PRODUKSI DAN KARAKTERISASI SENYAWA INHIBITOR
α
-GLUKOSIDASE Streptomyces sp. BWA 65
DEWI LIIJULFITRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Produksi dan Karakterisasi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase Streptomyces sp. BWA 65 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Dewi Liijulfitri
ABSTRAK
DEWI LIIJULFITRI. Produksi dan Karakterisasi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase
Streptomyces sp. BWA 65. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan RUDI HERYANTO.
Streptomyces sp. BWA 65 endofit asal brotowali (Tinospora crispa)
menghasilkan senyawa inhibitor α-glukosidase yang berperan sebagai antidiabetes. Penelitian ini bertujuan memproduksi dan mengkarakterisasi senyawa inhibitor α -glukosidase Streptomyces sp. BWA 65 serta menguji kemampuannya sebagai antidiabetes berdasarkan aktivitas penghambatan α-glukosidase. Streptomyces sp. BWA 65 diremajakan dalam media Yeast Soluble Starch Agar (YSA) selama 7 sampai 10 hari, dikulturkan dalam media cair selama 7 hari, dan diproduksi dalam media International Streptomyces Project-2 (ISP-2) dengan waktu produksi, yaitu: 5, 10, 15, dan 20 hari. Supernatan diekstraksi dengan etil asetat serta diuji penghambatan α-glukosidase pada ekstraknya. Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 kemudian diuji nilai Inhibitor Concentration (IC50). Profil karakteristik
senyawa yang terkandung dalam ekstrak dianalisis dengan Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS). Hasil menunjukkan aktivitas inhibitor α-glukosidase tertinggi pada media ISP-2 sebesar 98.50% dengan waktu produksi 10 hari. Nilai IC50 ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 sebesar 0.047 µg ml-1. Hasil
analisis ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 dengan menggunakan GC-MS setelah diinterpretasi dengan mengacu data OPCWTEST.M, diperoleh 7 puncak dengan 7 komponen. Senyawa yang yang diduga terkandung dalam ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65, yaitu : 9-octadecenoic acid, (E)-, oleic acid, dan 6-octadecenoic acid, (Z)-.
Kata kunci: inhibitor α-glukosidase, IC50, GC-MS, Streptomyces sp. BWA 65
ABSTRACT
DEWI LIIJULFITRI. Production and Characterization of -Glukosidase Inhibitor Compounds of Streptomyces sp. BWA 65. Supervised by YULIN LESTARI and RUDI HERYANTO.
Endophitic Streptomyces sp. BWA 65 from brotowali (Tinospora crispa) produces α-glucosidase inhibitor compound that acts as antidiabetic. This study aimed to produce and characterize α-glucosidase inhibitory compound of
Streptomyces sp. BWA 65 and assay its biological function as antidiabetic based on α-glucosidase inhibitory activity. Streptomyces sp. BWA 65 which was rejuvenated in Yeast Soluble Starch Agar (YSA) for 7 until 10 days, was then cultured in a liquid medium for 7 days, and produced in International Streptomyces Project-2 (ISP-2) for: 5, 10, 15, and 20 days. Then, supernatant was extracted with ethyl acetate and was assayed for α-glucosidase inhibition activity. The ethyl acetate extract of
Streptomyces sp. BWA 65 was also assayed for its Inhibitor Concentration 50 (IC50)
activity was 98.50% when the Streptomyces sp. BWA 65 was grown on ISP-2 10 days production time. The IC50 of ethyl acetate extract of Streptomyces sp. BWA 65
was 0.047 µg ml-1. The results of GC-MS analysis were interpreted with OPCWTEST.M database showed that the ethyl acetate extract of Streptomyces sp. BWA 65 contained 7 peaks with 7 components obtained. The chemical components of ethyl acetate extract of Streptomyces sp. BWA 65, were: 9-octadecenoic acid, (E)-, oleic acid, dan 6-octadecenoic acid, (Z)-.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
PRODUKSI DAN KARAKTERISASI SENYAWA INHIBITOR
α
-GLUKOSIDASE Streptomyces sp. BWA 65
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Produksi dan Karakterisasi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase Streptomyces sp. BWA 65
Nama : Dewi Liijulfitri NIM : G34100074
Disetujui oleh
Dr Ir Yulin Lestari Pembimbing I
Rudi Heryanto, SSi, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi Ketua Departemen
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamiin. Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan karya ilmiah dengan judul “Produksi dan Karakterisasi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase
