POTENSI EKSTRAK AIR DAN ETANOL KUMIS KUCING,
PEGAGAN, TEMPUYUNG, DAN SAMBILOTO SEBAGAI
ANTIHIPERTENSI SERTA PROFIL SENYAWA
PENCIRINYA
AJENG MAHARDININGTYAS SAVITRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Ekstrak Air dan Etanol Kumis Kucing, Pegagan, Tempuyung, dan Sambiloto sebagai Antihipertensi serta Profil Senyawa Pencirinya adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
AJENG MAHARDININGTYAS SAVITRI. Potensi Ekstrak Air dan Etanol Kumis Kucing, Pegagan, Tempuyung, dan Sambiloto sebagai Antihipertensi serta Profil Senyawa Pencirinya. Dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan WULAN TRI WAHYUNI.
Kumis kucing, pegagan, tempuyung, dan sambiloto merupakan tanaman obat yang banyak digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, seperti hipertensi. Tujuan penelitian ini adalah menentukan aktivitas inhibisi ekstrak air dan ekstrak etanol 30% kumis kucing, pegagan, tempuyung, dan sambiloto terhadap angiotensin converting enzyme (ACE) secara in vitro. Tiga esktrak dengan daya inhibisi tertinggi selanjutnya diformulasi dengan mixture design dan diuji aktivitas inhibisinya terhadap ACE. Uji aktivitas inhibisi ACE menunjukkan bahwa ekstrak etanol 30% pegagan, ekstrak etanol 30% kumis kucing, dan ekstrak air kumis kucing memiliki aktivitas 3 inhibisi tertinggi. Gabungan ketiga ekstrak tersebut dengan komposisi (1/6:1/6:2/3) pada konsentrasi 100 ppm memiliki aktivitas inhibisi ACE hampir sebanding dengan inhibisi kaptopril pada konsentrasi 100 ppm. Analisis profil senyawa penciri dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan adanya pita sinensetin. Sementara analisis kromatografi cair kinerja tinggi menunjukkan bahwa formula ekstrak berpotensi mengandung asiatikosida lebih banyak dibandingkan dengan sinensetin.
Kata kunci: antihipertensi, asiatikosida, penghambatan ACE, sinensetin
ABSTRACT
EMILIA FATMAWATI. Potency of Water and Ethanol Extracts of Kumis Kucing, Pegagan, Tempuyung, and Sambiloto as Antihypertensive and The Profile of Their Marker Compounds. Supervised by LATIFAH K. DARUSMAN and WULAN TRI WAHYUNI.
Kumis kucing, pegagan, tempuyung, and sambiloto are widely used as medicinal plants to treat a variety of diseases, such as hypertension. The objective of this researchs was to determine inhibitory activity of water extracts and 30% ethanol extract of these plants against ACE through in vitro assay. Three extracts with the highest inhibitory activity were formulated by using mixture design and its inhibitory activity against ACE was investigated. The result showed that 30% ethanol extract of pegagan, 30% ethanol extract of kumis kucing, and water extract of kumis kucing showed three of the highest inhibitory activity. Formulation of these extracts in composition of 1/6:1/6:2/3 and concentration of 100 ppm showed inhibition against ACE that slightly lower than inhibition of captopril at 100 ppm. Analysis of marker compounds by using thin layer chromatography showed that sinensetin band detected under UV light at 254 nm and 366 nm. Meanwhile high performance liquid chromatographic analysis showed that the formula contain asiaticoside more than sinensetin.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
POTENSI EKSTRAK AIR DAN ETANOL KUMIS KUCING,
PEGAGAN, TEMPUYUNG, DAN SAMBILOTO SEBAGAI
ANTIHIPERTENSI SERTA PROFIL SENYAWA
PENCIRINYA
AJENG MAHARDININGTYAS SAVITRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan nikmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian serta menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah yang berjudul Potensi Ekstrak Air dan Etanol Kumis Kucing, Pegagan, Tempuyung, dan Sambiloto sebagai Antihipertensi serta Profil Senyawa Pencirinya ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Kimia FMIPA IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS dan Wulan Tri Wahyuni, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, saran, dan arahan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini berlangsung. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Eman Suherman, Ibu Nunung, Bapak Dede, Bapak Kosasih, Ibu Nunuk, Ibu Anggi, Ibu Laela, semua staf Kependidikan Laboratorium Kimia Analitik, dan semua staf Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan yang diberikan selama penelitian. Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih kepada ayah, ibu, adik, Fahmi Luthfie, Meilisa, Ira, Baiq, Gemilang, Herdiyanto, Cempaka, Pitria Aprilani, dan Ati yang telah memberikan doa dan dukungannya hingga penelitian dan penulisan karya ilmiah ini selesai.
