PENGARUH PEMBERIAN MINYAK GORENG BEKAS YANG DIMURNIKAN DENGAN BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia) TERHADAP KETEBALAN ARTERI KORONARIA TIKUS WISTAR
JANTAN
Oleh
BILLY ADITYA PRATAMA
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA KEDOKTERAN
Pada
Jurusan Pendidikan Dokter
Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG
ABSTRACT
THE INFLUENCE OF GIVING USED COOKING OIL WHICH PURIFIED BY NONI FRUIT (Morinda citrifolia) TO THE THICKNESS OF
CORONARY ARTERY ON MALE WISTAR RAT
By
BILLY ADITYA PRATAMA
Consumption of used cooking oil will caused deposition of fat cells in various organs such as on coronary arteries. This process can be prevented by using noni fruit for purification on used cooking oil. Noni fruit contains antioxidants which can inhibit oxidation and neutralize free radicals. The aim for this research were to find out the effect of used cooking oil administration to the thickness of coronary artery and the effect of giving used cooking oil that already purified by noni fruit to the thickness of coronary artery on male Wistar rats.
The results showed significant differences (p<0,05) on GA–GB, GA–GC, GB– GC, GB–GD and GC–GD. However, there are no significant differences between GD–GA. The mean thickness of GA: 32,26 ± 12,24 µm, GB: 46,50 ± 10,86 µm, GC: 60,55 ± 15,07 µm and GD:33,20 ± 7,25 µm. This suggests that giving used cooking oil will caused thickness of the coronary artery and giving used cooking oil that already purified by noni fruit can lowering the thickness of coronary artery.
ABSTRAK
PENGARUH PEMBERIAN MINYAK GORENG BEKAS YANG DIMURNIKAN DENGAN BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia) TERHADAP KETEBALAN ARTERI KORONARIA TIKUS WISTAR
JANTAN
Oleh
BILLY ADITYA PRATAMA
Penggunaan minyak goreng bekas akan menyebabkan deposisi sel lemak di berbagai organ tubuh salah satunya pada arteri koronaria. Proses ini dapat dihambat dengan penggunaan buah mengkudu untuk pemurniaan minyak goreng bekas. Buah mengkudu mengandung antioksidan yang dapat menahan proses oksidasi dan menetralisir radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya pengaruh pemberian minyak goreng bekas terhadap ketebalan arteri koronaria dan pengaruh pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu terhadap ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
akhir penelitian tikus dianastesi dan dilakukan dislokasi servikal. Kemudian diambil jantungnya untuk dilakukan pewarnaan hematoksilin eosin.
Hasil penelitian menunjukan perbedaan bermakna (p<0,05) pada KA–KB, KA– KC, KB–KC, KB–KD dan KC–KD. Namun, tidak terdapat perbedaan bermakna antara KD–KA. Rerata ketebalan KA: 32,26 ± 12,24 µm, KB: 46,50 ± 10,86 µm, KC: 60,55 ± 15,07 µm dan KD:33,20 ± 7,25 µm. Kesimpulan dalam penelitian ini adalah pemberian minyak goreng bekas dapat menyebabkan peningkatan ketebalan arteri koronaria dan pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu buah mengkudu dapat menurunkan ketebalan arteri koronaria tikus wistar jantan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ... i
DAFTAR TABEL ... iv
DAFTAR GAMBAR ... v
DAFTAR LAMPIRAN ... vi
I. PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 5
C. Tujuan Penelitian ... 5
D. Manfaat Penelitian ... 6
1. Bagi Peneliti ... 6
2. Bagi Masyarakat/institusi ... 6
3. Bagi Ilmu Pengetahuan ... 6
E. Kerangka Penelitian ... 6
1. Kerangka Teori ... 6
2. Kerangka Konsep ... 10
F. Hipotesis ... 10
II. TINJAUAN PUSTAKA ... 11
A. Minyak Goreng ... 11
1. Klasifikasi Minyak Goreng ... 11
ii
B. Minyak Goreng Bekas ... 13
C. Metabolisme Lipid ... 16
D. Radikal Bebas ... 18
E. Antioksidan ... 20
F. Mengkudu ... 21
1. Taksonomi Mengkudu ... 22
2. Kandungan Mengkudu ... 22
G. Arteri Koronoria ... 25
1. Anatomi Arteri Koronaria ... 25
2. Fisiologi Aliran Darah Koroner ... 27
3. Histologi Arteri Koronaria ... 28
H. Pembentukan Aterosklerosis ... 30
1. Inisiasi Proses Aterosklerosis ... 30
2. Perkembangan Proses Aterosklerosis ... 32
3. Stabilitas Plak dan Kecenderungan Mengalami Ruptur ... 34
I. Tikus Putih (Rattus norvegicus) ... 35
III. METODE PENILITIAN ... 38
A. Desain Penelitian ... 38
B. Tempat dan Waktu... 38
C. Populasi dan Sampel ... 38
D. Bahan dan Alat Penelitian ... 40
1. Bahan Penelitian ... 40
2. Alat Penelitian ... 40
E. Prosedur Penelitian ... 41
1. Prosedur Pemanasan Minyak Goreng ... 41
2. Perhitungan Dosis Pemberian Minyak Goreng ... 42
3. Pemurnian Minyak Goreng Bekas dengan Buah Mengkudu ... 42
4. Prosedur Pemberian Intervensi ... 43
5. Prosedur Pengelolaan Hewan Coba Pasca Penelitian ... 44
6. Prosedur Pengambilan Bagian Arteri Koronaria ... 44
7. Prosedur Operasional Pembuatan Slide ... 45
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional ... 52
1. Identifikasi Variabel ... 52
2. Definisi Operasional Variabel ... 52
G. Analisa Data ... 52
H. Persetujuan Etik ... 53
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 55
A. Hasil Penelitian ... 55
1. Hasil Ketebalan Arteri Koronaria Tikus ... 55
2. Analisis Ketebalan Arteri Koronaria Tikus... 58
B. Pembahasan ... 60
IV. SIMPULAN DAN SARAN ... 69
A. Simpulan ... 69
B. Saran ... 69
DAFTAR PUSTAKA ... 71
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1 Jenis Perlakuan Penelitian dan Dosis Yang Diberikan
pada Setiap Perlakuan... ... 44 2 Definisi Operasional ... 52 1. Ketebalan Arteri Koronaria Tiap Kelompok ... 55 2. Hasil Uji Mann Whitney Ketebalan Arteri Koronaria
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Berat Badan tikus Percobaan ... 77
2. Ukuran Panjang dan Lebar Jantung Tikus Percobaan... 78
3. Data Hasil Pengamatan Ketebalan Arteri Koronaria... 79
4. Uji Normalitas Distribusi Data Shapiro–Wilk... 81
5. Uji Nonparametrik Kruskal Walis untuk Mengetahui Ada atau Tidak Pengaruh Pemberian Minyak Goreng Bekas yang Dimurnikan dengan Buah Mengkudu terhadap Ketebalan Arteri Koronaria Tikus... 82
6. Uji Post Hoc Mann Whitney untuk Mengetahui pengaruh pemberian Minyak Goreng Bekas yang Dimurnikan dengan Buah Mengkudu terhadap Ketebalan Arteri Koronaria Tikus per‒kelompok... 84
7. Hasil Foto Pengamatan Arteri Koronaria... 89
I. PENDAHULUAN
A.Latar Belakang
Minyak goreng merupakan salah satu bahan yang digunakan dalam proses menggoreng makanan. Dalam proses menggoreng makanan, minyak goreng berfungsi sebagai medium penghantar panas, menambah rasa gurih, menambah nilai gizi dan kalori dalam bahan pangan (Ketaren, 2008). Saat ini minyak goreng merupakan salah satu komoditas bahan pokok yang penting bagi penduduk Indonesia. Hal ini dapat dilihat dari hampir semua makanan dan jenis makanan di Indonesia membutuhkan minyak goreng untuk proses pembuatannnya (Noeltrg, 2012).
Berdasarkan data yang diperoleh oleh Direktorat Jendral Perdagangan dalam Negeri (DJPDN) disebutkan bahwa kebutuhan minyak goreng dalam negeri meningkat setiap tahunnya. Pada tahun 2010 konsumsi minyak goreng di Indonesia berada diangka 3,4 juta ton dan pada tahun 2013 kebutuhan minyak goreng mencapai 4,2 ton. Minyak Goreng juga menyumbang 1,3% dari angka inflasi nasional (Kementrian Perindustrian, 2013).
minyak goreng dalam negerinya diperoleh dengan impor. Peningkatan kebutuhan dan posisi penting minyak goreng menyebabkan terjadi peningkatan harga minyak goreng sebesar 5% setiap tahun sepanjang tahun 2002-2007 (Kementrian Perindustrian, 2009).