Streptomyces sp. BWA 65”. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan kegiatan penelitian yang dilaksanakan selama kurang lebih enam bulan yang dimulai pada bulan Januari sampai dengan Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Yulin Lestari dan Bapak Rudi Heryanto, SSi, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan dan
dukungan materi selama penelitian dan penyusunan skripsi. Ungkapan terima kasih
juga penulis sampaikan kepada Bapak Dr Berry Juliandi, Msi selaku dosen penguji atas saran dan diskusi yang diberikan. Terima kasih penulis sampaikan orang tua tercinta, keluarga, dan sahabat atas doa, motivasi, dan kasih sayangnya. Tak lupa juga penulis mengucapkan terima kasih kepada Mba Sari, Kak Aar, Kak Sipri, Indah, Alfin, Keluarga Laboratorium Mikrobiologi, teman-teman Biologi 47 serta staf Laboratorium Mikrobiologi IPB yang tidak dapat disebutkan satu-persatu atas kerjasama, dukungan, dan semangatnya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Yayasan Karya Salemba Empat (KSE) yang telah memberikan dukungan materi selama penulis menyelesaikan studi.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi penulis maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, September 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
METODE 2
Waktu dan Tempat 2
Bahan dan Alat 2
Peremajaan, Persiapan Kultur Starter, dan Optimasi Produksi Senyawa
Inhibitor α-Glukosidase 2
Produksi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase dalam Fermentor 2
Uji Aktivitas Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 3
Penentuan Nilai IC50 Senyawa Inhibitor α-Glukosidase 3
Karakterisasi Senyawa Inhibitor α-Glukosidase dengan GC-MS 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 4 Hasil 4 Pembahasan 6 SIMPULAN DAN SARAN 10 Simpulan 10 Saran 10
DAFTAR PUSTAKA 10
LAMPIRAN 13
RIWAYAT HIDUP 15
DAFTAR TABEL
1 Aktivitas inhibisi acarbose dan Streptomyces sp. BWA 65 pada berbagai
konsentrasi 5
DAFTAR GAMBAR
1 Isolat Streptomyces sp. BWA 65 pada media peremajaan YSA 42 Aktivitas inhibitor α-glukosidase ekstrak dan rata-rata bobot biomassa pada media ISP-2 dengan waktu produksi 5-20 hari 4 3 Nilai IC50ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 5 4 Nilai IC50acarbose 5
5 Kromatogram GC-MS ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dan rata-rata bobot ekstrak Streptomyces sp. BWA 65 132 Uji aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase pada ISP-2 13
3 Aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dalam fermentor 13
4 Komposisi media 13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang disebabkan defisiensi insulin atau penurunan respon terhadap insulin dalam jaringan target (Campbell et al. 2010). Penyakit ini menjadi permasalahan di Indonesia karena jumlah penderitanya semakin meningkat. Menurut survey Badan Kesehatan Dunia (WHO), Indonesia menduduki urutan keempat dengan prevalensi diabetes tertinggi, setelah China, India, dan Amerika. Penderita diabetes di Indonesia pada tahun 2000 mencapai 8.4 juta jiwa (WHO 2010). Jumlah tersebut diperkirakan akan meningkat lebih dari dua kalinya pada tahun 2030 (Wild et al. 2004).Jumlah penderita DM di Indonesia meningkat sebanyak 4.5 juta jiwa pada 1996 dan diperkirakan akan terus meningkat hingga 21.3 juta jiwa pada tahun 2030 (Kemenkes 2010). Lebih dari 95% penderita diabetes merupakan penderita diabetes tipe II atau disebut non-insulin dependent diabetes (Bailey dan Day 2003).
American Diabetes Association (ADA) menetapkan konsentrasi glukosa darah normal saat puasa kurang dari 100 mg dL-1. Glukosa plasma terganggu jika konsentrasi glukosa saat puasa antara 100-125 mg dL-1, sedangkan toleransi glukosa terganggu jika konsentrasi glukosa darah setelah pembebanan glukosa 75g, antara 140-199 mg dL-1. Seseorang dikatakan menderita diabetes jika konsentrasi glukosa darah saat puasa lebih dari 126 mg dL-1 atau bila konsentrasi glukosa darah setelah pembebanan 75 g lebih dari 200 mg dL-1 (ADA 2004). Salah satu metode pengobatan DM tipe II yang sedang berkembang adalah menghambat aktivitas enzim α-glukosidase. Senyawa inhibitor α-glukosidase adalah senyawa yang mampu menghambat digesti karbohidrat sehingga kadar glukosa darah tetap normal. Saat ini, obat antidiabetes yang telah dikomersialkan adalah acarbose senyawa inhibitor α-glukosidase yang diisolasi dari Actinoplanes
sp. asal Kenya (McGown 2006).
