AMPLIFIKASI GEN
BAR
DAN GEN
HPT
TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Netria Wahyuni
ABSTRAK
NETRIA WAHYUNI. Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt Terkait Stabilitas
Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya. Dibimbing oleh SURYANI dan TRI JOKO SANTOSO.
Sistem transposon Ac/Ds mengandung konstrak sebagai penanda
aktivasi dan berfungsi dalam mengembangkan tanaman mutan yang menghasilkan perubahan-perubahan fenotipe. Penelitian ini bertujuan mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan dengan stabilitas padi mutan
transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan karakter agronominya.
Materi tanaman padi yang digunakan untuk penelitian adalah 6 galur padi IR.64 T2 mutan (total 214 tanaman) dan padi IR.64 sebagai kontrol. Tanaman-tanaman mutan diisolasi DNA-nya dan diamplifikasi PCR dengan menggunakan pasangan primer spesifik untuk gen bar dan hpt. Hasil
penelitian menunjukkan ukuran gen bar dan gen hpt masing-masing
berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Perubahan karakter-karakter agronomi pada tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 disebabkan adanya insersi elemen transposon yang mengandung 4x enhancer.
Kata kunci: IR64, karakter agronomi, Transposon Ac/Ds.
ABSTRACT
NETRIA WAHYUNI. Amplification of bar Gene and hpt Gene Related to Rice Mutant Stability and The Evaluation of it’s Agronomy Character. Supervised by SURYANI and TRI JOKO SANTOSO.
Transposon Ac / Ds system containing an activation tagging constructs serves to develop a mutant plant that will produce changes in phenotype. This study aims to amplify the bar and hpt genes related to the stability of the mutant rice transposon Ac/Ds and observe the changes in phenotype based on the agronomy characters. Rice plant materials used for the study were six mutant T2 rice lines IR.64 (total 214 plants) and IR64 wild type rice as a control. The DNA of mutant plants was isolated and then amplified by PCR technique using primers specific for the bar and hpt genes. The results showed that the bar and hpt genes in the rice plant IR.64
mutant T2 with size were ± 700 bp and ± 600 bp. Evaluation of agronomic characters showed there were changes in these characters of mutant rice lines IR64 generation T2 that probably caused by the transposon insertion element containing 4x enhancer.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
AMPLIFIKASI GEN
BAR
DAN GEN
HPT
TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan
serta Evaluasi Karakter Agronominya Nama : Netria Wahyuni
NIM : G84100090
Disetujui oleh
Dr Suryani, SP MSc Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga bulan Mei 2014 ini adalah Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Suryani, SP MSc dan Bapak Dr Tri Joko Santoso, SP MSi selaku dosen pembimbing yang telah banyak memberikan pengarahan dan saran. Terima kasih kepada bapak Dr Tri Joko Santoso untuk proyek penelitian dan kesempatan melakukan penelitian sampai selesai di BB Biogen Cimanggu Bogor. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Nur, Ka Mira, Mba Mariana, Ka Ammar, Wulan beserta seluruh staf Konservasi Biologi Molekuler BB-Biogen yang telah membantu selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL iii
DAFTAR GAMBAR iv
DAFTAR LAMPIRAN iv
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Bahan dan alat 2
Prosedur Penelitian 2
HASIL 4
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2 4
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi 5
Amplifikon PCR Gen bar dan Gen hpt 5
PEMBAHASAN 8
Hasil Isolasi DNA Padi 8
Amplikon Gen bar dan Gen hpt 9
Evaluasi Karakter Agronomi 10
SIMPULAN DAN SARAN 11
Simpulan 11
Saran 11
DAFTAR PUSTAKA 11
LAMPIRAN 13
DAFTAR TABEL
1. Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar
(kontrol) 2
2. Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
setelah ditanam di bak semai 4
3. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman
perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2 5
4. Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan 7 5. Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64
mutan generasi T2 7
6. Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun
bendera padi IR64 T2 mutan 7
7. Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64
T2 mutan 8
DAFTAR GAMBAR
1. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2. 6 2. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1. 6 3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Ac/Ds 9
DAFTAR LAMPIRAN
1. Diagram alur penelitian 14
2. Konsentrasi dan kemurnian DNA 14
3. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Bar 21
4. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Hpt 24
5. Hasil analisis kestabilan transposon Ds 26
PENDAHULUAN
Kekayaan genom padi dapat dieksplorasi melalui identifikasi gen-gen penting yang terdapat di dalam genom padi yang berperan dalam menentukan fenotipe, dan mendapatkan informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga kualitasnya dapat ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte
(1998) pendekatan yang dilakukan dalam menganalisis fungsi gen ada dua yaitu
forward genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan
dengan menganalisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke sekuen gennya, sedangkan pendekatan reverse genetics dilakukan dengan
berpedoman pada informasi sekuen gen yang diketahui.