Peningkatan kebutuhan dan peningkatan harga minyak goreng menyebabkan banyak rumah tangga, pedagang makanan gorengan hingga industri menggunakan minyak goreng bekas dalam kurun waktu yang lama (Rukmini, 2007; Winarni dkk., 2010). Penggunaan minyak goreng bekas dalam kurun waktu yang lama akan menyebabkan kerusakan pada minyak. Pemanasan yang berulang akan menyebabkan minyak mengalami reaksi autooksidasi, thermal polimerasi dan thermal oksidasi (Ketaren, 2008).
3
Penggunaan minyak goreng secara berulang akan menyebabkan deposisi sel lemak di berbagai organ tubuh. Hal ini akan menyebabkan kerusakan pada berbagai organ tubuh seperti hati, jantung, ginjal dan arteri (Rukmini, 2007). Proses deposisi sel lemak dalam pembuluh darah akan menyebabkan sumbatan dalam lumen pembuluh darah yang dikenal dengan aterosklerosis. Proses penyumbatan ini apabila terjadi di arteri koronaria akan menyebabkan penyakit jantung koroner (Char, 2005).
Proses aterosklerosis dapat disebabkan oleh konsumsi minyak goreng hasil penggunaan berulang. Hal ini disebabkan karena senyawa peroksida dan hidroperoksida yang diproduksi selama proses pemanasan berulang minyak goreng akan mengoksidasi LDL (Niki, 2011). Selain itu perubahan asam lemak tidak jenuh menjadi asam lemak trans– juga dapat meningkatkan LDL dan menurunkan HDL yang akan memicu terjadinya aterosklerosis (Tuminah, 2009).
Indonesia sebagai negara megabiodiversity memiliki keanekaragaman hayati yang melimpah yang salah satunya ialah buah mengkudu. Mengkudu merupakan buah yang banyak terdapat di Indonesia, namun belum banyak dimanfaatkan masyarakat. Berdasarkan data dari Kementrian Pertanian pada tahun 2012 menyebutkan bahwa secara nasional luas tanam tanaman mengkudu mencapai 354.774 m2 yang menghasilkan buah mengkudu sebanyak 8.967.750 Kg. Untuk Provinsi Lampung pada tahun 2012 disebutkan terdapat luas tanam tanaman mengkudu mencapai 38.188 m2 yang menghasilkan buah mengkudu 366.267 Kg (Kementrian Pertanian, 2013).
Buah mengkudu mengandung sumber antioksidan yang terdiri dari xeronin, proxeronin, asam askorbat, asam linoleat, flavonoid, β–karoten dan caprylit acid. Senyawa antioksidan dapat menahan proses oksidasi dan menetralisir radikal bebas hasil oksidasi (Mulyati dkk., 2006). Mengkudu juga mengandung asam linoleat yang dapat menekan pembentukan trans fatty acid pada pemanasan minyak goreng berulang sehingga dapat menurunkan kadar LDL dan meningkatkan HDL (Tuminah, 2009).
5
Berdasarkan uraian diatas penulis termotivasi untuk melakukan penelitian tentang pengaruh minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu terhadap ketebalan arteri koronaria. Hal ini disebabkan karena proses aterosklerosis di arteri koronaria dapat menimbulkan gangguan fungsi jantung yang dikenal dengan penyakit jantung koroner. Sehingga diharapkan penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai metode pemurnian minyak goreng bekas yang tidak hanya menguntungkan dari sisi ekonomis tetapi juga tidak mengabaikan aspek kesehatan.
B.Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang, rumusan masalah yang dapat diambil adalah: 1. Apakah terdapat pengaruh pemberian minyak goreng bekas terhadap
ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan ?
2. Apakah terdapat pengaruh pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia) terhadap ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan?
C.Tujuan
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah:
1. Untuk mengetahui pengaruh pemberian minyak goreng bekas terhadap ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
D.Manfaat
Adapun manfaat dari penelitian ini adalah: 1.Bagi peneliti
Mendapatkan pengalaman dan pengetahuan mengenai tata cara penulisan karya ilmiah yang baik serta mengetahui pengaruh pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia) terhadap ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
2.Bagi masyarakat/institusi
Memberikan informasi bahwa minyak goreng bekas dapat dimurnikan dengan penggunaan buah mengkudu sehingga dapat bermanfaat secara ekonomis dan aman bagi kesehatan.
3.Manfaat bagi ilmu pengetahuan
Membuka penelitian lanjutan untuk dapat mensejajarkan metode penjernihan minyak dengan menggunakan buah mengkudu yang aman untuk kesehatan dan dapat membuka penelitian lebih lanjut tentang metode– metode penjernihan minyak lainnya yang aman untuk kesehatan.
E.Kerangka Penelitian
1. Kerangka Teori
7
Senyawa radikal bebas akan menyebabkan disfungsi endotel. Disfungsi endotel akan menyebabkan LDL dapat masuk ke dalam pembuluh darah dan menyebabkan proses aterosklerosis (Rosen & Gelfand, 2009; Char, 2005). Selain itu radikal bebas akan mengoksidasi LDL yang akan berperan dalam pembentukan foam cell (Kumar & Cannon, 2009).
Selain terjadi proses autoksidasi, pada saat pemanasan minyak goreng akan menyebabkan proses thermal oksidasi. Thermal Oksidasi adalah proses oksidasi minyak goreng yang disebabkan oleh pemanasan pada suhu tinggi (Ketaren, 2008). Pada proses thermal oksidasi akan terjadi perubahan asam lemak dari komposisi cis– menjadi trans– (Sartika, 2009). Asam lemak dengan komposisi trans– berbahaya untuk tubuh karena dapat meningkatkan kadar LDL dan menurunkan kadar HDL (Tuminah, 2009). Proses ini akan menyebabkan disfungsi endotel dan dapat meningkatkan masukan lemak ke dalam pembuluh darah (Rosen & Gelfand, 2009; Char, 2005).
Disfungsi endotel, oksidasi LDL, peningkatan LDL dan penurunan HDL akan menyebabkan terjadi proses aterosklerosis. Proses ini akan menyebabkan penebalan pada pembuluh darah koroner dan dapat menyebabkan penyakit jantung koroner. Apabila keadaan ini terus berlanjut maka akan menyebabkan gangguan perfusi dan metabolisme pada otot jantung dan pada akhirnya akan menyebabkan infark miokard (Char, 2005).
pemurnian dengan menggunakan adsorben dan penambahan antioksidan (Widayat dkk., 2006). Antioksidan akan memperlambat proses oksidasi dan menghambat reaksi berantai pembentukan radikal bebas (Ketaren, 2008). Buah mengkudu mempunyai kandungan antioksidan seperti xeronin, proxeronin, asam askorbat, asam linoleat, flavonoid, β–karoten dan caprylit acid. Senyawa antioksidan ini dapat menahan proses oksidasi dan menetralisir senyawa–senyawa radikal bebas hasil oksidasi (Mulyati dkk., 2006).
Selain itu, mengkudu mempunyai kandungan scopoletin yang dapat meningkatkan aktivitas antioksidan endogen seperti superoxide dismutase dan catalase (Panda & Kar, 2006). Scopoletin juga dapat menurunkan tekanan darah dengan menghambat spasme pembuluh darah dan merelaksasikan dari otot polos pembuluh darah. Proses ini akan menurunkan terjadinya shear stress pada pembuluh darah sehingga bisa menghambat terjadinya disfungsi endotel(Kumar et al, 2010).
9
Keterangan: Infark Miokard
Minyak Goreng Bekas Yang Dimurnikan dengan
Buah mengkudu Antioksidan: xeronin proxeronin asam askorbat asam linoleat flavonoid β–karoten caprylit acid Scopoletin : Menghambat : Mengakibatkan : Meningkatkan
Gambar 1. Kerangka Teori
Minyak Goreng Bekas
Pembentukan Aterosklerosis di Arteri Koronaria
Penebalan dinding Arteri Koronaria
Gangguan Perfusi dan Metabolisme Jantung Asam Linoleat Thermal Polimerasi Asam lemak bebas Trans Fatty Acid
HDL LDL
2. Kerangka Konsep
Gambar 2. Kerangka Konsep
F. Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah yang telah dipaparkan sebelumnya, maka hipotesis dalam penelitian ini adalah :
1. Pemberian minyak goreng bekas menyebabkan peningkatan ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
2. Pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia) dapat menurunkan ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
Minyak Goreng Bekas
Pemanasan
Ketebalan Arteri Koronaria Tikus Wistar Jantan
3 Jam 6 Jam
6 Jam Tanpa Pemurnian
6 Jam Dengan Pemurnian
Buah Mengkudu 3 Jam
II. TINJAUAN PUSTAKA
A.Minyak Goreng
Minyak goreng merupakan salah satu bahan yang termasuk dalam lemak, baik yang berasal dari lemak tumbuhan maupun dari lemak hewan. Penggunaan minyak goreng berfungsi sebagai medium penghantar panas, menambah rasa gurih, menambah nilai gizi dan kalori dalam makanan. Minyak goreng tersusun dari beberapa senyawa seperti asam lemak dan trigliserida (Ketaren, 2008).