Indonesia memiliki keanekaragaman aktinomiset yang berpotensi sebagai antidiabetes. Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif bermiselium yang berperan sebagai penghasil senyawa bioaktif (Lestari 2006). Senyawa bioaktif tersebut memiliki beragam fungsi, seperti: antibiotik, antitumor, antifungi, yang bermanfaat dalam bidang kesehatan (Dehnad et al. 2010). Streptomyces sp. BWA 65 asal brotowali (Tinospora crispa) diketahui mampu menghasilkan senyawa inhibitor α-glukosidase dengan kemampuan penghambatan sebesar 77.8% pada konsentrasi 1000 µg ml-1 (Pujiyanto 2012). Ekstrak etil asetat dari Streptomyces
sp. BWA 65 mengandung gen sedoheptulosa 7-fosfat siklase penghasil inhibitor α-glukosidase (Velina 2012).
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan memproduksi dan mengkarakterisasi senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65 serta menguji kemampuannya sebagai antidiabetes berdasarkan aktivitas penghambatan α-glukosidase.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat Streptomyces sp. BWA 65, media Yeast Soluble Starch Agar (YSA), media cair, dan media International Streptomyces Project-2 (ISP-2) (Lampiran 4). Alat yang digunakan, yaitu: fermentor Infors HT Minifors, sentrifuse Beckman J2-21, GC-MS Agilent 7890 5975, serta peralatan laboratorium, seperti: erlenmeyer 250 ml, shaker, inkubator, dan rotary evaporator.
Peremajaan, persiapan kultur starter, dan optimasi produksi senyawa inhibitor α-glukosidase
Streptomyces sp. BWA 65 diremajakan pada media YSA dan diinkubasi selama 7 sampai 10 hari pada suhu ruang (24 sampai 26 oC). Hasil peremajaan
Streptomyces sp. BWA 65 diinokulasikan ke dalam media cair berisi 0.1% soluble starch, 0.5% pepton, dan 0.1% ektrak khamir (Chen et al. 2004). Kultur diinkubasi selama 7 hari dan digoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang. Kultur ini digunakan sebagai starter. Produksi senyawa antidiabetes menggunakan media ISP-2 dengan waktu produksi, yaitu: 5, 10, 15, dan 20 hari pertumbuhan. Sebanyak 1% kultur starter diinokulasikan ke media ISP-2. Panen filtrat dan uji aktivitas dilakukan pada hari ke 5, 10, 15, dan 20 hari (Ulya 2009). Waktu panen terbaik dipilih berdasarkan besarnya nilai penghambatan α -glukosidase yang terkandung dalam ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65.
Produksi senyawa inhibitor α-glukosidase dalam fermentor
3 dikeringkan dalam oven bersuhu 60 0C selama 24 jam. Biomassa kering kemudian ditimbang bobotnya. Proses ekstraksi dilakukan dengan cara supernatan ditambahkan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1:1 kemudian dihomogenisasi selama 2 jam dan dibiarkan selama 2 jam sehingga terpisah antara fase air dan fase etil asetat. Fase etil asetat kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator dan ditimbang bobotnya. Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 kemudian diencerkan dengan dimethyl sulfoxide (DMSO) dan diuji aktivitas inhibitor α-glukosidase.
Uji aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase
Larutan stok enzim terdiri atas 1 mg α-glukosidase di dalam 100 ml buffer fosfat pH 7 yang mengandung 200 mg bovin serum albumin. Sebanyak 1 ml konsentrasi larutan tersebut diencerkan 25 kali dengan buffer fosfat pH 7. Larutan substrat terdiri atas p-nitrofenil α-D-glukopiranosida 20 mM sebanyak 50 µl, 50 µl buffer fosfat pH 7, dan 10 µl larutan DMSO. Campuran diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 0C, 50 µl buffer fosfat, dan ditambahkan enzim, kemudian diinkubasi 15 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 800 µl natrium karbonat. Absorban p-nitrofenol yang dilepaskan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Inhibitor α-glukosidase
acarbose 50 mg/tablet (Glucobay; Bayer) digunakan sebagai pembanding. Obat ini dilarutkan dengan akuades sehingga konsentrasinya 1% (b/v). Larutan pembanding diperlakukan sama dengan sampel. Daya hambat ekstrak kasar
Streptomyces sp. terhadap aktivitas α-glukosidase dihitung dalam persen inhibisi dengan rumus: [(C-S)/C x 100%], dengan C adalah absorban kontrol dan S merupakan absorban sampel (Moon et al. 2011).
Penentuan nilai IC50 senyawa inhibitor α-glukosidase
Penentuan nilai IC50 dilakukan dengan menguji aktivitas penghambatan
ekstrak dengan lima konsentrasi, yaitu: 1000 µg ml-1, 500 µg ml-1, 250 µg ml-1, 125 µg ml-1, dan 62.5 µg ml-1 (Pujiyanto 2012). Selanjutnya, dibuat persamaan garis yang merupakan fungsi dari konsentrasi ekstrak (x) dan besar penghambatan yang dihasilkan (y).
