering dilakukan pengecilan ukuran partikel dengan menggunakan blender, kemudian diayak dengan ayakan no.40/60.

1.6.3 Penyarian Simplisia

1. Pembuatan ekstrak etanol daun dandang gendis

Daun dandang gendis setelah ditimbang dibersihkan dengan air, dipisahkan bagian-bagian yang tidak diperlukan kemudian dikeringkan selama 4 hari. Setelah kering, sampel kering diblender hingga diperoleh serbuk dengan butiran-butiran yang cukup halus. Serbuk tersebut ditimbang dan selanjutnya digunakan sebagai sampel. Diambil serbuk sebanyak 200,0 gram kemudian direndam (metode maserasi) dalam 500 mL pelarut etanol 96%. Setelah itu, sampel disaring dan diambil filtratnya. Seluruh filtrat yang diperoleh dikumpulkan menjadi satu. Filtrat kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.

2. Pembuatan fraksi etil asetat daun dadang gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau)

disebut sebagai fraksi air difraksinasi kembali dengan etil asetat sebanyak 5x25 mL, diambil fase etil asetatnya. Masing-masing fraksi diuapkan diatas waterbath.

1.6.4 Identifikasi Senyawa Aktif dari Ekstrak Etanol Daun Dandang Gendis 1.6.4.1 Identifikasi Senyawa Fenolik

Ekstrak etanol daun dandang gendis diambil sebanyak 1 mL ditambahkan 1 mL larutan besi (III) klorida, bila membentuk warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam maka positif mengandung senyawa fenolik. Hal yang sama dilakukan juga pada fraksi etil asetat daun dandang gendis (Robinson, 1995 : 209).

1.6.4.2 Identifikasi Senyawa Polifenol

Ekstrak etanol diambil sebanyak 1 mL ditambahkan 1 mL larutan kalium heksasianoferat (III) dan larutan besi (III) klorida, jika membentuk warna biru sampai hitam maka positif mengandung senyawa polifenol. Hal yang sama dilakukan juga pada fraksi etil asetat daun gendis (Harborne, 1987 : 49).

1.6.4.3 Identifikasi Flavonoid

1. Sebanyak 0,5 gram sampel dilarutkan dalam 1 mL etanol 96% kemudian ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium P dan 5 tetes asam klorida pekat P. Jika terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu, menujukkan adanya flavonoid. Jika terbentuk warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron (Depkes RI, 1979 : 787).

2. Identifikasi Flavonoid dengan KLT

a. Eluen butanol : asam asetat glasial : air (4:1:5) dipisahkan diambil fase n-butanol

b. Eluen dimasukkan dalam bejana kromatografi (eluen dalam chamber dijenuhkan terlebih dahulu) dengan maksud untuk meniakkan uap dari eluen hingga mampu memberikan bercak noda pada lempeng.

c. Ekstrak etanol dan fraksi etil asetat masing-masing dilarutkan dalam etanol 96% serta balku kuersetin ditotolkan pada lempeng silika gel (markham, 1988 : 24).

d. Disemprotkan penampak bercak uap ammonia. Terbentuknya warna kuning kecoklatan menunjukkan adanya kandungan flavonoid dalam ekstrak dan fraksi (Robinson, 1995 : 211).

1.6.4.4 Identifikasi Tanin

Sampel dilarutkan dengan etanol 96% ditambah 10 mL akuades. Dipanaskan selama 15 menit, lalu disaring, ditambah 1 mL FeCl3 1%. Hasil positif jika terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman (Harborne, 1987 : 105).

1.6.4.5 Identifikasi Saponin

1.6.5 Pengujian Kuantitatif Flavonoid Total Secara Spektrofotometri Visible 1. Pembuatan larutan baku kuersetin 100 ppm sebanyak 100,0 mL

Baku kuersetin ditimbang seksama sebanyak ± 50, 0 mg dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL ditambah methanol p.a hingga tanda batas, digojok homogen. Dipipet 10,0 mL dari larutan tadi dimasukkan ke dalam labu takar 100,0 mL ditambahkan methanol p.a hingga tanda batas. Dari baku utama dibuat kurva baku dengan konsentrasi 4,6,8,10 dan 12 ppm.

2. Pembuatan kurva baku kuesertin 4,6,8,10 dan 12 ppm

Baku utama dipipet seksama masing-masing 400,0; 600,0; 800,0; 1000,0 dan 1200,0 μL dengan konsentrasi masing-masing 4, 6, 8, 10, dan 12 ppm. Dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL. Ditambah 1,0 mL AlCl3 10% ditambah 3,0 mL akuades, ditambah methanol p.a sampai tanda batas digojok homogen. Dilakukan operating time (15 menit) dan panjang gelombang maksimal (434,5 nm) pada deret baku tengah yakni 8 ppm. Dibuat kurva baku kalibrasi hubungan antara konsentrasi baku kuersetin (ppm) dengan absorbansi.