Semoga laporan ini bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Agustus 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Tujuan Penelitian 2
BAHAN DAN METODE 2
Alat dan Bahan 2
Metode 2
HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Kadar Air dan Ekstraksi Sampel 5
Uji Inhibisi Ekstrak Tunggal terhadap Aktivitas ACE secara In Vitro 6
Formulasi Ekstrak dengan Mixture Design 8
Uji Toksisitas Ekstrak Gabungan dengan Larva Udang A. salina 9 Profil Senyawa Penciri Formula Ekstrak Berpotensi 9 Kadar Senyawa Penciri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 11
SIMPULAN DAN SARAN 11
Simpulan 11
Saran 12
DAFTAR PUSTAKA 12
LAMPIRAN 14
DAFTAR TABEL
1 Kondisi elusi gradien kromatografi cair kinerja tinggi 5
2 Kadar air dan rendemen sampel tanaman 6
3 Nilai inhibisi tertinggi ekstrak tunggal, formulasi ekstrak, dan kaptopril 9
DAFTAR GAMBAR
1 Simplex centroid with axial design 4
2 Nilai inhibisi ekstrak etanol 30% ( ) dan ekstrak air ( ) sampel
tanaman terhadap aktivitas ACE 8
3 Profil KLT standar sinensetin (1), standar asiatikosida (2), formula ekstrak ulangan ke-1 (3) dan formula ekstrak ulangan ke-2 (4) di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm sebelum disemprotkan
Liebermann-Burchard 10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 14
2 Hasil deteminasi sampel tanaman 15
3 Rendemen sampel tanaman 16
4 Uji aktivitas inhibisi ekstrak tunggal terhadap aktivitas Angiotensin
Converting Enzyme 17
5 Data uji inhibisi formulasi ekstrak terhadap aktivitas ACE secara in
vitro 18
6 Nilai LC50 formula ekstrak berpotensi 19
7 Profil senyawa penciri formula ekstrak berpotensi 19
PENDAHULUAN
Tanaman obat tradisional sejak dahulu telah banyak digunakan masyarakat di Indonesia bahkan di seluruh dunia untuk mengobati berbagai jenis penyakit termasuk hipertensi. Hipertensi atau tekanan darah tinggi merupakan faktor resiko utama penyakit kardiovaskuler yang merupakan penyebab kematian yang cukup tinggi, yaitu mencapai 6.7% dari populasi kematian pada semua umur di Indonesia. Penyakit ini menjadi perhatian penting karena dapat memicu timbulnya penyakit lain seperti stroke (terjadi pada otak dan berdampak pada kematian yang tinggi), penyakit jantung koroner (terjadi pada kerusakan pembuluh darah jantung), gagal ginjal, penyakit pembuluh lain, serta diabetes melitus (Kemenkes RI 2013).
Pengobatan hipertensi selama ini dilakukan menggunakan obat antihipertensi yang dapat memengaruhi sistem pengaturan tekanan darah. Secara umum, obat antihipertensi bekerja dengan cara diuretik, beta blocker yang bekerja dengan cara menghalangi reseptor pada otot pembuluh darah yang menyebabkan pembuluh darah melebar sehingga tekanan darah menurun, blocker kanal kalsium, blocker reseptor angiotensin II, dan penghambat Angiotensin Converting Enzyme (ACE) (Palmer dan Williams 2007). Obat antihipertensi yang bekerja dengan cara penghambat ACE merupakan jenis obat yang banyak digunakan saat ini (RISTEK RI 2012). Menurut Rohman et al. (2011) yang telah melakukan penelitian terhadap 1688 dokter, baik dokter spesialis maupun dokter umum, menunjukkan sebanyak 68.63−78.11% dokter berpendapat bahwa obat antihipertensi harus diberikan seumur hidup pada penderita hipertensi. Namun, obat tersebut memiliki beberapa efek negatif yang tidak diinginkan, seperti pusing, mulut kering hingga depresi. Hal ini menyebabkan banyak orang mulai beralih mengkonsumsi obat herbal dari tanaman obat, seperti pegagan, sambiloto, tempuyung, dan kumis kucing (Permadi 2011).