1. Klasifikasi Minyak Goreng
Berdasarkan ada atau tidak ikatan ganda dalam struktur molekulnya, minyak goreng terbagi menjadi minyak dengan asam lemak jenuh (saturated fatty acids) dan minyak dengan asam lemak tak jenuh tunggal (monounsaturated fatty acids/MUFA) maupun majemuk (polyunsaturated fatty acids/PUFA) (Ketaren, 2008).
Minyak dengan asam lemak tak jenuh tunggal (monounsaturated fatty acids/MUFA) maupun majemuk (polyunsaturated fatty acids/PUFA) merupakan asam lemak yang memiliki ikatan atom karbon rangkap pada rantai hidrokarbonnya. Semakin banyak jumlah ikatanrangkap (polyunsaturated), semakin mudah berubah menjadi asam lemak jenuh. Asam lemak tidak jenuh yang terkandung dalam minyak goreng adalah asam oleat dan asam linolenat (Ketaren, 2008).
2. Proses Menggoreng
Proses menggoreng bahan pangan terdiri dari dua macam yaitu sistem gangsa (pan frying) dan menggoreng biasa (deep frying). Proses menggoreng sistem gangsa (pan frying) menggunakan suhu pemanasan yang lebih rendah dari suhu pemanasan pada sistem deep frying. Proses menggoreng dengan sistem gangsa ialah bahan pangan yang digoreng tidak sampai terendam dalam minyak (Ketaren, 2008).
13
B.Minyak Goreng Bekas
Minyak goreng bekas merupakan minyak bekas yang sudah dipakai untuk menggoreng berbagai jenis makanan dan sudah mengalami perubahan pada komposisi kimianya (Rukmini, 2007). Kerusakan minyak atau lemak sering disebut dengan ketengikan (rancidity). Kerusakan minyak selama proses menggoreng akan mempengaruhi mutu dan nilai gizi bahan pangan yang digoreng (Thadeus, 2005).
Pada proses menggoreng terdapat beberapa reaksi yang terjadi. Reaksi yang terjadi selama proses menggoreng adalah reaksi autooksidasi, thermal oksidasi dan thermal polimerasi. Proses autooksidasi terjadi ketika minyak goreng bereaksi dengan oksigen selama proses penggorengan. Proses thermal oksidasi terjadi karena pemanasan pada suhu tinggi dan ada kontak langsung dengan oksigen. Proses thermal polimerasi merupakan proses penghasilan produk dengan berat molekul lebih tinggi daripada sebelumnya proses ini terjadi karena pemanasan pada suhu tinggi (Ketaren, 2008).
Proses kerusakan minyak dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yang meliputi lamanya minyak kontak dengan panas, banyak oksigen yang akan mempercepat oksidasi, banyaknya asam lemak tidak jenuh yang akan mempercepat oksidasi, adanya katalis oksidasi seperti cahaya serta ion tembaga dan besi serta antioksidan yang menahan oksidasi minyak (Ketaren, 2008).
Kerusakan minyak goreng dapat ditandai oleh terbentuknya akrolein pada minyak goreng. Akrolein menyebabkan rasa gatal pada tenggorokan ketika mengkonsumsi makanan yang digoreng menggunakan minyak goreng bekas penggorengan berulang kali. Akrolein terbentuk dari hidrasi gliserol yang membentuk aldehida tidak jenuh atau akrolein (Ketaren, 2008).
Akibat dari penggunaan minyak goreng yang berulang kali dapat dijelaskan melalui penelitian yang dilakukan oleh Rukmini (2007) yang melaporkan bahwa terjadi kerusakan pada sel hepar (liver), jantung, pembuluh darah maupun ginjal akibat konsumsi minyak goreng bekas penggorengan berulang kali. Hal tersebut dikarenakan pada saat pemanasan akan terjadi proses degradasi, oksidasi dan dehidrasi dari minyak goreng. Proses tersebut dapat membentuk radikal bebas dan senyawa toksik yang bersifat racun (Rukmini, 2007).
15
Proses pemanasan minyak juga akan menyebabkan terbentuknya asam lemak trans‒. Asam lemak trans‒ dapat meningkatkan LDL dan menurunkan HDL. Proses ini akan mengakibatkan terjadinya aterosklerosis yang ditandai dengan adanya timbunan atau endapan lemak pada pembuluh darah. Timbunan lemak akan menyumbat aliran darah pada beberapa bagian tubuh seperti jantung dan otak. Bila penyumbatan terjadi di jantung akan menyebabkan penyakit jantung koroner (Rosen & Gelfand, 2009).
Gambar 3. Perubahan Asam Lemak Cis‒ Menjadi Trans‒ pada Penggorengan Minyak Goreng Berulang (Sartika, 2009).
Keterangan : A. Asam lemak dengan komposisi cis; B. Asam lemak dengan komposisi trans.
C.Metabolisme Lipid
Lipid adalah molekul biologis yang tidak larut di dalam air tetapi larut di dalam pelarut organik. Lipid memiliki beberapa fungsi diantaranya untuk sumber energi, unsur pembangun membran sel, sebagai pelindung organ, penyekat jaringan tubuh, menjaga tubuh terhadap pengaruh luar, konduktor listrik (agar impuls syaraf merambat dengan cepat), membantu melarutkan dan mentransport senyawa tertentu (vitamin) dalam aliran darah untuk keperluan metabolisme (Sherwood, 2011).
Proses metabolisme lemak di dalam tubuh kita berasal dari tiga jalur yaitu jalur metabolisme eksogen, jalur metabolisme endogen dan jalur reverse cholesterol transport (Sebastian, 2012). Jalur Metabolisme Eksogen adalah jalur yang menjelaskan asupan lemak yang berasal dari makanan untuk masuk kedalam tubuh. Proses ini diawali oleh memakan makanan yang berlemak. Asupan lemak yang biasa dimakan melalui diet adalah trigliserida dan kolesterol. Selain kolesterol yang berasal dari makanan. Dalam usus juga terdapat kolesterol dari hati yang diekskresikan bersama empedu ke usus halus. Baik lemak di usus halus yang berasal dari makanan maupun yang berasal dari hati disebut lemak eksogen (Adam, 2007).
17
melalui pembuluh limfe dan bermuara pada vena kava sehingga bersatu dengan sirkulasi darah. Kilomikron kemudian ditransportasikan menuju hati dan jaringan adipose (Sebastian, 2012),
Gambar 4. Struktur kilomikron (Sebastian, 2012).
Lemak yang telah diangkut dalam kilomikron selanjutnya akan dibawa ke hati. Selanjutnya lemak ini melalui jalur metabolisme endogen. Trigliserida dan kolesterol yang disintesis di hati dan disekresi ke dalam sirkulasi sebagai VLDL. Dalam sirkulasi, trigliserida dalam VLDL akan mengalami hidrolisis oleh enzim lipoprotein lipase (LPL) sehingga VLDL berubah menjadi IDL yang juga akan mengalami hidrolisis dan berubah menjadi LDL (Adam, 2007).
LDL adalah lipoprotein yang paling banyak mengandung kolesterol. Sebagian dari kolesterol dalam LDL akan dibawa ke hati dan jaringan. Sebagian lagi dari kolesterol–LDL akan mengalami oksidasi dan ditangkap oleh reseptor scavenger–A (SRA) di makrofag dan akan menjadi sel busa (foam cell). Makin banyak kadar kolesterol LDL dalam plasma makin banyak yang akan mengalami oksidasi dan ditangkap oleh sel makrofag (Adam, 2007).
cholesterol transport. HDL merupakan lipoprotein yang berperan pada jalur ini dimana HDL akan membawa kembali kolesterol dari sel ke hati. (Hilbert, 2007). Untuk lebih jelasnya proses metabolisme lipid dapat dilihat dalam gambar berikut.
Gambar 5. Metabolisme Lipoprotein (Sebastian, 2012).
D.Radikal Bebas
19
yang terdapat didalam sel seperti lipid, protein dan DNA (Rohmatussolihat, 2009).
Hal ini dapat menimbulkan berbagai penyakit dan menjadi dasar kelainan patologis pada penyakit degeneratif. Secara alamiah radikal bebas terbentuk dalam tubuh makhluk hidup sebagai hasil dari proses metabolisme alami tubuh. Dalam kondisi normal jumlah radikal bebas berada dalam keseimbangan dengan jumlah antioksidan. Secara endogen, radikal bebas terbentuk dari proses autooksidasi, oksidasi enzimatik, respiratory burst dan ischemia reperfusion injury (Ramatina, 2011).
Radikal bebas terpenting yang terdapat dalam tubuh merupakan derivat oksigen atau oksi–radikal yang sering disebut reactive oxygen species (ROS). Radikal tersebut terdapat dalam bentuk oksigen singlet (O2●), anion superoksida (O2–), radikal hidroksil (OH●), nitrogen oksida (NO●), peroksinitrit (ONOO–), asam hipoklorit (HOCL), hidrogen peroksida (H2O2), radikal alkoksil (LO●) dan radikal peroksil (LO2●) (Shah & Channon, 2004).
2011). Radikal bebas ini juga akan menyebabkan oksidasi LDL yang akan mempercepat degeradasi NO dari endotel (Jannah dkk., 2013).