Transposon merupakan segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari satu lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu DNA dan meligasinya (Griffth et al. 1999). Transposon Ac (activator) telah
mengalami delesi pada bagian inverted repeat sehingga bersifat tidak mampu
berpindah, tetapi menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003).
Transposon Ds (dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase
sehingga tidak menghasilkan enzim transposase (non-otonom) dan mampu berpindah (mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam
genom menuju tempat yang berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional. Sedangkan elemen Ac akan menyandikan enzim untuk mengaktifkan elemen Ds
selama bertransposisi. Transposon Ds yang terdapat dalam genom tanaman akan
stabil jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004).
Kestabilan mutan diketahui dengan mengidentifikasi gen-gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin (gen hpt) dan ketahanan terhadap herbisida (gen bar)
yang masing-masing berada pada elemen Ac dan elemen Ds. Enzim higromisin
fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt memiliki peran dalam mendetoksifikasi
aminosiklitol antibiotik higromisin B. Gen bar (basta resistant) adalah gen yang
membawa ketahanan terhadap fosfinotrisin (PPT), yang merupakan bahan aktif herbisida bialaphos dan basta (Rodriguez & Nottenburg 2002).
Posisi mutasi yang berbeda-beda di dalam tanaman padi dapat diperoleh melalui aktivitas perpindahan transposon Ds (Greco et al. 2001). Kestabilan
tanaman mutan berdasarkan ada tidaknya elemen Ac dapat diidentifikasi menggunakan teknik PCR dengan mengamplifikasi gen bar yang dibawa oleh
elemen Ds dan gen hpt yang dibawa oleh elemen Ac. Tanaman padi IR64 mutan
akan stabil dalam kromosom tanaman apabila gen bar menyisip dan teramplifikasi
setelah pengecekan melaui PCR sedangkan gen hpt tidak teramplifikasi pada
tanaman tersebut. Pengujian tanaman yang menunjukan tidak stabilnya mutan pada tanaman padi mutan (transposon Ds) akan terus mengalami perubahan fenotipe
pada tanaman padi sampai generasi selanjutnya dan transposon Ds terus menyisip
dan berpindah kekromosom lainnya. Tanaman padi mutan yang stabil akan mengalami perubahan fenotipe yang sama dari generasi ke generasi selanjutnya.
Penelitian ini bertujuan mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan
dengan stabilitas padi mutan transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan
untuk mengidentifikasi gen-gen penting di bidang pertanian dapat dimanfaatkan sebagai varietas unggul baru setelah dilakukan pengujian-pengujian lebih lanjut.
METODE
Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan untuk penelitian terdiri 6 galur tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 dan 1 galur tanaman padi IR 64 tipe liar dengan total tanaman sebanyak 239. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah NF water, primer hpt (higromisin fosfotransferase) dan primer bar (basta resistant), 10x Bufer PCR,
MgCl2, dNTP mix 10 mM, Taq DNA polymerase, gel agarosa, 1x buffer TAE
(Tris HCl-asam asetat-EDTA), loading dye, T4 DNA polymerase (gel red), DNA hasil PCR, dan marker 1 kb ladder.