2
ekstrak pegagan, androglafolid yang merupakan senyawa penciri ekstrak sambiloto, dan luteolin yang merupakan senyawa penciri ekstrak tempuyung (Kemenkes RI 2009). Salah satu metode yang dapat digunakan untuk melihat profil senyawa suatu campuran ekstrak ialah kromatografi lapis tipis (KLT). Metode KLT sering digunakan karena mudah digunakan pada penapisan awal, sederhana, persiapan sampel yang mudah, dan tidak membutuhkan waktu yang lama (Istiqomah 2010).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas inhibisi ekstrak tunggal etanol 30% dan ekstrak tunggal air tanaman pegagan, kumis kucing, tempuyung, sambiloto, dan formulasi ekstrak berpotensi terhadap aktivitas ACE serta menentukan profil senyawa penciri pada formula berpotensi.
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain simplisia daun sambiloto, daun kumis kucing, herba pegagan, dan herba tempuyung, etanol 30%, NaOH 10%, HCl 6 N, air laut, telur udang Artemia salina, hipuril-L-histidil-L-leusina, NaCl, buffer HEPES, Angiotensin Converting Enzyme, kaptopril, etil asetat, butanol, H2SO4, metanol, asam asetat, standar asiatikosida, standar sinensetin.
Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis (Hitachi, Jepang), oven, ependorf, pipet mikro, sentrifugasi,pelat silika gel GF254, lampu ultraviolet,
camag linomat, kromatografi cair kinerja tinggi (Shimadzhu, Jepang).
Metode
Metode penelitian yang dilakukan meliputi beberapa tahapan (Lampiran 1). Tahapan tersebut ialah penyiapan sampel, penentuan kadar air simplisia, ekstraksi menggunakan etanol 30% dan air, uji inhibisi ekstrak terhadap aktivitas ACE, formulasi ekstrak dan uji inhibisi formula terhadap ACE, uji toksisitas formula, penentuan profil senyawa penciri formula dengan menggunakan KLT, dan penentuan kadar senyawa penciri formula.
Preparasi Sampel
Sampel daun yang sudah kering dijadikan serbuk dengan ukuran 60 mesh. Sampel yang telah dijadikan serbuk tersebut disimpan untuk ditentukan kadar airnya. Tanaman yang digunakan juga dideterminasi terlebih dahulu.
Kadar Air (AOAC 2006)
3 2 gram sampel ditimbang di dalam wadah yang telah diketahui bobotnya. Wadah berisi sampel dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 ⁰C selama 3 jam kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang bobotnya. Proses pengeringan dilakukan hingga bobot konstan. Rumus kadar air sebagai berikut:
adar air % 100%
Keterangan:
A = Bobot contoh sebelum dikeringkan (g) B = Bobot contoh setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Sampel
Serbuk kering simplisia daun kumis kucing, daun sambiloto, herba pegagan, dan herba tempuyung masing-masing ditimbang sebanyak 100 gram kemudian dimaserasi dengan 2 pelarut, yaitu etanol 30% dan air selama 24 jam pada suhu ruang lalu disaring. Nisbah simplisia dan pelarut sebesar 1:5 (b/v). Ampas tanaman direndam kembali dengan pelarut semula dan diulangi langkah yang sama hingga perendaman dilakukan 3 kali ulangan. Setelah itu, setiap filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar dengan suhu 30 °C sehingga diperoleh 8 jenis ekstrak pekat kemudian disimpan pada suhu -20 °C sampai dilakukan analisis.
Uji Inhibisi Ekstrak terhadap Aktivitas ACE secara In Vitro (Chusman dan Cheung 1971)
Aktivitas inhibisi ACE dilakukan dengan metode Chusman dan Cheung (1971) dengan sedikit modifikasi pada komposisi substrat. Sebanyak 50 µL larutan sampel ekstrak dengan konsentrasi 100 ppm ditambah 50 µL larutan ACE (25 mU/mL) kemudian di prainkubasi selama 10 menit pada suhu 32 °C. Setelah itu, campuran diinkubasi kembali dengan 50 µL substrat (Hip-His-Leu 8 mM dalam bufer HEPES 50 mM yang berisi 300 mM NaCl pada pH 8.3) selama 30 menit pada suhu 32 °C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 200 µL HCl 1 M. Kemudian larutan diekstraksi dengan menambahkan larutan etil asetat sebanyak 1.5 mL dan disentrifugasi (4000×g) selama 15 menit. Selanjutnya supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL lalu diuapkan pada suhu kamar selama 2 jam dalam vakum atau pengering oven. Setelah kering, hasilnya dilarutkan dengan 3 mL air destilata dan diukur absorbansnya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 228 nm.