E.Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menunda atau menghambat proses oksidasi lipid atau molekul lain melalui inhibisi proses inisiasi atau propagasi reaksi rantai oksidatif. Antioksidan bersifat menangkal radikal bebas dan bisa menterminasi rantai reaksi yang membahayakan tersebut dengan cara mengeliminasi intermediet radikal serta bisa menghambat reaksi oksidasi lain dengan membiarkan dirinya sendiri teroksidasi (Noviani, 2010).
Antioksidan cenderung bereaksi dengan radikal bebas terlebih dahulu dibandingkan dengan molekul yang lain karena antioksidan bersifat sangat mudah teroksidasi atau bersifat reduktor kuat dibanding dengan molekul yang lain. Sehingga keefektifan antioksidan bergantung dari seberapa kuat daya oksidasinya dibanding dengan molekul yang lain. Semakin mudah teroksidasi maka semakin efektif antioksidan tersebut (Noviani, 2010).
21
bebas. Yang termasuk antioksidan primer adalah Super Oxide Dismutase (SOD), Gluthation Peroxidase (GPx), Katalase (Cat) (Noviani, 2010).
Antioksidan yang lain ialah antioksidan eksternal. Antioksidan ini disebut juga antioksidan sekunder. Antioksidan ini berasal dari makanan atau didapat dari luar tubuh. Tidak dihasilkan oleh tubuh tetapi berasal dari makanan seperti Vitamin A, beta caroten, Vitamin C, Vitamin E, Selenium, Flavonoid, dan lain–lain. Antioksidan eksternal bekerja dengan cara meredam/menetralisir antioksidan yang sudah terbentuk (Noviani, 2010).
F. Mengkudu
[image:31.595.224.404.565.722.2]Mengkudu adalah tanaman perdu yang tumbuh membengkok pada ketinggian pohon mencapai 3–10 m bercabang banyak dengan bentuk ranting bersegi empat. Letak daun berhadap–hadapan secara bersilang, bertangkai dengan bentuk daun yang bulat telur melebar menyerupai bentuk elips atau oval dengan panjang daun 20–45 cm, lebar daun 7–25 cm, tebal dan terlihat mengkilap. Tepi daun rata, ujungnya meruncing, dengan pangkal daun yang menyempit, tulang daun menyirip, dengan warna daun hijau tua (Scot, 2003).
1. Taksonomi Mengkudu
Taksonomi buah mengkudu adalah sebagai berikut (Waha, 2002) : Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledone Anak kelas : Sympetalae Bangsa : Rubiales
Suku : Rubiaceae
Genus : Morinda Spesies : Citrifolia
Nama ilmiah : Morinda citrifolia
2. Kandungan Mengkudu
Buah mengkudu memiliki beberapa kanduangan kimia yang terdiri atas alkaloid triterpenoid, skopoletin, acubin, alizarin, antraquinon, asam benzoat, asam oleat, asam palmitat, glukosa, eugenol, hexanal, polisakarida, glikosida asam lemak, iridoid, kumarin, flavonoid, lignan, fitosterol, karotinoid, dan sejumlah konstituen volatil meliputi monoterpen dan asam lemak rantai pendek serta ester asam lemak (Rukmana, 2002).
23
yang sangat baik. Asam askorbat memiliki dapat berfungsi untuk menghambat proses ateroklerosis dengan cara meningkatkan integritas dinding arteri, menurunkan kolesterol dengan meningkatkan konversi kolesterol menjadi empedu dan menghambat kerja lipoprotein lipase. Asam askorbat juga berfungsi sebagai antioksidan untuk menghambat pembentukan radikal bebas dan menghambat oksidasi LDL (Herlambang, 2006).
Selain asam askrobat juga terdapat kandungan asam yang lain seperti asam kaproat, asam kaprilat, dan asam kaprik. Asam ini termasuk dalam golongan asam lemak. Asam kaproat dan asam kaprik inilah yang menyebabkan bau busuk yang tajam pada buah mengkudu (Salviana, 2012). Selain asam juga terdapat selenium yang merupakan kofaktor dari enzim glutathione peroksidase selain membantu mencegah kerusakan sel yang disebabkan oleh radikal bebas, juga dapat menurunkan sintesis dan pelepasan dari leukotrine B4 yang merupakan mediator proses peradangan (Surya, 2009).
Selain beta karoten juga terdapat scopoletin. Scopoletinadalah salah satu di antara zat yang terdapat dalam buah mengkudu yang dapat mengikat serotonin, salah satu zat kimiawi penting di dalam tubuh manusia. Scopoletin dapat berfungsi untuk menghambat peroksidasi lipid dan meningkatkan aktivitas antioksidan superoxide dismutase dan catalase (Panda & Kar, 2006). Scopoletin juga memiliki fungsi dalm pengaturan tekanan darah dimana scopoletin dapat menurunkan tekanan darah dengan menghambat spasme pembuluh darah dan merelaksasikan dari otot polos pembuluh darah (Kumar et al., 2010).
Selain itu dalam buah mengkudu terdapat kandungan xeronin. Xeronin adalah salah satu alkaloid penting yang terdapat dalam buah Mengkudu. Xeronin dihasilkan juga oleh tubuh manusia dalam jumlah terbatas yang berfungsi untuk mengaktifkan enzim–enzim dan mengatur fungsi protein di dalam sel. Walaupun buah mengkudu hanya mengandung sedikit xeronin, tetapi mengandung bahan–bahan pembentuk (prekursor) xeronin, yaitu proxeronin dalam jumlah besar. Proxeronin adalah sejenis asam koloid yang tidak mengandung gula, asam amino atau asam nukleat seperti koloid– koloid lainnya dengan bobot molekul relatif besar lebih dari 16.000. Apabila kita mengonsumsi proxeronin maka kadar xeronin di dalam tubuh akan meningkat (Palu et al, 2008)
25
yang terdapat di dalam sel. Hal ini penting mengingat bila protein–protein tersebut berfungsi abnormal maka tubuh kita akan mengalami gangguan kesehatan. Xeronin ini akan berfungsi sebagai antioksidan. (Palu et al, 2008)
G.Arteri Koronaria
Arteri koronaria adalah arteri yang memberikan vaskularisasi kepada sel jantung (Myocardium). Arteri ini berasal dari aorta ascendens. Arteri koronaria merupakan salah satu dari arteri ujung (end artery) sehingga bila terjadi sumbatan total, miokardium yang mendapatkan darah dari arteri yang tersumbat mengalami kekurangan darah dan kondisi ini dapat menyebabkan infrak miokard (Moore, 2010).
1. Anatomi Arteri Koronaria
Gambar 7: Arteri Koronaria dari Arah Anterior (Moore, 2010).
27
Gambar 8: Arteri Koronaria dari Arah Posterior (Moore, 2010).
2. Fisiologi Aliran Darah Koroner
Mekanisme pengaturan aliran koroner mengusahakan agar pasokan (supply) maupun kebutuhan (demand) jaringan tetap seimbang agar oksigenisasi jaringan terpenuhi sehingga setiap jaringan mampu melakukan fungsi secara optimal. Metabolisme miokard hampir 100% memerlukan oksigen, dan hal tersebut telah berlangsung dalam keadaan istirahat sehingga ekstraksi oksigen dari aliran darah koroner akan habis dalam keadaan tersebut Dalam sirkulasi aliran koroner dipengaruhi oleh faktor mekanis, sistem otoregulasi dan tahanan perifer (Sherwood, 2011).
bersifat tekanan. Tekanan perfusi berkaitan dengan tekanan tertentu yang dibutuhkan untuk perfusi ke jaringan. Tekanan perfusi dipengaruhi oleh tekanan cairan dalam rongga jantung khususnya tekanan ventrikel kiri, yang secara umum diketahui melalui pengukuran tekanan darah (Sherwood, 2011).
3. Histologi Arteri Koronaria
[image:38.595.138.478.461.683.2]Pembuluh darah koronaria terdiri dari 3 jenis komponen struktural yaitu tunika intima, tunika media dan tunika adventitia. Tunika intima terdiri dari satu lapis sel endotel yang dibawahnya terdapat jaringan subendotel. Pada arteri, tunika intima dipisahkan dengan tunika media dengan lamina elastika internal. Lamina ini terdiri dari elastin dan terdapat fenestra yang memperbolehkan diffusi dari nutrien dari pembuluh darah ke sel (Mescher, 2010).
29
Endotelium adalah sel epitel yang terspesialisasi. Endotel ini bersifat semipermeabel yang menjadi barier dari arteri dengan darah dan cairan intestinal. Endotel ini mempunyai beberapa fungsi diantaranya adalah konversi angiotensin I menjadi angiotensin II, konversi bradikinin, serotonin, prostaglandin, norepinefrin, trombin menjadi bentuk yang inaktif, lipolisis dari lipoprotein sehingga memungkinkan trigliserida dan kolesterol masuk kedalam sel serta produksi dari faktor vasoaktif yang mempengaruhi dari tonus vaskular seperti endotelin dan agen vasokonstriksi serta nitrit oxida (Mescher, 2010).