Peralatan yang digunakan adalah tabung mikro 2 mL, tabung mikro 1.5 mL, pipet mikro 1000p, 200p, 20p, 2p dan multichanel mikropipet, tip, oven, microfuge,
neraca analitik, spektrofotometer nanodrop, stirer, vorteks, UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad, perangkat elektroforesis vertikal, ice maker, labu
Erlenmeyer, microwave,gelas ukur, gelas piala, baki gel agarosa, plate PCR, kulkas
penyimpanan sampel, dan mesin PCR tetrad PTC-225. Prosedur Penelitian
Penanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang digunakan sebagai bahan sampel penelitian memiliki kode tanaman untuk masing-masing galur dengan arti sebagai berikut, T2 menyatakan tanaman padi mutan generasi T2, 64 sebagai tanaman padi kultivar IR.64, B2 menyatakan transposon (konstrak B2) dan 4.12.1
menyatakan nama galur tanaman padi mutan. Galur-galur tanaman sebanyak 6 galur digunakan sebagai sampel untuk pengujian kestabilan elemen transposon Dc
di dalam genom tanaman tersebut, dan digunakan untuk mengetahui pengamatan perubahan karakter agronominya. Total benih tanaman yang digunakan sebanyak 360 bulir padi IR.64 T2 mutan (6 galur padi IR.64 mutan generasi T2) dan 25 bulir (1 galur) padi IR.64 tipe liar yang digunakan sebagai kontrol (Tabel 1).
Tabel 1 Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
Isolasi DNA Daun Padi (Doyle & Doyle 1987)
Sampel daun dipotong dari tanaman padi sepanjang 10 cm dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL. Sampel daun bersama dengan tabung direndam ke dalam nitrogen cair dan digerus dengan penggerus (sumpit bambu) sampai halus berbentuk serbuk. Hasil gerusan kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak 1000 µL, dicampur dan kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 15 menit pada penangas air (setiap 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel didinginkan pada suhu ruang, dan kemudian ditambahkan dengan natrium asetat 3M sebanyak 100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1) sebanyak 1
mL. Campuran kemudian dibolak-balik secara perlahan-lahan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang baru dan kemudian ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume supernatan dan isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan. Campuran kemudian di bolak-balik secara perlahan-lahan untuk mempresipitasi DNA. Sampel disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan dibuang perlahan-lahan agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang terbentuk ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan di oven pada suhu 60oC sampai kering. Sampel DNA yang diperoleh kemudian dimurnikan dari RNA-nya dengan ditambahkan TE-RNase sebanyak 50 µL dan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, setelah itu DNA disimpan pada suhu -20oC.
Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher Scientific 2009)
Sebanyak 2 μL larutan buffer TE dimasukkan ke dalam lubang ukur sebagai blanko. Setelah itu, lubang ukur dibersihkan dengan mengelap menggunakan kertas tisu. Kemudian, sampel DNA sebanyak 2 μL dimasukkan ke dalam lubang ukur dan diukur konsentrasinya mengikuti prosedur pengukuran dari alat nanodrop tersebut. Hasil pengukuran akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/μL. Nilai kemurnian DNA dapat dilihat berdasarkan nilai rasio pembacaan Å260/Å280.
Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011)
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer yang spesifik terhadap sampel yang digunakan yaitu primer untuk gen ketahanan basta
(bar) dan gen ketahanan antibiotik higromisin (hpt). Sekuen primer hpt dan bar
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook & Russell 2001)
Sebanyak 1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 mL 1x bufer TAE (konsentrasi gel 1%). Larutan tersebut dipanaskan dalam microwave selama 2
menit. Agarose yang sudah terlarut dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur. Setelah gel agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 5 μL produk PCR dicampur dengan 2 μL loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Penanda migrasi (marker) 1 kb ladder juga dimasukan ke dalam sumur gel yang lain. Tahap
selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 75 volt selama 40 menit. Hasil elektroforesis gel agarose divisualisasi menggunakan chemidoc gel system.
Analisis Kestabilan Transposon Ds
Data kemunculan pita-pita DNA hasil PCR menggunakan primer hpt dan bar digunakan untuk menentukan kestabilan transposon Ds di dalam tanaman padi
IR64 mutan. Tanaman padi IR64 mutan generasi T2 dikatakan stabil apabila data hasil elektroforegram menunjukan hasil positif untuk primer bar dan negatif untuk primer hpt.
Evaluasi Karakter Agronomi Padi Mutan
Pengamatan karakter-karakter agronomi padi dilakukan terhadap 6 galur padi IR.64 T2 mutan dan 1 galur IR.64 tipe liar (kontrol). Parameter yang diamati adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji isi dan hampa per malai, panjang malai, jumlah anakan, panjang daun bendera, bobot 100 butir. Data hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan software statistik SAS 7 dan uji lanjut duncan.