Karakterisasi senyawa inhibitor α-glukosidase dengan GC-MS
4
Produksi senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65
Streptomyces sp. BWA 65 yang ditumbuhkan selama 7 sampai 10 hari pada suhu ruang (24-26 0C) dalam media peremajaan YSA, memiliki dua jenis miselium, yaitu: miselium aerial yang berwarna putih dan miselium substrat yang berwarna cokelat (Gambar 1). Miselium aerial yang berserbuk, kompak, dan berpigmen mengkarakterisasi koloni yang matang.
Gambar 1 Isolat Streptomyces sp. BWA 65 pada media peremajaan YSA
Streptomyces sp. BWA 65 pada media ISP-2 menunjukkan persentase inhibisi α-glukosidase sebesar 98.50% pada waktu produksi 10 hari (Lampiran 2) dengan bobot biomassa 0.0156 ± 0.003 (Lampiran 1). Aktivitas inhibitor α -glukosidase ekstrak dan rata-rata bobot biomassa mengalami peningkatan pada waktu produksi 5 sampai dengan 10 hari dan mengalami penurunan pada hari ke-10 sampai hari ke-20 (Gambar 2).
5 Karakter senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65
Nilai IC50 senyawa inhibitor α-glukosidase
Nilai IC50 ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 pada konsentrasi
1000 µg ml-1 sebesar 96.08% sedangkan acarbose pada konsentrasi yang sama sebesar 97.46% (Tabel 1). Semakin tinggi konsentasi acarbose dan Streptomyces
sp. BWA 65, maka nilai persentase inhibisi α-glukosidase semakin meningkat. Tabel 1 Aktivitas inhibisi acarbose dan Streptomyces sp. BWA 65 dalam lima
konsentrasi Konsentrasi
(µg/ml)
Inhibisi (%)
Acarbose Streptomyces sp. BWA 65
62.5 88.13 83.33
125 88.89 86.60
250 91.53 90.85
500 96.33 93.46
1000 97.46 96.08
Hasil persamaan logaritmik ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 menunjukkan y = 4.6686In(x) + 64.287 dengan R2 sebesar 0.9908 (Gambar 3). Nilai x pada persamaan tersebut sebesar 0.047 µg ml-1. Hasil tersebut kemudian dibandingkan dengan persamaan logaritmik acarbose sebagai kontrol positif yang menunjukkan nilai y = 3.7654In(x) + 71.677 dengan R2 sebesar 0.9417. Nilai x pada persamaan tersebut sebesar 0.003 µg ml-1. Nilai IC50 acarbose tersebut lebih rendah dari nilai IC50 ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 yaitu sebesar
0.047 µg ml-1 (Gambar 4).
Gambar 3 Nilai IC50ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65
Gambar 4 Nilai IC50acarbose
0 200 400 600 800 1.000 1.200
In
0 200 400 600 800 1000 1200
6
Karakter senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65 berdasarkan analisis GC-MS
Hasil karakterisasi ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 dengan GC-MS, setelah diinterpretasi dengan mengacu data OPCWTEST.M yang ada di dalam database, maka diperoleh 7 puncak yang mengindikasikan 7 komponen (Gambar 5). Senyawa yang diduga terkandung dalam ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65, yaitu: 9-octadecenoic acid, (E)-, oleic acid, dan 6-octadecenoic acid, (Z)- (Lampiran 5).
Gambar 5 Kromatogram GC-MS ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 Pembahasan
Produksi senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65
Streptomyces sp. BWA 65 merupakan aktinomiset endofit yang diisolasi dari tanaman brotowali (Tinospora crispa). Aktinomiset endofit merupakan aktinomiset yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni tanpa membahayakan inang. Pujiyanto (2012) melakukan penapisan kemampuan inhibitor α-glukosidase terhadap 32 isolat aktinomiset endofit brotowali dan mendapatkan bahwa Streptomyces sp. BWA 65 memiliki kemampuan tertinggi sebagai inhibitor α-glukosidase.
7 berasosiasi dengan oksigen dan hidrogen (Sunatmo 2009). Pujiyanto et al. (2012) menyatakan isolat BWA 65 memiliki miselium udara yang tidak bercabang serta rantai spora spiral dengan spora berbentuk silinder yang permukaanya halus pada pengamatan dengan mikroskop elektron SEM (Scanning Electron Microscope).
Streptomyces sp. BWA 65 ditumbuhkan dalam media cair untuk memperbanyak sel yang digunakan sebagai starter (inokulum) pada proses produksi dan mengadaptasi sel terhadap media cair (Sunaryanto 2011). Produksi senyawa inhibitor α-glukosidase dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti: media, waktu produksi, suhu, dan pH. Optimasi diperlukan untuk memperoleh metabolit sekunder yang mampu menghasilkan inhibitor α-glukosidase secara optimal. Media merupakan sumber nutrisi yang mempengaruhi kemampuan tumbuh dan aktivitas metabolit sekunder yang dihasilkan.