[image:39.595.133.516.540.696.2]Tunika Media merupakan lapisan kedua dari pembuluh darah. Tunika media tersusun atas otot polos. Diantara sel otot terdapat serat elastik, lamella, serat retikular (Kolagen tipe III), proteoglikan dan glikoprotein. Tunika media dibatasi dengan tunika adventitia oleh lamina elastika eksterna. Tunika adventitia terdiri atas kolagen dan serat elastin. Selain itu di tunika adventitia terdapat kolagen tipe I. Lapisan tunika adventitia bersambung dengan jaringan ikat dari organ disekitar arteri (Mescher, 2010).
H.Pembentukan Aterosklerosis
Proses pembentukan aterosklerosis dimulai dengan adanya disfungsi endotel yang disebabkan karena faktor tertentu. Pada tingkat seluler, plak aterosklerosis terbentuk karena adanya sinyal–sinyal yang menyebabkan sel darah seperti monosit yang melekat ke lumen pembuluh darah (Kleinschmidt, 2006).
1. Inisiasi proses aterosklerosis
Aterosklerosis merupakan proses pembentukan plak di tunika intima arteri besar dan arteri sedang. Proses ini berlangsung terus selama hidup sampai akhirnya bermanifestasi sebagai sindrome koroner akut. Proses aterosklerosis ini terjadi melalui 4 tahap yaitu kerusakan endotel, migrasi kolesterol LDL (low–density lipoprotein) ke dalam tunika intima, respons inflamatorik dan pembentukan kapsul fibrosis (Kumar & Cannon, 2009; Rosen & Gelfand, 2009; Char, 2005).
31
Endotel yang mengalami disfungsi ditandai sebagai berikut (Kumar & Cannon, 2009;Rosen & Gelfand, 2009):
a. Berkurangnya bioavailabilitas nitrit oksida dan produksi endotelin–1 yang berlebihan sehingga mengganggu fungsi hemostasis vaskuler, b. Peningkatan ekspresi molekul adhesif (misalnya P–selektin, molekul
adhesif antarsel dan molekul adhesif sel pembuluh darah seperti Vascular Cell Adhesion Molecules–1 [VCAM–1]),
c. Peningkatan trombogenisitas darah melalui sekresi beberapa substansi aktif local.
Proses disfungsi endotel berkaitan dengan nitric oxide (NO). NO tidak hanya berperan pada relaksasi sel otot polos tetapi juga menghambat
aktifasi, adhesi, agregasi platelet serta pencegahan proliferasi sel otot polos
vaskuler dan adhesi leukosit pada lapisan endotelium. Pada disfungsi
endotel, jejas vaskuler mengakibatkan serangkaian fenomena maladaptif
yang mengakibatkan terjadinya respons vaskuler yang tidak menguntungkan
(Amelia dkk., 2011).
Radikal bebas, LDL yang teroksidasi dan penurunan antioksidan
bertanggung jawab terhadap peningkatan degradasi NO. Selain itu
peningkatan LDL dan LDL yang teroksidasi akan menghambat jalur
signaling biosintesis dari NO melalui penghambatan protein kinase C dan
2. Perkembangan proses aterosklerosis
Adanya LDL yang teroksidasi merupakan molekul yang sangat aterogenik. LDL akan menyebabkan beberapa hal seperti (Lusis, 2000):
a. LDL akan memicu uptake makrofag kedalam endotel,
b. Memberikan sinyal kemotaktik untuk menarik makrofag dan limfosit T, c. Menghambat motilitas makrofag jaringan,
d. Merupakan sinyal untuk aggregasi LDL yang lain
[image:42.595.156.495.322.542.2]e. Mengubah ekspresi gen sel disekitar endotel seperti induksi MCP–1, colony stimulating factor, IL 1 dan reseptor adhesi lainnya.
Gambar 11. Oksidasi LDL dan Proses Aterosklerosis (Awal & Udadhi, 2006).
33
Makrofag yang teraktivasi akan melepaskan zat kemoatraktan dan sitokin (misalnya monocyte chemoattractant protein–1, tumor necrosis factor α, IL–1, IL–6, CD40 dan C–reactive protein) yang makin mengaktifkan proses ini dengan merekrut lebih banyak makrofag, sel T dan sel otot polos pembuluh darah (yang mensintesis komponen matriks ekstraseluler) pada tempat terjadinya plak (Char, 2005).
[image:43.595.120.516.440.653.2]Sel otot polos pembuluh darah bermigrasi dari tunika media menuju tunika intima lalu mensintesis kolagen dan membentuk kapsul fibrosis yang menstabilisasi plak dengan cara membungkus inti lipid dari aliran pembuluh darah. Makrofag juga menghasilkan matriks metaloproteinase (MMPs), enzim yang mencerna matriks ekstraseluler dan menyebabkan terjadinya disrupsi plak (Char, 2005).
3. Stabilitas plak dan kecenderungan mengalami ruptur
Stabilitas plak aterosklerosis bervariasi. Perbandingan antara sel otot polos dan makrofag memegang peranan penting dalam stabilitas plak dan kecenderungan untuk mengalami ruptur. LDL yang termodifikasi meningkatkan respons inflamasi oleh makrofag. Respons inflamasi ini memberikan umpan balik menyebabkan lebih banyak migrasi LDL menuju tunika intima yang selanjutnya mengalami modifikasi lagi dan seterusnya (Kumar & Cannon, 2009).
Makrofag yang terstimulasi akan memproduksi matriks metaloproteinase yang mendegradasi kolagen. Di sisi lain, sel otot pembuluh darah pada tunika intima, yang membentuk kapsul fibrosis, merupakan subjek apoptosis. Jika kapsul fibrosis menipis, ruptur plak mudah terjadi dan menyebabkan paparan aliran darah terhadap zat trombogenik pada plak. Hal ini menyebabkan terbentuknya bekuan. Proses proinflamatorik ini menyebabkan pembentukan plak dan instabilitas. Sebaliknya ada proses antiinflamatorik yang membatasi pertumbuhan plak dan mendukung stabilitas plak. Sitokin seperti IL–4 dan TGF–β bekerja mengurangi proses inflamasi yang terjadi pada plak (Char, 2005).
35
Gambar 13. Pembentukan lanjut lesi aterosklerosis (Rosen & Gelfand, 2009).
I. Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Hewan percobaan adalah hewan yang sengaja dipelihara dan diternakan untuk dipakai sebagai hewan model guna mempelajari dan mengembangkan berbagai macam bidang ilmu dalam skala penelitian atau pengamatan laboratorik. Penggunaan hewan percobaan untuk penelitian banyak dilakukan di bidang fisiologi, farmakologi, biokimia, patologi dan komparatif zoologi. Di bidang ilmu kedokteran selain untuk penelitian, hewan percobaan juga sering digunakan sebagai keperluan diagnostik. Berbagai jenis hewan yang umum digunakan sebagai hewan percobaan yaitu mencit, tikus, marmut, kelinci, hamster, unggas, kambing, domba, sapi, kerbau, kuda dan simpanse (Sirois, 2005).
mempunyai spesies yang sama atau strain yang sama, usia yang sama dan jenis kelamin yang sama dipelihara pada kondisi yang sama pula (Ridwan, 2013).
Hewan percobaan yang umum digunakan dalam penelitian ilmiah adalah tikus (Ridwan, 2013). Tikus (Rattus norvegicus) telah diketahui sifat–sifatnya secara sempurna, mudah dipelihara dan merupakan hewan yang relatif sehat dan cocok untuk berbagai penelitian. Ciri–ciri morfologi Rattus norvegicus antara lain memiliki berat 150–600 gram, hidung tumpul dan badan besar dengan panjang 18–25 cm, kepala dan badan lebih pendek dari ekornya serta telinga relatif kecil dan tidak lebih dari 20–23 mm (Sirois, 2005).
Tikus yang digunakan dalam penelitian adalah galur Wistar berjenis kelamin jantan berumur antara 2–3 bulan. Tikus Wistar dengan jenis kelamin betina tidak digunakan karena kondisi hormonal yang sangat berfluktuasi pada saat mulai beranjak dewasa sehingga dikhawatirkan akan memberikan respon yang berbeda dan dapat mempengaruhi hasil penelitian (Kusumawati, 2004).
Menurut Kusumawati (2004) taksonomi tikus Wistar adalah: Kingdom : Animalia
37
Subfamili : Murinae Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus Galur : Wistar
III. METODE PENELITIAN
A.Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik yang akan menggunakan metode rancangan acak terkontrol dengan pola post test only controlled group design (Notoatmodjo, 2010). Sebanyak 20 ekor tikus Wistar jantan berumur 10–16 minggu yang dipilih secara random dan dibagi menjadi 4 kelompok akan digunakan sebagai subjek penelitian.
B.Tempat dan Waktu
Penelitian ini akan dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Pemeliharaan tikus dan pemberian intervensi akan dilakukan di Pet House Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Pembuatan preparat dan pengamatannya akan dilakukan di Laboratorium Histologi dan Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Waktu penelitian dilakukan selama 4 minggu.