Formulasi Ekstrak dengan Mixture Design
4
Gambar 1 Simplex centroid with axial design
Uji Toksisitas Formula Berpotensi terhadap Larva Udang Artemia salina
(Meyer et al. 1982)
Telur udang Artemia salina ditetaskan dalam gelas piala yang berisi air laut yang telah disaring kemudian diaerasi. Telur udang dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Sebanyak 0.02 gram formula ekstrak berpotensi pekat ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL air laut untuk membuat larutan ekstrak dengan konsentrasi 2000 ppm. Ekstrak yang sukar larut dapat dibantu dengan penambahan Tween-80. Sebanyak 10 ekor larva udang dan 1000 µL air laut dimasukkan ke dalam vial uji hingga konsentrasi akhir menjadi 1800, 1600, 1400, 1200, 1000 ppm. Kontrol dilakukan tanpa penambahan formula berpotensi. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati dari total larva yang dimasukkan ke dalam vial.
Analisis Senyawa Penciri dengan Kromatografi Lapis Tipis (Reniza 2003)
Sebanyak 30 μL ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi diaplikasikan pada pelat KLT. Fase diam yang digunakan ialah silika gel GF254. Selanjutnya, pelat
KLT diangin-anginkan agar sisa pelarut hilang. Setalah kering, pelat dimasukkan ke dalam bejana pengembang yang berisi fase gerak terpilih, yaitu butanol:asam asetat:air (5:1:4) yang telah dijenuhkan minimal selama 15 menit. Setelah daya kapiler dari ekstrak telah maksimal, pelat dikeringkan kemudian dilihat di bawah lampu ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Setelah itu, noda dideteksi kembali dengan menyemprotkan pereaksi Lieberman Buchard untuk mendeteksi senyawa golongan triterpenoid. Selanjutnya Rf dari spot yang dihasilkan dibandingkan dengan pembanding senyawa penciri.
Penentuan Kadar Senyawa Penciri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Penentuan kadar senyawa penciri sinensetin pada sampel tanaman kumis kucing dilakukan berdasarkan metode dari Akowuah et al. (2004). Pengukuran dilakukan dengan melarutkan 1 gram formula ekstrak ke dalam 10 ml MeOH:H2O
5 elusi isokratik dengan fase gerak metanol:air:tetrahidrofuran (45:50:5) (v/v) dengan laju alir 1 mL/menit. Air yang digunakan sebagai fase gerak terlebih dahulu ditambahkan asam fosfat agar pH air menjadi 3. Detektor yang digunakan adalah detektor ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 340 nm dan volume injeksi adalah 20 μl.
Penentuan kadar senyawa penciri Asiatikosida pada sampel tanaman pegagan dilakukan berdasarkan metode dari Rafamantanana et al. (2009). Formula dilarutkan dalam 10 mL metanol kemudian disaring dengan membran 0.45 μm lalu diinjeksikan ke KCKT. Sistem yang digunakan untuk menentukan kadar asiatikosida yaitu menggunakan kolom C18 (4.6 mm×150 mm; ukuran
partikel 5 μm) (X-BridgeTM, Irlandia), elusi gradien asetonitril dan air. Detektor yang digunakan UV pada panjang gelombang 206 nm dan laju alir 1 mL/menit.
Tabel 1 Kondisi elusi gradien kromatografi cair kinerja tinggi Waktu (menit) Komposisi fase gerak
Air (%) Asetonitril (%)
Kadar Air dan Ekstraksi Sampel
Sampel simplisia daun sambiloto, daun kumis kucing, herba pegagan, dan herba tempuyung didapatkan dari kebun Biofarmaka, Cikabayan, Bogor. Sebelum dilakukan pengujian, tanaman-tanaman tersebut diidentifikasi terlebih dahulu di Laboratorium Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Identifikasi ini bertujuan mengetahui kebenaran sampel yang digunakan dengan cara menentukan jenis dan suku dari sampel tanaman yang digunakan. Hasil identifikasi sampel tanaman menunjukkan bahwa sampel yang digunakan memang benar tanaman sambiloto, pegagan, kumis kucing, dan tempuyung (Lampiran 2). Sampel daun dan herba yang sudah kering kemudian dijadikan serbuk. Serbuk yang digunakan ialah serbuk yang lolos dari penyaringan 60 mesh. Hal ini bertujuan memperluas permukaan sampel sehingga interaksi antara pelarut dan bahan yang diekstraksi menjadi efektif pada tahap ekstraksi sehingga memudahkan kelarutan komponen bioaktif dan meningkatkan rendemen ekstraksi.