Hasil menunjukkan isolat Streptomyces sp. BWA 65 yang ditumbuhkan dalam media ISP-2 dalam waktu pertumbuhan 10 hari mempunyai persentase inhibisi α-glukosidase sebesar 98.50% (Lampiran 2). Media ISP-2 mengandung
yeast extract (ekstrak khamir) sebagai sumber nitrogen dan kaya akan sumber karbon yang berasal dari dekstrosa dan malt extract (ekstrak malt). Aktivitas inhibitor α-glukosidase dan rata-rata bobot biomassa pada media ISP-2 dengan waktu produksi 5 sampai 10 hari mengalami peningkatan (Gambar 2). Peningkatan aktivitas inhibitor α-glukosidase rata-rata biomassa tersebut diduga disebabkan pertumbuhan sel telah memasuki tahap akhir fase log atau mulai memasuki fase stasioner (Ulya 2013). Sel pada fase stasioner melakukan adaptasi terhadap kondisi yang tidak menguntungkan dengan menghasilkan metabolit sekunder yang dapat berfungsi sebagai antimikroba dan anti oksidan (Maier et al.
2000). Metabolit yang dihasilkan pada fase stasioner diduga merupakan metabolit yang berperan dalam pertahanan diri atau adaptasi terhadap kondisi lingkungan tertentu (Fadhilah 2012). Peningkatan persentase inhibisi berkorelasi positif dengan rata-rata bobot biomassa. Semakin tinggi bobot biomassa maka persentase inhibisi α-glukosidase ekstrak semakin meningkat (Gambar 2). Penurunan aktivitas inhibitor α-glukosidase dan rata-rata bobot biomassa pada waktu produksi 10 sampai 20 hari diduga disebabkan terbatasnya nutrisi pada akhir fase stasioner sehingga biomassa berupa asam organik hasil hidrolisis gula digunakan dalam proses sporulasi. Produksi antibiotik pada Streptomyces dipicu keterbatasan nutrisi dari lingkungan yang berkaitan dengan sporulasi. Proses sporulasi bakteri akan membentuk struktur dorman yang dapat mempertahankan hidup lebih lama (Sunatmo 2009). Menurut Ulya (2013), kondisi nutrisi yang terbatas pada akhir fase stasioner dapat menurunkan aktivitas metabolisme yang digunakan dalam pertumbuhan.
8
Enzim α-glukosidase merupakan enzim yang menghidrolisis substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa menjadi produk p-nitrofenol yang berwarna kuning dan glukosa (Moon et al. 2011). Substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa merupakan representasi karbohidrat yang dipecah oleh enzim α-glukosidase. Inhibitor α-glukosidase menghambat aktivitas enzim α-glukosidase dalam menghidrolisis substrat. Mekanisme enzim inhibitor α-glukosidase yaitu enzim memiliki sisi aktif yang dapat mengenali secara spesifik substrat yang sesuai sehingga memungkinkan untuk merancang inhibitor enzim yang dapat menghalangi pengikatan substrat pada enzim sehingga produk tidak terbentuk. Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 berperan sebagai inhibitor α -glukosidase. Senyawa pada sampel diharapkan dapat berkompetisi dengan substrat untuk menempel pada sisi katalitik enzim sehingga produk tidak terbentuk. Berkurangnya produk ditandai dengan intensitas warna yang tidak pekat. Semakin kurang intensitas warna yang dihasilkan maka semakin sedikit pula produk yang terbentuk (Irawan 2011).
Aktivitas enzim diukur berdasarkan absorbansi p-nitrofenol yang berwarna kuning. Semakin tinggi selisih absorbansi sampel dengan penambahan enzim dan absorbansi sampel tanpa penambahan enzim, maka persentase inhibisi α -glukosidase semakin rendah.