C.Populasi dan Sampel
39
Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Sampel penelitian sebanyak 20 ekor yang dipilih secara acak yang dibagi dalam 4 kelompok, sesuai dengan rumus Frederer.
Rumus penentuan sampel untuk uji eksperimental adalah :
t(n –1) ≥ 15
Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n merupakan jumlah pengulangan atau jumlah sampel tiap kelompok (Aprilia, 2010). Penelitian ini akan menggunakan 4 kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel menjadi :
(4)(n –1) ≥ 15 (4n –4) ≥ 15
4n ≥ 19
n ≥ 19/4
n ≥ 4,75
n ≥ 5 (Pembulatan)
Kriteria Inklusi :
a. Sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, botak dan aktif), b. Memiliki berat bedan antara 100–150 gram,
c. Jenis kelamin jantan,
d. Berusia sekitar 10–16 minggu (dewasa).
Kriteria Ekslusi :
a. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa adaptasi di laboratorium,
b. Sakit (Penampakan rambut kusam, rontok, botak dan aktivitas kurang/tidak aktif, keluarnya eksudat yang tidak normal dari mata, mulut, anus, genital setelah masa adaptasi),
c. Mati selama masa pemberian perlakuan.
D.Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ada tiga yaitu minyak goreng, minyak goreng bekas penggorengan lele selama penggorengan 3 jam dan 6 jam serta buah mengkudu untuk pemurnian minyak goreng. 2. Alat Penelitian
Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a. Neraca analitik Metler Toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 g untuk menimbang berat tikus,
41
c. Gunting minor set untuk membedah perut tikus (laparotomy), d. Kapas alkohol,
e. Kompor, f. Penggorengan, g. Tabung erlemeyer, h. Saringan,
i. Lumpang dan alu, j. Mikroskop.
E.Prosedur Penelitian
1. Prosedur Pemanasan Minyak Goreng
Pemanasan minyak goreng diperlukan supaya untuk merusak minyak dan melihat efeknya terhadap tikus yang nantinya dibandingkan dengan tikus yang diberi regenerasi minyak goreng bekas. Minyak goreng yang digunakan dalam penelitian ini adalah minyak goreng bekas penggorengan lele. Hal ini didasarkan pada hasil penelitian yang menunjukkan bahwa penurunan kualitas minyak goreng terburuk terjadi pada minyak goreng bekas penggorengan lele (Rukmini dkk., 2003).
goreng mulai terjadi pada pemasan 5 jam untuk menggoreng bahan makanan sumber protein baik nabati maupun hewani (Rukmini dkk., 2003).
2. Perhitungan Dosis Pemberian Minyak Goreng
Pemberian minyak goreng bekas kepada hewan percobaan dilakukan berdasarkan penelitian sebelumnya. Dosis yang dipakai untuk menginduksi tikus dengan minyak goreng ialah 10µl/gram berat badan (Thadeus, 2005). Dimana pada dosis tersebut telah terbukti bahwa dosis ini tepat untuk menginduksi tikus dengan minyak goreng.
3. Pemurnian Minyak Goreng Bekas dengan Buah Mengkudu
Proses pemurnian minyak goreng bekas dengan buah mengkudu didasarkan pada prosedur pemurnian minyak goreng bekas yang diteliti oleh Mahmudatussa (2013). Pada proses pemurnian dibutuhkan minyak goreng bekas penggorengan lele yang telah digunakan untuk menggoreng lele selama 6 jam. Selain minyak goreng bekas dibutuhkan juga buah mengkudu.
Proses pemurnian minyak goreng dimulai dengan mencacah buah mengkudu setelah dicacah kemudian dilumatkan dengan menggunakan blender. Setelah semua mengkudu menjadi lumat maka masukkan 4 sendok makan sari mengkudu ke dalam gelas kaca yang sudah diisi 100 ml minyak
goreng bekas aduk dengan menggunakan sendok atau batang pengaduk.
Diamkan selama 10–15 menit. Setelah itu minyak goreng yang telah tercampur
43
bunyi gemericik sambil terus diaduk. Kemudian matikan kompor lalu diamkan 10–15 menit. Saring minyak goreng bagian atas dengan menggunakan
penyaring dan endapannya dibuang (Mahmudatussa, 2013).
4. Prosedur Pemberian Intervensi
Untuk pemberian intervensi dilakukan berdasarkan kelompok perlakuan. Untuk kelompok 1 (kontrol) diberikan pakan standar dan aquadest sebanyak 10µl/gram berat badan yang diberikan melalui sonde oral. Pemberian aquasest secara sonde oral ini dilakukan agar setiap tikus percobaan mendapatkan stress yang sama pada waktu proses penyondean oral. Untuk kelompok 2 diberikan pakan standar dan diberikan intervensi berupa pemberian 10µl/gram berat badan minyak goreng bekas penggorengan lele selama 3 jam yang diberikan selama 1 bulan dengan menggunakan sonde oral.
Tabel 1. Jenis Perlakuan Penelitian dan Dosis yang Diberikan pada Setiap Perlakuan. Kelompok Hewan Percobaan Jenis Perlakuan Dosis
1 Tikus Wistar Jantan Pakan standar (Kontrol) dan aquadest
10µl/gram berat badan
2 Tikus Wistar Jantan Minyak goreng bekas
penggorengan lele selama 3 jam
10µl/gram
berat badan
3 Tikus Wistar Jantan Minyak goreng bekas
penggorengan lele selama 6 jam
10µl/gram
berat badan
4 Tikus Wistar Jantan Minyak goreng bekas
penggorengan lele selama 6 jam
yang dimurnikan dengan
mengkudu
10µl/gram berat badan
Apabila berat badan tikus sudah sangat besar dan pemberian dosis minyak goreng telah melebihi 5 cc minyak goreng maka dosis ini akan diberikan sebanyak 2 kali untuk mencegah penuhnya lambung tikus dan mencegah aspirasi (Rosalind Franklin University, 2012).
5. Prosedur Pengelolaan Hewan Coba Pasca Penelitian
Pada akhir penelitian tikus akan dianastesi dengan menggunakan ketamine– xylazine dengan dosis 75–100 mg/kg + 5–10 mg/kg secara intraperitoneal dengan durasi selama 10–30 menit. Kemudian setelah tikus dianastesi kemudian akan dilakukan dislokasi servikal untuk menterminasikan tikus (American Veterinary Medical Association, 2013).
6. Prosedur Pengambilan Bagian Arteri Koronaria
45
[image:55.595.229.423.86.281.2]Keterangan:
Gambar 14. Prosedur Pengambilan Bagian Arteri Koronaria (Eckman et al., 2013)
7. Prosedur operasional pembuatan slide
Metode pembuatan preparat histopatologi Bagian Patologi Anatomi Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung (Prabowo, 2013) :
a. Fixation
1. Spesimen berupa potongan organ telah dipotong secara representatif kemudian segera difiksasi dengan formalin 10% selama 3 jam.
2. Dicuci dengan air mengalir sebanyak 3–5 kali. b. Trimming
1. Organ dikecilkan hingga ukuran ± 3 mm.
2. Potongan organ tersebut dimasukkan kedalam tissue casette. 3 mm
: Perbatasan Atrium dan ventrikel
c. Dehidrasi
1. Mengeringkan air dengan meletakkan tissue casette pada kertas tisu.
2. Dehidrasi dengan :
a) Alkohol 70% selama 0,5 jam, b) Alkohol 96% selama 0,5 jam, c) Alkohol 96% selama 0,5 jam, d) Alkohol 96% selama 0,5 jam, e) Alkohol absolut selama 1 jam, f) Alkohol absolut selama 1 jam, g) Alkohol absolut selama 1 jam, h) Alkohol xylol 1:1 selama 0,5 jam. d. Clearing
Untuk membersihkan sisa alkohol dilakukan clearing dengan xilol I dan II masing–masing selama 1 jam.
e. Impregnansi
Impregnansi dilakukan dengan menggunakan parafin selama 1 jam dalam oven suhu 65oC.
f. Embedding
1. Sisa parafin yang ada pada pan dibersihkan dengan memanaskan beberapa saat di atas api dan diusap dengan kapas.
2. Parafin cair disiapkan dengan memasukkan parafin ke dalam cangkir logam dan dimasukkan dalam oven dengan suhu di atas 580C.
47
4. Dipindahkan satu per satu dari tissue casette ke dasar pan dengan mengatur jarak yang satu dengan yang lainnya.
5. Pan dimasukkan ke dalam air.
6. Parafin yang berisi potongan jantung dilepaskan dari pan dengan dimasukkan ke dalam suhu 4–60C beberapa saat.
7. Parafin dipoton sesuai dengan letak jaringan yang ada dengan menggunakan skalpel/pisau hangat.
8. Lalu diletakkan pada balok kayu, diratakan pinggirnya dan dibuat ujungnya sedikit meruncing.
g. Cutting
1. Pemotongan dilakukan pada ruangan dingin.
2. Sebelum memotong, blok didinginkan terlebih dahulu di lemari es. 3. Dilakukan pemotongan kasar, lalu dilanjutkan dengan pemotongan
halus dengan ketebalan 4–5 mikron. Pemotongan dilakukan menggunakan rotary microtome dengan disposable knife.