HASIL
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Galur-galur padi IR64 mutan generasi T2 yang ditanam di rumah kaca menunjukkan bahwa dari sebanyak 60 benih per galur tidak semuanya dapat tumbuh menjadi tanaman. Total tanaman yang tumbuh dari masing-masing galur ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol) setelah ditanam di bak semai
Kode Tanaman Tanaman Normal Tanaman Albino Tanaman Mati T2.64.B2.4.12.1 20 Tanaman 11 Tanaman 29 Tanaman T2.64.B2.4.12.2 25 Tanaman 9 Tanaman 26 Tanaman T2.64.B2.4.5.1 46 Tanaman 3 Tanaman 11 Tanaman T2.64.B2.4.5.2 26 Tanaman 16 Tanaman 18 Tanaman T2.64.B2.5.3.8 51 Tanaman 4 Tanaman 5 Tanaman T2.64.B2.5.3.2 46 Tanaman 6 Tanaman 8 Tanaman
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi
Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada tanaman padi IR.64 T2 mutan dan tanaman padi IR.64 tipe liar (kontrol) ditunjukkan pada Tabel 3. Data yang ditampilkan merupakan wakil dari setiap galur (satu galur terdiri dari dua tanaman), adapun data secara lengkap disajikan pada bagian lampiran. Galur padi mutan T2.64.B2.5.3.2.9 memiliki konsentrasi DNA yang paling rendah (82.4 ng/ul) dan memiliki kemurnian DNA yang rendah (1.8) jika dibandingkan dengan galur tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang lainnya dan kontrol. Beberapa galur tanaman padi menunjukan nilai kemurnian yang baik pada kisaran 1.8-2.0 yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA. DNA hasil isolasi dari enam galur padi IR.64 T2 mutan dan satu galur padi IR.64 tipe liar (kontrol) selanjutnya digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi PCR untuk mendeteksi keberadaan gen bar dan hpt menggunakan primer spesifik gen.
Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2
Sampel Konsentrasi A 260/280 tanaman diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik terhadap keberadaan gen bar dan primer spesifik terhadap gen hpt. Berdasarkan data hasil amplifikasi
PCR diketahui bahwa sebagian besar tanaman-tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 menunjukkan hasil positif setelah diamplifikasi dengan primer bar yaitu
diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran ±700 bp. Hasil amplifikasi PCR terhadap gen bar diambil perwakilan pada tanaman-tanaman
mutan galur T2.64.B2.4.12.2 dan ditampilkan pada Gambar 1. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa dari 10 tanaman mutan, 9 diantaranya positif mengandung gen
bar sedangkan tanaman negatif terhadap pengujian gen bar yaitu tanaman nomor
13 (T2.64.B2.4.12.2.20). Sementara itu, hasil amplifikasi PCR dengan primer spesifik bar pada galur-galur yang lain ditampilkan pada lampiran.
Hasil amplifikasi DNA padi dengan primer hpt pada padi galur
T2.64.B2.4.12.1 nomor (4-15 dan 18-20) menyatakan hasil adanya gen hpt yang
(Gambar 2). Adapun pada tanaman nomor 16 dan 17 tidak mengandung gen hpt
karena tidak terbentuk pita DNA dengan ukuran yang diharapkan. Sementara itu, hasil amplifikasi PCR dengan primer gen hpt pada galur-galur yang lain ditampilkan pada lampiran.
Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2. Marker, plasmid, kontrol (IR64 tipe liar), tanaman padi mutan nomor 4-12 positif gen bar,
sampel nomor 13 negatif gen bar
Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1. Marker, plasmid, kontrol (IR.64 tipe liar), tanaman padi nomor 4-15 dan 18-20 positif mengandung hpt, tanaman padi nomor 16 dan 17 negatif hpt
Stabilitas Transposon Ds pada Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Hasil analisis kestabilan tanaman-tanaman mutan padi IR.64 mutan generasi T2 disajikan pada Tabel 4. Data yang ditampilkan merupakan perwakilan tanaman dari tiap-tiap galur dan setiap galur diambil perwakilan 2 sampel tanaman. Tanaman-tanaman mutan padi yang telah stabil diindikasikan dengan positif gen
bar dan negatif gen hpt. Hal ini menunjukan bahwa pada tanaman-tanaman mutan
masih mengandung elemen transposon Ds (positif bar). Hasil analisis PCR untuk
semua tanaman pada 6 galur padi IR.64 mutan generasi T2 dengan jumlah total 214 tanaman menunjukkan bahwa 94 tanaman telah stabil tranposon Ds di dalam genom
tanaman (Tabel 5).