6
penyimpanan. Suatu bahan dapat disimpan dalam jangka waktu lama dan relatif stabil dari serangan mikroba jika nilai kadar airnya kurang dari 10% (Herawati et al. 2012). Selain itu, nilai kadar air yang kurang dari 10% merupakan syarat suatu bahan dapat dijadikan sebagai bahan baku pembuatan jamu (BPOM 2014). Berdasarkan pengujian yang dilakukan diketahui bahwa simplisia daun sambiloto, daun kumis kucing, herba pegagan, dan herba tempuyung masing-masing memiliki nilai kadar air di atas 10% (Tabel 1). Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel serbuk daun tanaman sambiloto, pegagan, kumis kucing, dan tempuyung kurang baik disimpan dalam jangka waktu yang lama dan rentan terhadap serangan mikroba. Selain itu, penentuan kadar air juga dapat digunakan untuk mengoreksi rendemen hasil ekstraksi sampel.
Simplisia daun sambiloto, daun kumis kucing, herba pegagan, dan herba tempuyung selanjutnya diekstrasi dengan cara maserasi. Pemilihan teknik ekstraksi dengan cara maserasi dilakukan untuk menghindari rusaknya komponen kimia pada simplisia akibat panas. Pelarut yang digunakan ialah etanol 30% dan air. Penggunaan etanol dan air sebagai pelarut dikarenakan air selalu digunakan oleh masyarakat sebagai pelarut dengan cara menyeduh dan merebus tanaman obat, sedangkan etanol merupakan pelarut yang diperbolehkan untuk aplikasi farmasi karena pada umumnya obat-obatan fitofarmaka diekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol.
Maserasi dilakukan sebanyak 3 kali (masing-masing 24 jam) agar komponen kimia pada simplisia banyak yang terekstrak oleh pelarut sehingga pelarut sudah tidak efektif mengekstraksi komponen kimia dalam jumlah yang berarti. Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa rendemen ekstrak etanol 30% simplisia sambiloto, pegagan, dan kumis kucing lebih tinggi dibandingkan rendemen ekstrak air kecuali pada simplisia tempuyung. Hal ini dikarenakan etanol mampu menarik komponen kimia yang memiliki kepolaran berbeda karena etanol memiliki gugus hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar sehingga mampu melarutkan zat, baik yang bersifat polar dan semi polar. (Harborne 1987). Perhitungan data rendemen dapat dilihat pada Lampiran 3.
Tabel 2 Kadar air dan rendemen sampel tanaman Sampel tanaman Kadar air (%),
n=3
Uji Inhibisi Ekstrak Tunggal terhadap Aktivitas ACE secara In Vitro
7 yang dapat menyebabkan penyempitan pembuluh darah dan meretensi natrium di dalam tubuh sehingga volume cairan darah dalam tubuh meningkat. Akibatnya kerja jantung menjadi lebih berat dalam memompa darah. Hal inilah yang dapat mengakibatkan hipertensi (Jang et al. 2011). Oleh karena itu, penghambatan aktivitas ACE mampu menurunkan pembentukan angiotensin II sehingga dapat mencegah terjadinya hipertensi.
Pengujian daya inhibisi ekstrak dilakukan pada konsentrasi ekstrak 100 ppm. Pemilihan konsentrasi 100 ppm ini berdasarkan pada penelitian Yulinda (2011) yang menunjukkan bahwa daya inhibisi ekstrak etanol 30% sambiloto dan pegagan masih menunjukkan peningkatan hingga konsentrasi ekstrak 100 ppm. Akan tetapi, ekstrak dengan konsentrasi di atas 100 ppm membuat ACE menjadi tidak stabil sehingga dapat berpengaruh pada hasil yang diperoleh.