4. Dipilih lembaran potongan yang paling baik, diapungkan pada air dan dihilangkan kerutannya dengan cara menekan salah satu sisi lembaran jaringan tersebut dengan ujung jarum dan sisi yang lain ditarik menggunakan kuas runcing.
5. Lembaran jaringan dipindahkan ke dalam water bath pada suhu 600C selama beberapa detik sampai mengembang sempurna.
7. Slide yang berisi jaringan ditempatkan pada inkubator (Suhu 370C) selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna.
h. Straining (Pewarnaan) dengan Prosedur Pulasan Hematoksilin–Eosin : Setelah jaringan melekat sempurna pada slide, dipilih slide yang terbaik selanjutnya secara berurutan memasukkan ke dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut.
1. Dilakukan deparafinisasi dalam : 1. Larutan xylol I selama 5 menit, 2. Larutan xylol II selama 5 menit, 3. Ethanol absolut selama 1 jam. 2. Hydrasi dalam:
a) Alkohol 96% selama 2 menit, b) Alkohol 70% selama 2 menit, c) Air selama 10 menit.
3. Pulasan inti dibuat dengan menggunakan : a) Haris hematoksilin selama 15 menit, b) Air mengalir,
c) Eosin selama maksimal 1 menit,
4. Lanjutkan dehidrasi dengan menggunakan a) Alkohol 70% selama 2 menit,
b)Alkohol 96% selama 2 menit, c) Alkohol absolut 2 menit. 5. Penjernihan:
49
b)Xylol II selama 2 menit.
i. Mounting dengan entelan lalu tutup dengan deck glass
Setelah pewarnaan selesai, slide ditempatkan di atas kertas tisu pada tempat datar, ditetesi dengan bahan mounting yaitu entelan dan ditutup dengan deck glass, cegah janan sampai terbentuk gelembung udara. j. Slide dibaca dengan mikroskop
Slide diperiksa dibawah mikroskop cahaya. Preparat histopatologi dikirim ke laboratorium Patologi Anatomi untuk dikonsultasikan dengan ahli patologi anatomi.
7.SSSProsedur Pengamatan Ketebalan Arteri Koronaria
Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap ketebalan dari arteri koronaria. Pengkuran ketebalan arteri koronaria dilakukan dengan menggunakan software Olympus Stream Start. Pada penelitian ini akan diukur ketebalan arteri koronaria pada 4 posisi (vertikal atas, vertikal bawah, horizontal kanan dan horizontal kiri) kemudian hasil dari keempat posisi ini akan direratakan dan didapatkan rerata ketebalan dari arteri koronaria. Setelah didapatkan data dari masing–masing kelompok maka akan dilakukan analisis data untuk melihat pengaruhnya (Ratnawati, 2013; Eickman et al., 2013). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat gambar berikut.
[image:59.595.236.400.619.739.2]Cara pengolahan buah mengkudu adalah sebagai berikut :
Gambar 16. Diagram Alur Pengolahan Buah Mengkudu (Mahmudatussa, 2013). Diamkan selama 10-15 menit
Masukkan ke dalam wajan. Panaskan hingga suhu 50-60 0C (diraba dengan tangan terasa hangat) atau biarkan 5 menit
setelah terdengar bunyi gemericik, sambil terus diaduk.
Matikan kompor, diamkan 10-15 menit
Saring minyak goreng bagian atas dengan menggunakan penyaring, endapannya dibuang.
Cacah buah mengkudu, untuk mempermudah melumatkan Mengkudu (Morinda citrifolia)
Lumatkan buah mengkudu dengan menggunakan blender
Masukkan 4 sendok makan sari mengkudu ke dalam gelas kaca yang sudah diisi 100 ml minyak goreng bekas aduk dengan
51
[image:61.595.111.545.90.744.2]
Gambar 17. Diagram Alur Penelitian.
K1 K2 K3 K4
Tikus diadaptasikan selama 7 hari
K2
Cekok 10µl/gram BB minyak goreng
bekas 3 jam penggorengan
K3
Cekok 10µl/gram BB minyak goreng
bekas 6 jam penggorengan
K4
Cekok 10µl/gram BB minyak goreng
bekas 6 jam penggorengan yang dimurnikan dengan Buah mengkudu K1 Pakan standar (Kontrol) dan aquadest
Tikus diberikan perlakuan selama 4 minggu
Tikus dianastesi dan dilakukan dislokasi servikal
Lakukan laparotomi lalu ambil jantung tikus
Fiksasi sampel dengan formalin 10%
Pembuatan sediaan histopatologi
Pengamatan
Interpretasi hasil pengamatan Timbang Berat Badan Tikus
Pemisahan Perpopulasi
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional
1. Identifikasi Variabel
a. Variabel Bebas adalah pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia).
b. Variabel Terikat adalah ketebalan arteri koronaria tikus Wistar jantan.
[image:62.595.138.513.323.566.2]2. Definisi Operasional Variabel
Tabel 2. Definisi Operasional
Variabel Definisi Skala
Minyak goreng bekas
yang dimurnikan
dengan buah
mengkudu (Morinda
citrifolia)
Merupakan proses pemurnian minyak goreng bekas dengan penggunaan mengkudu. Yang dalam penelitian ini diberikan kepada masing–masing kelompok.
Numerik
Ketebalan arteri koronaria
Merupakan gambaran yang didapatkan dari arteri koronaria yang dipotong 3 mm dibawah perbatasan atrium dan ventrikel. Pengukuran ketebalan arteri koronaria dengan cara mengukur dari 4 posisi yang kemudian dirata–ratakan.
Numerik
G.Analisis Data
Hasil penelitian lalu akan dianalisis apakah memiliki distribusi normal (p>0,05) atau tidak secara statistik dengan uji normalitas Shapiro–Wilk karena jumlah sampel ≤50. Kemudian dilakukan uji Levene untuk mengetahui apakah
53
uji parametrik One Way Anova. Apabila tidak memenuhi syarat uji parametrik maka akan dilakukan uji non parametrik Kruskal Wallis. Jika pada uji ANOVA menghasilkan nilai p<0,05 maka akan dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc LSD dan jika pada uji non parametrik Kruskal Wallis menghasilkan nilai p<0,05 maka akan dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc Mann Whitney (Dahlan, 2011).
H.Persetujuan Etik
Penelitian ini telah diajukan ke Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dengan menerapkan prinsip 3R dalam protokol penelitian, yaitu:
1. Replacement adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah diperhitungkan secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan oleh makhluk hidup lain seperti sel atau biakan jaringan.
3. Refinement, adalah memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi, dengan prinsip dasar membebaskan hewan coba dalam beberapa kondisi.
a. Bebas dari rasa lapar dan haus, pada penelitian ini hewan coba diberikan pakan standar dan minum secara ad libitum.
b. Bebas dari ketidaknyamanan, pada penelitian hewan coba ditempatkan di pet house dengan suhu terjaga 20–25°C, kemudian hewan coba terbagi menjadi 3–4 ekor tiap kandang. Pet house berada jauh dari gangguan bising dan aktivitas manusia serta kandang dijaga kebersihannya sehingga mengurangi stress pada hewan coba.
c. Bebas dari nyeri dan penyakit dengan menjalankan program kesehatan, pencegahan dan pemantauan, serta pengobatan terhadap hewan percobaan jika diperlukan, pada penelitian hewan coba diberikan perlakuan dengan menggunakan nasogastric tube dilakukan dengan mengurangi rasa nyeri sesedikit mungkin, dosis perlakuan diberikan berdasarkan pengalaman terdahulu maupun literatur yang telah ada.
69
V. SIMPULAN DAN SARAN
A.Simpulan
1. Pemberian minyak goreng bekas dengan dosis 10 µl/gram berat badan dapat meningkatkan ketebalan arteri koronaria tikus wistar jantan.
2. Pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia) dengan dosis 10 µl/gram berat badan dapat menurunkan ketebalan arteri koronaria tikus wistar jantan.
B.Saran
Bagi peneliti lain disarankan untuk:
1. Menguji lebih lanjut toksisitas dan efektivitas pada buah mengkudu.
2. Melakukan penelitian fitokimia pada tanaman mengkudu untuk mengetahui proporsi dari bahan aktif yang terkandung dalam buah mengkudu.
3. Meneliti lebih lanjut dengan jangka waktu yang lebih lama untuk melihat bagaimana hubungan durasi waktu pemberian minyak goreng bekas yang dimurnikan dengan buah mengkudu terhadap gambaran ketebalan arteri koronaria.
5. Meneliti lebih lanjut dengan melakukan pewarnaan Imunohistokimia atau pewarnaan lainnya sehingga dapat mengidentifikasi perubahan pada membrana elastika interna dan eksterna arteri koronaria.