3. Penetapan Kadar Flavonoid Total

Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang maksimal yaitu 434,5 nm. Dilakukan 3 kali pengulangan. 1.6.6 Pengujian Aktivitas Penurunan Kadar Glukosa dengan Metode

Nelson-Somogyi

1. Pembuatan Larutan D-Glukosa Anhidrat 100 mg/dL

D-Glukosa anhidrat ditimbang sebanyak 100,0 mg dilarutkan dengan akuades kemudian dicukupkan hingga 50,0 mL, sehingga diperoleh larutan induk D-glukosa anhidrat 2000 ppm

2. Penentuan Operating Time

Operating time adalah waktu pendiaman yang memberikan absorbansi yang paling stabil. Penentuan operating time menggunakan salah satu seri konsentrasi dari deret baku larutan D-glukosa anhidrat. Larutan D-glukosa anhidrat diambil sebanyak 1,0 mL kemudian ditambahkan reagen Nelson sebanyak 1,0 mL, dipanaskan lalu didinginkan, setelah itu ditambah dengan reagen arsenomolibdat sebanyak 1,0 mL dilakukan pengukuran pada menit 1-24 menit dengan panjang gelombang 769,5 nm. 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimal

sebanyak 1,0 mL. larutan didiamkan selama waktu operating time, selanjutnya diukur pada panjang gelombang 600 nm sampai dengan 800 nm (Ermaiza, 2009).

4. Penentuan Penurunan Glukosa

Prosedur penurunan glukosa didahului melalui beberapa tahap yaitu : 1. Penyiapan kurva standar

Larutan glukosa standar dibuat dengan cara 100 mg glukosa anhidrat dilarutkan dalam 50 mL akuades sehingga didapat konsentrasi 2000 ppm. Dari konsentrasi tersebut dilakukan 5 pegenceran sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Disiapkan 6 labu takar 10 mL yang bersih, masing-masing diisi dengan 1,0 mL larutan glukosa standar tersebut di atas. Satu tabung diisi 1,0 mL akuades sebagai blanko. Dalam masing-masing labu takar di atas ditambahkan 1,0 mL reagen Nelson dan memanaskan semua labu takar pada penangas air mendidih selama 10 menit. Kemudian mengambil semua labu takar dan segera didinginkan selama 5 menit. Setelah dingin ditambahkan 1,0 mL reagen arsenomolibdat dan ditambahkan akuades hingga tanda batas labu takar 10 mL, diukur larutan tersebut pada panjang gelombang 769, 5 nm. Kemudian membuat kurva standar yang bertujuan untuk menentukan nilai regresi linear sebagai rumus yang menjadi dasar untuk perhitungan kadar glukosa pada sampel. Adapun rumus regresi linear yang diperoleh adalah sebagai berikut :

Ditimbang serbuk daun dandang gendis 200,0 gram

Dimaserasi dengan 500 mL etanol 96%

Filtrat Ampas

Dipekatkan menggunakan rotary

evaporator

Ekstrak kental daun dandang gendis

3.7. Skema Kerja

[image:12.612.195.550.193.503.2]

3.7.1 Skema Kerja Proses Ekstraksi dan Fraksinasi Daun Dandang Gendis a. Proses Ekstraksi Daun Dandang Gendis

Fraksi air

Dilarutkan dengan aqua destilata 25 mL Dimasukkan ke dalam corong pisah

Difraksinasi dengan n-heksan5x25 mL

10 gram ekstrak kental daun dandang gendis

Fraksi n-heksan

Difraksinasi dengan etil asetat 3x25 mL

Fraksi etil asetat Fraksi air

Dipekatka n Fraksi daun dandang

gendis

[image:13.612.148.535.156.452.2]

b. Proses Fraksinasi Daun Dandang Gendis (Clinacanthus nutans [Burm.F.] Lindau)

Diambil 1 mL ekstrak dandang gendis

Ditambah 1 mL FeCl3 10%

Terbentuk warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam maka positif mengandung

senyawa fenolik

Sampel diambil sebanyak 1 mL

ditambahkan 1 mL larutan kalium

heksasianoferat (III) dan larutan besi (III) klorida,

Jika membentuk warna biru sampai hitam maka positif mengandung senyawa polifenol.