Pengujian dilakukan dengan melarutkan sampel ekstrak ke dalam buffer HEPES pH 8.3 hingga konsentrasinya menjadi 100 ppm. Ekstrak tersebut kemudian dicampurkan dengan ACE serta substrat Hipuril-Histidil-Leusin (Hip-His-Leu) lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 32°C. Setelah itu, reaksi dihentikan dengan menambahkan HCl. Enzim ACE bekerja dengan cara mengubah substrat Hip-His-Leu (sebagai pengganti angiotensin I) menjadi asam hipurat. Asam hipurat yang dihasilkan dari aktivitas enzim ACE kemudian diekstrak dengan menggunakan etil asetat dan selanjutnya diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 228 nm. Data yang dihasilkan berupa absorbans. Daya inhibisinya ditentukan dengan membandingkan absorbans kontrol (tanpa penambahan ekstrak) dengan absorbans sampel. Semakin kecil absorbans yang didapatkan, semakin besar daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas ACE.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa semua ekstrak memiliki daya inhibisi terhadap aktivitas ACE. Tiga ekstrak yang memiliki nilai inhibisi tertinggi secara berturut-urut, yaitu ekstrak air kumis kucing, ekstrak etanol 30% pegagan, dan ekstrak etanol 30% kumis kucing (Gambar 2). Data lengkap dan perhitungan nilai inhibisi disajikan pada Lampiran 4. Kumis kucing memang telah diketahui memiliki daya inhibisi yang tinggi terhadap aktivitas ACE, yaitu 76.98% pada konsentrasi 50 ppm (Pradono et al. 2010). Pegagan juga telah diketahui memiliki kemampuan dalam mencegah terjadinya hipertensi melalui penghambatan aktivitas ACE. Hal ini dibuktikan oleh Hansen et al. (1995) yang menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki daya hambat lebih besar dibandingkan tanaman obat lainnya, yaitu sebesar 50%.
8
Gambar 2 Nilai inhibisi ekstrak etanol 30% ( ) dan ekstrak air ( ) sampel tanaman terhadap aktivitas ACE
Formulasi Ekstrak dengan Mixture Design
Tiga ekstrak tunggal dengan daya inhibisi tertinggi, yaitu ekstrak etanol 30% pegagan, ekstrak etanol 30% kumis kucing, dan ekstrak air kumis kucing diformulasi dan diuji daya inhibisinya. Penggabungan ekstrak dilakukan menggunakan mixture design dengan rancangan simplex centroid with axial design. Mixture design digunakan saat suatu sistem merupakan campuran dari beberapa komponen yang jumlah totalnya konstan, yaitu 100%. Bertambahnya jumlah komponen yang digunakan akan menambah jumlah dimensi ruang yang digunakan untuk menggambarkan mixture. Jika hanya 2 komponen yang digunakan, profil campuran komponen akan mengikuti garis lurus. Jika 3 komponen yang digunakan, profil campuran komponen akan berbentuk segitiga. Jika 4 komponen yang digunakan, profil campuran komponen akan berbentuk tetrahedron dan seterusnya (Wahyuni 2010).
9 Tabel 3 Nilai inhibisi ekstrak tunggal, formulasi ekstrak, dan kaptopril
Komposisi Ekstrak (100 ppm) Rerata inhibisi (%)
Tunggal
Etanol 30% pegagan 55.24
Etanol 30% kumis kucing 30.48
Air kumis kucing 15.24
Campuran (1/6:1/6:2/3) 66.67
Kaptopril 67.62
Uji Toksisitas Ekstrak Gabungan dengan Larva Udang A. salina
Uji toksisitas dilakukan menggunakan larva udang Artemia salina. Larva udang A. salina sangat sensitif dan mudah mati apabila terdapat senyawa yang bersifat toksik. Membran kulitnya yang sangat tipis memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang mempengaruhi metabolisme tubuhnya. Uji ini sering digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui aktivitas farmakologi dari suatu ekstrak karena praktis, biayanya murah, cepat pelaksanaannya, dan tidak memerlukan perlakuan yang khusus. Prinsipnya ialah senyawa bioaktif bersifat toksik jika diberikan pada dosis yang tinggi dan menjadi obat jika diberikan pada dosis yang rendah. Tujuan dilakukannya uji ini yaitu untuk mengetahui apakah formula ekstrak bersifat toksis atau tidak. Toksis atau tidaknya suatu sampel dapat dilihat dari nilai LC50. Nilai LC50 menunjukkan konsentrasi
yang dapat menyebabkan 50% kematian larva A. salina dalam suatu populasi. Suatu ekstrak dapat dikatakan toksis jika nilai LC50 lebih kecil dari 1000 ppm
(Meyer et al. 1982).