71
DAFTAR PUSTAKA
Adam JMF. 2007. Dislipidemia. Dalam: Buku ajar ilmu penyakit dalam. Jakarta: Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam. Sudoyo AW. hlm. 1926–28.
Amelia R, Oenzil F, Nasrul E. 2011. Pengaruh diet tinggi asam lemak terhadap fungsi endotel pembuluh darah tikus jantan strain wistar. J. Universitas Andalas. 1(1):1–13.
American Veterinary Medical Association. 2013. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Schaumburg: American Veterinary Medical Association. pp. 30–48.
Amijaya APP, Murwani S, Wardhana AW. 2012. Efek ekstrak air daun kelor (Moringa oleifera) terhadap kadar tumor necrosis factor alpha (TNF–α) dan gambaran histopatologi sel endotel arteri coronaria pada tikus putih (Rattus norvegicus) yang diberi diet aterogenik. J. Kedokteran Hewan Brawijaya. 3(1): 1–12.
Aprilia L. 2010. Efek protektif ekstrak etanol buah mahkota dewa (Phaleria macrocaroa [scheff.] Boerl.) terhadap gambaran histopatologi hati mencit (Mus musculus l.) jantan galur balb/c yang diinduksi oleh etanol. Skripsi. Bandar Lampung: FK Unila.
Awal P, Udadhi S. 2006. Aspek seluler dan molekuler aterosklerosis. J. Media Medika Muda. 3(2): 1858–81.
Campbell KA, Lipinski MJ, Doran AC, Skaflen MD, Fuster V, McNamara CA. 2012. Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis. J. Circulation. 1(10): 889–900.
Char MD. 2005. The patophysiology of acute coronary syndromes. J. Emergency Medicine Cardiac Research. 1(1):1–6.
Csanyi G, Taylor WR, Pagano PJ. 2009. NOX and inflamation in the vascular adventitia. J. Free Radical Biology Medicine. 47(9): 1254–66.
Eckman DM, Stacey RB, Rowe R, Agostino RD, Kock ND. 2013. Weekly doxorubicin increases coronary arteriolar wall and adventitial thickness. J. Plos One. 8(2): 1–6.
Ekawati A, Andriyani D, Rukmini S, Indriani L. 2007. Pengaruh teh hitam (Camellia sinensis (l.)O.k.) terhadap ketebalan dinding arteri koronaria tikus putih (Rattus norvegicus) yang diberi diet tinggi lemak. Laporan Penelitian PKMI. Yogyakarta: FKUGM. hlm. 1–8.
Eroschenko VP. 2010. Atlas histologi difiore: dengan korelasi fungsional edisi 11. Jakarta: EGC. hlm. 88–105.
Fatmawati H, Satuman, Endang SW, Rudijanto A, Indra MR. 2010. Pengaruh likopen terhadap penurunan aktivitas nuclear factor kappa beta (NF–kB) dan ekspresi intraceluller cell adhesion molecule–1 (ICAM–1) pada kultur HUVECs yang dipapar leptin. J. ilmu dasar. 11(2): 143–50.
Febriansyah S. 2007. Mempelajari pengaruh penggunaan berulang dan aplikasi adsorben terhadap kualitas minyak dan tingkat penyerapan minyak pada kacang salut. Skripsi. Bogor: IPB. hlm. 1–87.
Harahap Y. 2006. Pembentukan akrilamida dalam makanan dan analisisnya. Majalah Ilmu Kefarmasian. 3(3):107–16.
Herlambang N. 2006. Pengaruh penambahan vitamin E pada terapi standar stroke iskemik akut terhadap perbaikan status neurologis. Tesis. Semarang: Undip. hlm. 67–95.
Hidajat B. 2005. Penggunaan antioksidan pada anak. J. Continuing Education Ilmu Kesehatan Anak. 35(1): 1–10.
Hilbert T, Lifshitz MS. 2007. Lipids and dyslipoproteinemia dalam: henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods. United States Of America: Saunders Elsevier. pp. 201–17.
Jannah R, Widodo, Putri JF, Rahman S, Lukitasari M. 2013. Pengukuran kadar OX–LDL(low density lipoprotein oxidation) pada penderita aterosklerosis dengan uji elisa. J. Biotropika FKUB. 1(2): 62–65.
Kementrian Perindustrian. 2009. Roadmap industri pengolahan CPO. Jakarta: Direktorat Jenderal Industri Agro dan Kimia Departemen Perindustrian. hlm. 1–33.
73
http://www.imq21.com/news/read/164310/20130724/145814/Kebutuhan– Minyak–Goreng–Capai–4–2–Juta–Ton.html
Kementrian Pertanian. 2013. Basis Data Statistik Pertanian: Mengkudu. Jakarta: Kementrian Pertanian. hlm. 1–15.
Ketaren S. 2008. Pengantar teknologi minyak dan lemak pangan. Jakarta: UI. hlm. 1–185.
Kleinschmidt KC. 2006. Epidemiology and patophysiology of acute coronary syndrome. J. Johns Hopkins Advances Studies in Nursing. 4(4): 72–7. Kumar A, Cannon CP. 2009. Acute coronary syndromes: diagnosis and
management part 1. J. Mayo Clin Proc. 84(10): 917–38.
Kumar R, Kumar A, Sharma R, Baruwa A. 2010. Pharmacological review on natural ACE interview. J. Der Pharmacia Lettre. 2(2): 273–93.
Kusumawati D. 2004. Bersahabat dengan hewan coba. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. hlm. 92–108.
Libby P, Ridker PM, Maseri A. 2002. Inflammation and atherosclerosis. J. Circulation. 1(5): 1135–43.
Lusis AJ. 2000. Atherosclerosis. J. Nature. 407(6801): 233–41.
Mahmudatussa AI. 2013. Modul minyak goreng. Bandung: UPI. hlm. 1–35. Mescher AL. 2010. Junqueira`s basic histology text and atlas. United States Of
America : McGraw–Hill. pp. 203–17.
Moore KL, Dalley AF, Aggur A. 2010. Clinically oriented anatomy sixth edition. Philadelphia: Lippincotts Wiliams and Wilkins. pp. 268–92.
Mulyati S, Meilina, Hesti. 2006. Pemurnian minyak jelantah dengan menggunakan sari mengkudu. Laporan Penelitian. Banda Aceh: Fakultas Teknik Universitas Negeri Syiah Kuala. hlm. 46–78.
Nauseef WM. 2004. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase. J. Histochem Cellular Biology. 1(22): 277–92
Niki E. 2011. Do free radicals play causal role in atherosclerosis? Low density lipoprotein oxidation and vitamin E revisited. J. Of Clinical Biochemistery and Nutrition. 48(1): 3–7.
Noeltrg. Indonesia bebas minyak curah tahun 2015. 2012. Direktorat jendral
http://ditjenpdn.kemendag.go.id/WEB/index.php/public/information/articles –detail/berita/82
Notoatmodjo S. 2010. Metodologi penelitian kesehatan. Jakarta: PT.Rineka Cipta. hlm. 120–38.
Noviani C. 2010. Pemberian l–carnitine dapat memperbaiki profil lipid darah tikus putih yang hiperkolestrolemia. Tesis. Bali:Universitas Udayana. hlm.1–73.
Palu AK, Kim AH, West BJ, Deng S, Jensen J, White L. 2008. The effects of Morinda citrifolia L(noni) on the immune system:Its molecular mechanisms of action. J. Ethonopharmacol. 115(3): 502–6.
Panda S, Kar A. 2006. Evaluation of the antithyroid, antioxidative and antihyperglycemic activity of scopoletin from Aegle marmelos leaves in hyperthyroid rats. J. Phytother Res. 20(12):1103–5.
Prabowo AY. 2013. Perbandingan pengaruh pemberian ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocurpa) dengan ekstrak daun ceplukan (Physalis angulata l.) terhadap gambaran histopatologi hepar pada tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Sprague dawley yang diinduksi rifampisin. Skripsi. Bandar Lampung: Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
Pramuditha EA. 2011. Hubungan antara skor ankle brachial index dengan stroke iskemik akut. Tesis. Yogyakarta: FKUGM. hlm.1–68.
Ramatina. 2011. Efektivitas berbagai suplemen antioksidan terhadap penurunan status oksidatif (Malondialdehid (MDA) plasma) pada mahasiswi alih jenis IPB. Tesis. Bogor: IPB. hlm. 68–75.
Ratnawati R. 2013. Pengaruh ekstrak polifenol buah tin (Ficus carica linn) terhadap ketebalan dinding pembuluh darah aorta tikus galur wistar (Rattus norvegicus) yang diberi diet atherogenik. J. Universitas Brawijaya. 1(3): 1– 9.
Ridwan E. 2013. Etika pemanfaatan hewan percobaan dalam penelitian kesehatan. J. Indonesian Medical Association. 63(3): 112–6.
Rioufol G, Finet G. 2007. The adventitia–the new frontier in coronary atherosclerosis imaging. J. Touch Briefings. 1(1): 15–6.
Robinson T. 2005. Kandungan organik tumbuhan tinggi. Bandung: ITB. hlm. 192–3.