Tabel 4 Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan
Padi Mutan Gen bar Gen hpt Kestabilan
Tabel 5 Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64 mutan generasi T2
Nama galur Positif bar Jumlah tanaman tanaman Total (stabil) Positif hpt Positif bar dan hpt Negatif bar dan hpt
Hasil analisis menunjukkan bahwa karakter agronomi seperti tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera, jumlah gabah hampa dan gabah isi, serta bobot 100 butir menunjukkan karakter agronomi pada tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 lebih baik dibandingkan dengan tanaman padi kontrol pada taraf uji beda nyata 5% pengujian lanjutan duncan (Tabel 6 dan Tabel 7). Dari hasil pengamatan diketahui bahwa terdapat dua galur padi mutan yang mempunyai karakter agronomi tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai, panjang daun bendera berbeda nyata dengan kontrol yaitu galur F dan G (Tabel 6).
gabah yang secara nyata lebih tinggi dari kontrol dan semua galur padi mutan mempunyai jumlah gabah hampa yang lebih tinggi dari kontrol.
Tabel 6 Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera padi IR64 T2 mutan
Keterangan: a dan bAngka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil
yang tidak berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menunjukan banyak ulangan perlakuan.
Tabel 7 Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64 T2 mutan
Keterangan: a,b,cAngka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil tidak
berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menyatakan banyaknya ulangan perlakuan.
PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Padi
pada kisaran nilai 1.8-2.0. Konsentrasi hasil pengukuran cukup untuk digunakan sebagai cetakan pada tahap amplifikasi dengan teknik PCR. Kontaminasi RNA dan protein yang terdapat di dalam beberapa sampel tidak membutuhkan proses pemurnian atau isolasi ulang. Hal ini dikarenakan RNA dan protein yang terdapat di dalam sampel DNA akan terdegradasi pada saat proses PCR terutama pada tahapan denaturasi. Kontaminan baik RNA maupun protein yang terdapat di dalam sampel DNA konsentrasinya sangat kecil sehingga dapat diabaikan dan tidak berpengaruh terhadap proses amplifikasi PCR (Sambrook et al. 2001).
Amplikon Gen bar dan Gen hpt
Konfirmasi keberadaan elemen transposon Ac/Ds di dalam tanaman padi
dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) melalui amplifikasi gen bar dan gen hpt. Dari informasi keberadaan elemen Ac dan Ds dapat digunakan
untuk mengetahui stabilitas tanaman padi IR64 mutan generasi T2. Elektroforesis hasil amplifikasi PCR pada sampel DNA padi mutan generasi T2 dilakukan menggunakan gel agarosa 1%. Hasil elektroforesi gel agarose terlihat pada Gambar 1 dan Gambar 2. Agarosa memiliki resolusi pemisahan lebih rendah dibandingkan dengan pemisahan menggunakan poliakrilamid, kisaran pemisahan lebih besar dan pengujian kualitatif DNA lebih baik (Sambrook et al. 2001).
Primer bar digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan elemen transposon Ds sedangkan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac di
dalam tanaman. Hal ini dikarenakan gen bar berada satu fragmen dengan elemen Ds sedangkan gen hpt (hyg) berada satu fragmen dengan elemen Ac (Gambar 3).
Hasil analisis PCR menggunakan primer bar pada tanaman IR.64 T2 mutan
menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon gen bar yang berukuran ±
700 bp sedangkan primer hpt menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon dengan ukuran 600 bp.
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa elemen transposon Ac dan Ds masih
tersisip di dalam genom atau kromosom galur-galur tanaman padi IR.64 T2 mutan. Berdasarkan hasil PCR gen bar dan gen hpt, dapat diketahui sampel
tanaman-tanaman mutan padi yang stabil. Tanaman IR.64 mutan generasi T2 telah stabil trasnposon Ds apabila hasil amplifikasi PCR positif dengan primer bar dan negatif
dengan primer hpt. Secara umum, hasil analisis PCR pada 6 galur padi IR64 mutan
generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214 tanaman (43,9%) yang telah stabil yang diindikasikan dengan hasil PCR positif pada gen bar saja (Tabel 5).