Karakter senyawa inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65
Nilai IC50 merupakan nilai yang menunjukkan konsentrasi ekstrak sebesar
50% terhadap aktivitas inhibisi α-glukosidase. Penentuan nilai IC50 dilakukan
dengan menguji aktivitas penghambatan ekstrak dengan beragam konsentrasi yang kemudian dibuat persamaan linear. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 pada konsentrasi 1000 µg ml-1 memiliki persen inhibisi 96.08%, sedangkan Pujiyanto (2012) menyebutkan bahwa ekstrak etil asetat isolat BWA 65 menghasilkan senyawa inhibitor α-glukosidase sebesar 77.8% pada konsentrasi 1000 µg ml-1. Perbedaan tingkat aktivitas inhibitor α -glukosidase diduga disebabkan oleh media, waktu produksi, dan proses fermentasi yang berbeda. Produksi senyawa inhibitor α-glukosidase dilakukan dalam fermentor sehingga kondisi fermentasi seperti suhu, pH, konidisi oksigen, dan kecepatan agritasinya dapat diatur sesuai kondisi optimum pertumbuhan
Streptomyces sp. BWA 65. Produksi dalam fermentor menghasilkan persen inhibisi sebesar 98.61% dengan waktu produksi 10 hari (Lampiran 3). Hasil yang diperoleh pada tabel 1 menunjukkan semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka aktivitas penghambatan α-glukosidase akan semakin meningkat.
Nilai IC50 ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 lebih tinggi dari acarbose. Persamaan logaritmik menunjukkan bahwa penghambatan sebesar 50% aktivitas enzim α-glukosidase terjadi pada konsentrasi 0.047 µg ml-1 pada ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 (Gambar 3) sedangkan pada acarbose
sebesar 0.003 µg ml-1 (Gambar 4). Hasil pengujian nilai IC50 ekstrak Streptomyces
sp. BWA 65 pada beberapa pelarut menunjukkan bahwa nilai IC50 terkecil
diperoleh dari ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 sebesar 28.6 µg ml-1 (Pujiyanto 2012). Semakin rendah nilai IC50 maka semakin tinggi aktivitas
9 diduga berkaitan dengan tingkat kemurnian ekstrak yang digunakan. Acarbose
merupakan produk komersial berupa sediaan murni inhibitor kuat terhadap aktivitas metabolisme sukrosa (Ghadyale et al. 2012). Namun, Indonesia mengimpor acarbose dengan biaya yang tinggi. Oleh sebab itu, ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65 dapat dikembangkan potensinya sebagai alternatif pengobatan diabetes dengan bahan baku yang diperoleh asli dari Indonesia.
Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) merupakan alat yang digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi dari senyawa organik volatil atau semi volatil dalam campuran kompleks. Kromatografi gas (GC) memberikan kemampuan untuk separasi senyawa dengan resolusi yang tinggi (Fowlin 1995). Spektroskopi massa (MS) berfungsi mengidentifikasi dan memberikan informasi mengenai struktur senyawa (Kitson et al. 1996). Instrumen ini akan menghasilkan berkas ion dari suatu zat uji. Berkas tersebut kemudian dipilah dan dikelompokkan menjadi spektrum-spektrum yang akan sesuai dengan perbandingan massa terhadap muatan serta merekam kelimpahan relatif tiap jenis ion yang ada (Kitson et al. 1996).
Ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 dilakukan karakterisasi komponen yang terkandung didalamnya menggunakan analisis GC-MS. Hasil analisis yang teridentifikasi oleh GC-MS menunjukkan puncak yang bervariasi. Menurut Utami (2011) perbedaan tersebut bergantung pada kepolaran zat yang dianalisis, yang menentukan banyak sedikitnya waktu untuk berinteraksi dengan fase diam (beberapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom). Senyawa tertentu kemudian memerlukan waktu untuk bergerak melalui kolom menuju ke detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunjukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa tersebut. Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh jumlah puncak (peak) pada kromatogram, sedangkan nama senyawa yang ada diinterpretasikan berdasarkan data spektra dari setiap puncak dengan menggunakan metode pendekatan pustaka.
Hasil karakterisasi ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 dengan GC-MS, setelah diinterpretasi dengan mengacu data OPCWTEST.M yang ada di dalam database dari GC-MS, diperoleh 7 puncak dengan 7 komponen (Gambar 5). Senyawa yang diduga terkandung dalam ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65, yaitu: 9-octadecenoic acid, (E)-, oleic acid, dan 6-octadecenoic acid, (Z) (Lampiran 5). Senyawa asam lemak tidak jenuh yang terkandung dalam ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 dibutuhkan oleh tubuh sebagai prekursor hormon yang meregulasi banyak fungsi dari tubuh. Asam oleat (9-octadecenoic acid dan 6-octadecenoic acid) adalah asam lemak tidak jenuh yang mekanisme kerjanya menghambat produsi glukosa karena diduga adanya korelasi antara membran adiposit dan insulin yang memediasi transpor glukosa (Sediarso et al.
10
Berdasarkan data tersebut berhasil diketahui bahwa ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65 mengandung senyawa inhibitor α-glukosidase yang dapat dikaji lebih lanjut sebagai antidiabetes.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Streptomyces sp. BWA 65 asal brotowali (Tinospora crispa) memiliki aktivitas inhibitor α-glukosidase yang berperan sebagai antidiabetes. Aktivitas inhibitor α-glukosidase tertinggi diperoleh pada media ISP-2 sebesar 98.50% dengan waktu produksi 10 hari. Nilai IC50 ekstrak etil asetat Streptomyces sp.