Pengujian awal toksisitas formula ekstrak menggunakan larva A. salina dilakukan pada konsentrasi 25–1000 ppm. Setelah 24 jam, terlihat bahwa tidak ada larva udang yang mati hingga konsentrasi 1000 ppm. Selanjutnya pengujian dilakukan pada konsentrasi 1000–5000 ppm. Hasilnya diketahui bahwa 100% kematian larva udang terjadi pada konsentrasi 2000–5000 ppm. Pengujian dilakukan kembali pada konsentrasi 1000–2000 ppm dan hasilnya memperlihatkan bahwa seiring meningkatnya konsentrasi jumlah larva udang yang mati juga semakin meningkat. Nilai LC50 didapatkan dengan
menghubungkan persen kematian larva udang dengan log konsentrasi ekstrak. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa formula ekstrak bersifat tidak toksik dan didapatkan nilai LC50 formula ekstrak sebesar 1465.9451 ppm (Lampiran 6).
Profil Senyawa Penciri Formula Ekstrak Berpotensi
10
dan 366 nm lalu dihitung jumlah spot yang terdeteksi. Eluen yang terpilih ialah eluen yang memiliki spot terbanyak dengan jarak keterpisahan yang baik. Berdasarkan hasil pengujian diketahui bahwa butanol:asam asetat:air (5:1:4) v/v merupakan eluen yang menghasilkan jumlah spot terbanyak dengan pemisahan yang cukup baik (Lampiran 7).
Pengujian dilanjutkan dengan melarutkan formula ekstrak ke dalam metanol lalu ditotolkan pada pelat KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase
gerak butanol:asam asetat:air (5:1:4) v/v. Identifikasi senyawa penciri formula ekstrak dilakukan dengan menggunakan standar asiatikosida yang merupakan senyawa penciri ekstrak pegagan dan standar sinensetin yang merupakan senyawa penciri ekstrak kumis kucing. Hasil analisis KLT menunjukkan adanya spot senyawa sinensetin pada formula ekstrak dengan nilai Rf 0.85. Nilai Rf ini sama dengan spot standar sinensetin setelah dideteksi di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm (Gambar 3). Menurut Harborne (1987), spot senyawa asiatikosida dapat dilihat menggunakan sinar UV 366 nm setelah disemprot dengan pereaksi Liebermann-Burchard dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 °C selama 10 menit. Akan tetapi, noda keunguan yang mengindikasinya adanya senyawa asiatikosida tetap tidak terdeteksi pada formula ekstrak setelah disemprotkan pereaksi Lieberman-Burchard, baik dilihat pada sinar UV 366 nm maupun cahaya tampak (Lampiran 7).
Gambar 3 Profil KLT standar sinensetin (1), standar asiatikosida (2), formula ekstrak ulangan ke-1 (3) dan formula ekstrak ulangan ke-2 (4) di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm sebelum disemprotkan Liebermann-Burchard
11 ekstrak kasar yang mengandung banyak senyawa metabolit sekunder lainnya. Selain itu, kadar senyawa asiatikosida pada pegagan yang kecil dan kurang dari limit deteksi diduga juga bisa menjadi salah satu faktor tidak munculnya spot senyawa asiatikosida. Tidak adanya spot senyawa asiatikosida pada formula sampel tidak berati senyawa tersebut tidak ada. Hal ini diduga karena sedikitnya komposisi ekstrak pegagan yang hanya 1/6 bagian dari formulasi ekstrak.
Kadar Senyawa Penciri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kadar senyawa asiatikosida dan sinensetin dapat ditentukan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pengujian dilakukan dengan metode adisi standar. Sejumlah tertentu larutan standar ditambahkan ke dalam larutan sampel dengan konsentrasi tertentu. Metode ini digunakan untuk menganalisis zat pada konsenstrasi rendah dan meminimalkan kesalahan yang disebabkan karena adanya matriks pada sampel. Senyawa asiatikosida dan sinensetin diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi antara standar dan sampel. Hasil kromatogram menunjukkan waktu retensi senyawa asiatikosida dan sinensetin pada formulasi ekstrak berturut-turut berada pada 14.399 menit dan 7.157 menit. Waktu retensi ini tidak berbeda jauh dengan waktu retensi larutan standar senyawa asiatikosida dan sinensetin yang berada pada 14.356 menit dan 7.127 menit. Kadar senyawa penciri tersebut kemudian dihitung dengan membandingkan luas area puncak senyawa tersebut dengan luas area puncak senyawa standar. Hasilnya menunjukkan bahwa kadar senyawa asiatikosida dan kadar senyawa sinensetin pada formulasi ekstrak berturut-turut sebesar 0.07% (b/b) dan 0.01% (b/b) (Lampiran 8).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
12
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui senyawa spesifik apa yang berperan sebagai inhibitor terhadap aktivitas ACE.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official Methods of AOAC International Edisi ke-14. Arlington (US): Association of Official Analytical Chemist.