Gambar 3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Menurut Greco et al (2001) untuk memperoleh tanaman mutan yang
diinginkan diperlukan transposon yang stabil, sehingga tidak terjadi perpindahan ke kromosom lain. Kualitas pita-pita hasil elektroforegram yang dihasilkan cukup baik, karena hanya sedikit intensitas fragmen smear (Gambar 1 dan Gambar 2).
Fragmen ini muncul karena terpotongnya untaian DNA utuh penyusun kromosom selama ekstraksi DNA. Fragmen DNA terpotong disebabkan kerusakan mekanis karena penggerusan, ataupun aktifitas enzim selama isolasi, konsentrasi DNA yang tinggi, dan penggunaan voltase yang terlalu besar (Jamsari 2007).
Evaluasi Karakter Agronomi
Pengamatan tinggi tanaman dilakukan pada waktu tanaman memiliki malai dan bulir malai padi berisi padat. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi. Evaluasi karakter tinggi tanaman menunjukkan bahwa semua galur padi mutan mengalami perubahan tinggi tanaman yaitu lebih tinggi apabila dibandingkan dengan kontrol kecuali untuk galur B (Tabel 6). Evaluasi karakter jumlah malai menunjukkan bahwa empat galur padi mutan mempunyai jumlah malai tidak berbeda nyata dengan kontrol (galur B, C, D dan E), sementara 2 galur lainnya (galur F dan G) mempunyai jumlah malai yang lebih sedikit dibanding kontrol (Tabel 6). Panjang malai, empat galur padi mutan mempunyai malai yang lebih panjang dibandingkan dengan kontrol. Panjang daun bendera 6 galur tanaman padi IR.64 T2 mutan menunjukan hasil yang berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% yaitu lebih panjang dibandingkan tanaman padi IR.64 kontrol.
Peralihan dari fase vegetatif ke fase generatif tanaman padi ditunjukan dengan tanaman padi yang mulai berbunga. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa umur berbunga padi IR.64 T2 mutan (84 hari) lebih cepat dibandingkan tanaman IR.64 kontrol positif (90 hari). Perbedaan pembungaan tanaman merupakan sifat agronomi yang dipengaruhi faktor genetik dan fisiologi. Sehingga diduga terjadi akumulasi alel-alel dari tetua pada individu (Trijatmiko 2001). Bobot 100 butir padi IR.64 kontrol (2.44 g) lebih besar dibandingkan 6 galur tanaman padi IR.64 T2 mutan. Hasil analisis menunjukkan bobot 100 bulir gabah untuk masing-masing galur (6 galur) padi IR.64 mutan berbeda nyata dengan bobot IR.64 kontrol karena bobot kontrol lebih berat, sedangkan perbandingan terhadap sesama galur mutan menunjukan hasil tidak berbeda nyata pada taraf uji lanjut 5%. Bobot IR.64 T2 mutan dan bobot bulir IR64 kontrol masih lebih kecil dibandingkan bobot bulir padi ideal (2.8-3.0 g) (Ma et al. 2006).
Tanaman padi ideal memiliki jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan gabah isi lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil analis lanjut pada taraf 5% uji
duncen gabah isi menunjukkan jumlah gabah isi terbesar pada galur padi mutan T2.64.B2.5.3.2 (G) dan berbeda nyata terhadap IR.64 kontrol dan galur mutan lainnya (Tabel7). Hasil pengamatan gabah hampa menunjukkan bahwa padi IR.64 T2 mutan pada galur T2.64.B2.4.5.2 (E) memiliki jumlah gabah hampa terbanyak serta berbeda nyata terhadap gabah galur T2.64.B2.5.3.2, T2.64.B2.4.5.1 dan IR64 kontrol (Tabel7). Hasil analisis pada panjang daun bendera (Tabel 6) dengan hasil pengukuran terpanjang pada galur mutan G yang berbeda nyata terhadap IR.64 kontrol dan galur mutan B pada taraf uji lanjut 5%.