BWA 65 sebesar 0.047 µg ml-1.Hasil analisis dengan GC-MSdiperoleh 7 puncak dengan 7 komponen. Senyawa yang diduga terkandung dalam ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65, yaitu: 9-octadecenoic acid, (E)-, oleic acid, dan 6-octadecenoic acid, (Z)-.
Saran
Saran untuk penelitian selanjutnya adalah penelitian dapat dilakukan dengan rancangan percobaan yang menggabungkan empat variabel optimasi secara langsung, yaitu: media, waktu produksi, suhu, dan pH serta diujikan ekstraknya secara in-vitro. Selain itu, perlu dilakukan pemurnian senyawa aktif yang berpotensi sebagai antidiabetes.
DAFTAR PUSTAKA
[ADA] American Diabetes Association. 2004. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 27: s5-s10.
Akpuaka A, Ekwenchi MM, Dashak DA, Dildar A. 2013. Biological activity of characterized isolates of n-hexane extract of Azadirachta indica A. Juss (Neem) leaves. N Y Sci J. 6(6):119-124.
Bailey CJ, Day C. 2003. Antidiabetic drugs. Br J Cardiol 10: 128-136.
Bajaj M, et al. 2007. Effects of peroxisome poliferator-activated receiptor(PPAR)-α dan PPAR- agonist on glucose and lipid metabolism in patients with type 2diabetes mellitus. Deiabetologia 50: 1723-1731.
Campbell NA, Jane BR. 2010. Biologi Edisi Kedelapan Jilid Ketiga. Jakarta (ID) : Erlangga.
Chen HX, Yan W, Lin L, Zheng W, Zhang. 2004. A new method for screening alpha glucosidase inhibitors and application to marine microorganisms.
PharmaceuticalBiol. 42: 416-421.
11 Fadhilah AM. 2012. Aktivitas dan karakter senyawa inhibitor ACE Streptomyces
sp. AEP-1 endofit tanaman pegagan (Centella asiatica) [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Fowling IA. 1995. Gas Chromatography Edisi ke-2. Chichester (UK): John Wiley & Sons.
Ghadyale V, Shrihari T, Vivek H, Akalpita A. 2012. Effective control of postprandial glucose level through inhibition of intestinal alpha glucosidase by Cymbopogon martinii (Roxb.). Evi Based Complement Alternative Med. 10:1-6.
Irawan F. 2011. Aktivitas antidiabetes dan analisis fitokimia ekstrak air dan etanol daun waru (Graptophyllum pictum (L.) Griff) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
[Kemenkes] Kementerian Kesehatan. 2010. Diabetes Melitus Penyebab Kematian Nomor 6 di Dunia: Kemenkes Tawarkan Solusi Cerdik Melalui Posbindu. [Internet]. [diunduh 2013 November 27]. Tersedia pada: http: //www.depkes.go.id/index.php?vw=2&id=2383.
Kalaisezhiyen P, Vadivukkarasi S. 2012. GC-MS evaluation of chemical constituents from methanolic leaef extract of Kedrostis foetidissima (Jasq.) Cogn. Asian J of Pharm Clin Res.5: 77-81.
Kitson FG, Larsen BS, McEwan CN. 1996. Gas Chromatography and Mass Spectroscopy. London (UK) : Academic Pr.
Lestari Y. 2006. Identification of indigenous Streptomyces spp. producing antibacterial compounds. J Mikrobiol Indones. 11:99-101.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2006. Brock: Biology of Microorganisms. New Jersey American (US): Prentice Hall.
Maier RM, Pepper IL, Gerba CP. 2000. Environmental Microbiology. Canada (CA): Academic Pr.
McGown J. 2006. Diabetes Drug Produced by a Microbe in Out of Africa: Mysteries of Access and Benefit Sharing. Beth Burrows (ed). Washington (US): The Edmonds Institute.
Moon HE, Islam MN, Ahn Br, Chowdry SS, Shin HS, Jung HA, Choi JS. 2011. Protein tyrosine 1 B and α-glucosidases inhibitory phylotonins from edible brown algae, Eicklonia stolonifera and Eisena bicyclis. Biosci Biotechnol Biochem. 75:1472-1480.
[NIST] National Institute of Standards and Technology. 2014. Material measurement laboratory. [diunduh 20 Juli 2014]. Tersedia pada: http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=621-61-4&Units=SI.