3.7.2 Skema Kerja Identifikasi Senyawa Aktif 1. Identifikasi Senyawa Fenolik

1. Identifikasi senyawa polifenol

2. Identifikasi Senyawa Polifenol

3. Identifikasi flavonoid a.

Gambar . Uji Identifikasi Fenolik

Ditotolkan ekstrak dan fraksi masing-masing yang sudah dilarutkan etanol 70% serta baku kuersetin

Dielusi dengan n-butanol : asam asetat glasial : air (4:1:5)

Diamati di bawah sinar UV 254 nm dan diberi uap amonia

Dilihat hasilnya, jika positif akan timbul noda kuning intensif, lalu dihitung harga Rf

Sampel dilarutkan dengan etanol 96%

Ditambah 10 mL aquades, dipanaskan 15 menit, lalu disaring

Ditambah 1 mL FeCl3 1%

Hasil positif jika terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman.

Gambar. Uji identifikasi flavonoid

[image:15.612.127.482.85.792.2]

b. Identifikasi flavonoid dengan KLT

Gambar. Identifikasi flavonoid dengan KLT

4. Identifikasi Tanin

Ditambah serbuk Mg dan HCl 2 N

Sampel diambil sebanyak 1,0 mL

Ditambah 10,0 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring

Filtrat 10,0 mL dimasukkan dalam tabung reaksi, dikocok vertikal selama 10 detik

Ditambahkan HCl 1% dan dikocok

Terbentuknya busa yang stabil dalam tabung menunjukkan adanya senyawa golongan saponin. Ditimbang glukosa anhidrat 100,0 mg

Larutan induk glukosa anhidrat 2000 ppm

Dicukupkan dengan akuades hingga 50, 0 mL

Diambil sebanyak 1,0 mL deret konsentrasi 60 ppm dimasukkan labu takar 10, 0 mL

Ditambah 1,0 mL larutan Nelson

Ditutup dengan kapas

Dipanaskan di atas penangas air suhu 100 0 C

Didinginkan

Ditambahkan 1,0 mL larutan arsenomolibdat

Dicukupkan dengan akuades sampai tanda dan

dihomogenkan Diukur absorbansi dari menit ke 1-30 kemudian dicatat

[image:16.612.92.552.254.732.2]

waktu yang memberikan absorbansi maksimal

Gambar. Uji identifikasi tannin 5. Identifikasi saponin

Diambil sebanyak 1,0 mL deret konsentrasi 60 ppm dimasukkan labu takar 10, 0 mL

Ditambah 1,0 mL larutan Nelson

Ditutup dengan kapas

Dipanaskan di atas penangas air suhu 100 0 C

Didinginkan

Ditambahkan 1,0 mL larutan arsenomolibdat

Dicukupkan dengan akuades sampai tanda dan

dihomogenkan Diukur panjang gelombang 769, 5 nm pada menit ke-24

Ditimbang glukosa anhidrat 100,0 mg

Larutan induk glukosa anhidrat 2000 ppm

Dicukupkan dengan akuades hingga 50, 0 mL

Dibuat deret konsentrasi glukosa anhidrat 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm

Larutan baku glukosa 2000 ppm

Dibuat pengenceran konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm

Masing-masing konsentrasi dipipet 1,0 mL dimasukkan keldalam labu takar 10 mL

Ditambah 1,0 mL reagen Nelson dihomogenkan

Ditutup dengan kapas

Dipanaskan diatas penangas air suhu 100 0 C, didinginkan

Didinginkan

Ditambah 1,0 mL reagen Arsenomolibdat dan akuades

Digojog

Diukur serapannya pada panjang gelombang maksimal 769,5 nm

Dibuat kurva standar konsentrasi glukosa vs absorbansi

Dibuat sediaan mikroenkapsulasi ekstrak etanol daun dandang gendis dalam 6 pringkat konsentrasi 40, 80, 120, 160, 200, dan 240 ppm dan kontrol positif

Ditambahkan 3,0 mL larutan baku glukosa anhidrat 60 ppm dan 1 tabung sebagai blangko

Masing-masing konsentrasi dipipet 3,0 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi

Diambil campuran tersebut sebanyak 1,0 mL dimasukkan labu takar 10,0 mL

Ditambah 1,0 mL larutan Nelson

Ditutup dengan kapas

Dipanaskan di atas penangas air suhu 1000 C, didinginkan

Ditambahkan 1,0 mL larutan arsenomolibdat

Dicukupkan dengan akuades sampai tanda batas dan dihomogenkan

Diukur serapan pada panjang gelombang 769,5 nm pada menit ke-24

Dilakukan analisis data dengan uji anava dua jalan dengan program SPSS for windows versi 16