Hasil penelitian Peng et al (2008) menunjukkan bahwa untuk meningkatkan
analisis karakter agronomi tanaman padi IR.64 T2 mutan dan IR.64 kontrol telah menunjukan hasil yang sesuai dengan hasil penelitian Peng et al (2008) karena hasil
pengujian tinggi tanaman, jumlah gabah per malai dan ukuran malai tanaman padi IR.64 T2 mutan yang lebih besar dibandingkan IR.64 kontrol. Perubahan-perubahan karakter agronomi diduga disebabkan oleh adanya insersi elemen transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom yang berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter agronomi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen bar dan gen hpt di dalam tanaman padi IR.64 T2 mutan dapat
diamplifikasi menggunakan primer spesifik gen bar dan gen hpt dan menghasilkan
amplikon masing-masing berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Hasil analisis PCR pada 6 galur padi IR64 mutan generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214 tanaman (43,9%) yang telah stabil yang diindikasikan dengan hasil PCR positif pada gen bar saja. Evaluasi karakter-karakter agronomi menunjukkan telah terjadi perubahan karakter-karakter tersebut pada tanaman padi IR64 mutan generasi T2. Perubahan-perubahan tersebut kemungkinan diduga disebabkan oleh adanya insersi elemen transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom yang berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter agronomi.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi gen-gen yang berhubungan dengan perubahan-perubahan karakter agronomi pada generasi tanaman padi IR64 mutan berikutnya.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan padi varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7.
Bouchez D, H Hofte. 1998. Functional genomic in plants. Plant Physiol.
118:725-732.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Brooker R J. 2005. Analysis and Principle. 2nd ed. New York (US): McGraw-Hill
companies, Inc.
Griffith AJF. 1999. An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York (US):
W.H. Freeman.
Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E genetics in rice. Theory Applied Genetics 108: 10-24.
Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, and G An. 2002. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.
Plant Physiology 130: 1636-1644.
Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy, M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran. 2004. Establishing an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37:
301-314.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105.
Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375.
Rodriguez RC, Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in genetic transformation especially in plants. [internet]. [diunduh pada 2014
Juni 15]. Tersedia pada http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb. Sambrook J, DW Russel. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New
York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.
Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira. 2005. Activation tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam
Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer.
Webb KJ, Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation, In: Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian
Isolasi DNA padi
Analisis kuantitatif dan kualitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforesis
Identifikasi karakter unggul agronomi Penanaman benih (IR64 mutan generasi T2 dan
IR64 kontrol)
Sampel Konsentrasi A 260/280 Kontrol 1 441.2 1.9 Kontrol 2 689.5 1.9 Kontrol 3 1151.8 1.97 Kontrol 4 568.2 1.9 Kontrol 5 650.4 1.95 Kontrol 6 666.6 1.91 Kontrol 7 859.6 1.87 Kontrol 8 947.8 1.96 Kontrol 9 993.4 1.95 Kontrol 10 635.2 1.88 Kontrol 11 686.4 1.89 Kontrol 12 687.2 1.9 Kontrol 13 362.2 1.86 Kontrol 14 449.8 1.9 Kontrol 15 541.5 1.87 Kontrol 16 735.9 2.01 Kontrol 17 351.7 1.88 Kontrol 18 737.6 1.95 Kontrol 19 1496.3 1.98 Kontrol 20 340 1.85 Kontrol 21 415.2 1.9 Kontrol 22 286.4 1.88 Kontrol 23 460.2 1.88 Kontrol 24 2012.4 1.94 Kontrol 25 979.8 1.92
Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Bar
Padi Mutan Gen bar Gen hpt Kestabilan
Lampiran 6 Motif Sekuen Primer yang Digunakan
No. Primer Motif
1. Bar
F:5’ACC ATG AGC CCA GAA CGA CGC 3’
R: 5’ CAG GCT GAA GTC CAG CTG CCA G 3’
2. Hpt F: 5’ AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA 3’
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bengkulu pada tanggal 4 Agustus 1993 dari ayah bernama Yunsuki Asim (Alm) dan ibu bernama Jaunila. Penulis merupakan anak keempat dari 4 bersaudara. Pendidikan penulis dimulai dari SDN 12 Kota Bengkulu, kemudian melanjutkan pendidikan ke jenjang Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 20 Kota Bengkulu. Tahun 2010 penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 3 Kota Bengkulu dan pada tahun yang sama lolos seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur SNMPTN dan diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif dalam kegiatan organisasi kampus, diantaranya sebagai staff Divisi C-Core Community Research and Educatioan of Biochemistry (CREB’s) periode 2011/2012, dan sebagai badan
pengawas Divisi C-Core Community Research and Education of Biochemistry (CREB’s) IPB tahun 2013.
Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia
Biochemistry Champion League 2011, SPIRIT FMIPA 2012, Seminar Kesehatan