Pujiyanto S. 2012. Aktivitas inhibitor α-glukosidase dan karakterisasi aktinomiset endofit yang diisolasi dari beberapa tanaman obat diabetes [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Pujiyanto S, Yulin L, Antonius S, Sri B, Latifah KD. 2012. Alpha-glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medical plants. Int J Pharm Sci. 4:328-333. Sediarso, Sunaryo H, dan Amalia N. 2008. Efek antidiabetes dan identifikasi
12
Sunaryanto R. 2011. Isolasi, purifikasi, identifikasi, dan optimasi fermentasi antibiotik yang dihasilkan oleh aktinomiset laut [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sunatmo TI. 2009. Mikrobiologi Esensial. Jakarta (ID) : Ardy Agency.
Ulya J. 2009. Kemampuan penghambatan Streptomyces spp. terhadap mikroba patogen tular tanah pada beberapa kondisi pertumbuhan: jenis media, waktu produksi, pH, dan suhu [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Utami OY. 2011. Komponen minyak atsiri daun sirih (Piper betle L.) dan
potensinya dalam mencegah ketengikan minyak kelapa [skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Velina Y. 2012. Deteksi dan kloning gen inhibitor α-glukosidase Streptomyces sp. BWA 65 serta potensinya sebagai anti hiperglikemik pada mencit (Mus musculus) [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Waites et al. 2001. Industrial Microbiology: An Introduction. London (UK) : Blackwell Science.
Wild S, Roglic G, Green A, Sincre R King H. 2004. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27:1047-1053.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dan rata-rata bobot ekstrak Streptomyces sp. BWA 65
Lampiran 2 Uji aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase pada ISP-2 Hari ke- Rata-rata absorban Rata-rata terkoreksi
Inhibisi
Lampiran 3 Aktivitas senyawa inhibitor α-glukosidase dalam fermentor Hari ke- Inhibisi ekstrak (%) Rata-rata bobot biomassa (1x10-3 g)
5 96.02 -
10 98.61 5.52
Lampiran 4 Komposisi media
Media Komposisi Jumlah (g) per
liter media
Yeast Soluble starchAgar (YSA) Yeast extract 2 gram
Soluble starch 10 gram
Agar 15 gram
Media cair Soluble starch 0.1%
Pepton 0.5%
Yeast extract 0.15%
International Streptomyces Project-2 (ISP-2) Malt extract 10 gram
Dextrose 4 gram
Yeast extract 4 gram
14
Lampiran 5 Senyawa aktif Streptomyces sp. BWA 65 dengan GC-MS Puncak Nama senyawa Waktu
retensi
Area
(%) Struktur senyawa
a
1 Oleic acid 24.330 0.02
2 9-octadecenoic acid, (E)-
25.865 0.10
3 Pyridine-3 carboxamide, oxime, N
26.600 0.15
4
6-octadecenoic acid, (Z)-
27.013 0.10
5 2,3
dihydroxypropyl elaidate
28.328 0.14
6 Octadec-9-enoic acid
28.962 0.23
7 Elaidic acid, isopropyl ester
29.752 0.06
a
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 11 April 1992 dari Ayah Juju dan Ibu Ai Suarsih. Penulis adalah putri kedua dari empat bersaudara. Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Kornita dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Biologi Dasar pada tahun ajaran 2011-2014 dan Mikrobiologi Dasar pada tahun 2013-2014. Tanggal 3-5 Juli 2012 penulis melaksanakan Studi Lapangan di Taman Nasional Gunung Gede-Pangrango (TNGGP) dengan judul Keanekaragaman Liken di Kebun Raya Cibodas. Penulis pernah melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Pengkajian Bioteknologi-Badan Penelitian dan Pengkajian Teknologi (Biotek-BPPT) Tanggerang Selatan dengan judul Penapisan Actinomycetes Laut Penghasil Senyawa Antimikroba di Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Serpong, Tangerang Selatan.
Penulis juga aktif dalam berbagai organisasi kampus. Tahun 2011-2012 penulis aktif sebagai sekretaris umum Bina Desa BEM KM IPB dan sebagai staf Divisi Informasi dan Komunikasi Biologi (INFOKOM HIMABIO). Tahun 2012-2013 penulis aktif sebagai Staf Kementrian Sosial dan Masyarakat BEM KM IPB. Kepanitiaan yang diikuti penulis selama perkuliahan yaitu Pesta Sains Nasional (PSN) dan Gebyar Nusantara (GENUS) sebagai Divisi Kesekertariatan, serta IPB
Sosial Health and Care (I-SHARE) 2013 sebagai Bendahara.
Penulis juga aktif mengikuti berbagai perlombaan penulisan karya ilmiah. Beberapa prestasi yang diraih oleh penulis antara lain : Program Hibah Bersaing Desa (PHBD) 2011, program Technology for Indonesia (TFI), Program Kreativitas Mahasiswa Bidang Pemberdayaan Masyarakat (PKM-M) 2014 dan