Akowuah GA, Zhari I, Norhayati I, Sadikun A, Khamsah SM. 2004. Sinensetin, eupatorin, 30-hydroxy-5, 6, 7, 40-tetramethoxyflavone and rosmarinic acid contents and antioxidative effect of Orthosiphon stamineus from Malaysia. Food Chem. 87:559–566.
[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2014. Persyaratan Mutu Obat Tradisional. Jakarta (ID): BPOM RI
Chusman DW, Cheung HW. 1971. Spectrophotometric assay and properties of angiotensin converting enzyme of the rabbit lung. Biochem Pharmacol. 20:1637-1648.
Guyton AC, Hall JE. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Jakarta (ID): Penerbit EGC.
Hansen K, Nyman U, Smitt UW, Adsersen A, Gudiksen L, Rajasekharan S, Pushpangadan P. 1995. In vitro screening of traditional medecine for anti-hypertensive effect based in inhibition of the angiotensin converting enzyme (ACE). J Ethnopharmacol. 48:43−51.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung (ID): Penerbit ITB.
Herawati D, Nuraida L, Sumarto. 2012. Cara Produksi Simplisia yang Baik. Bogor (ID): IPB Pr.
Istiqomah IF. 2010. Pengoptimuman fase gerak KLT dengan rancangan campuran untuk analisis sidik jari temulawak [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Jang JH, Joeng SC, Kim JH, Lee YH, Ju YC, Lee JS. 2011. Characterisation of a new antihypertensive angiotensin 1-converting enzyme inhibitory peptide from Pleurotus cornucopiae. Food Chem. 127:412−418.
[Kemenkes RI] Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2009. Farmakope Herbal Indonesia Edisi Pertama. Jakarta (ID). Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.
13 Meyer BN, ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. 1982. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Plan Med. 45:31−34.
Palmer A, Williams B. 2007. Simple Guide Tekanan Darah Tinggi. Yasmin E, penerjemah; Astikawati R, Savitri A, editor. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Simple Guide Blood Pressure.
Permadi A. 2011. Ramuan Herbal Penumpas Hipertensi. Jakarta (ID): Pustaka Bunda.
Pradono DI, Trisilawati O, Raminiwati M, Susanto S. 2010. Formula antihipertensi (>60% captopril) dari bahan aktif flavonoid pegagan, tempuyung, kumis kucing, dan sambiloto serta budidaya untuk meningkatkan kandungan flavonoid (>1,5%) [catatan penelitian]. KKP3T. 53–55.
Prapanza I, Marianto L. 2003. Khasiat dan Manfaat Sambiloto. Jakarta (ID): AgroMedia.
Rafamantanana MH, Rozet E, Raoelison GE,Cheuk K, Ratsimamanga SU, Hubert P, Leclercq JQ. 2009. An improved hplc-uv method for the simultaneous quantification of triterpenic glycosides and aglycones in leaves of Centella asiatica (L.) Urb (apiaceae). J Chromatogr B. 877: 2396–2402.
Reniza AW. 2003. Isolasi dan identifikasi senyawa asiatikosida dari pegagan (Centella asiatica L.Urban) sebagai senyawa antibakteri [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
[RISTEK RI] Kementerian Riset dan Teknologi Republik Indonesia. 2012. Preparasi dan karakterisasi antihipertensi dari daun mangga kasturi (Mangifera casturi) berbasis aktivitasnya sebagai free radical scavenger (FRS) dan inhibitor angiotensin I converting enzyme (ACE) . [diunduh 2014 Januari 31]. Tersedia pada: http://insentif.ristek.go.id/new_insinas/detail_ penelitian.php?&id=79&id_form=FORM__c8aefca3ae0982e1bd3b9362293 c593429ba1703
Rohman MS, Hersunarti N, Soenarta AA, Suhardjono, Mayza A, Lukito AA, Kosasih A. 2011. Pemahaman dokter indonesia mengenai hipertensi dan permasalahan yang dihadapi pada praktik sehari-hari. Maj Kedokt Indones. 61 2 :51−57.
Suryana WN. 2010. Optimasi ekstraksi sinensetin dari kumis kucing [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Wahyuni WT. 2010. Pengoptimuman dan validasi sidik jari kromatografi cair kinerja tinggi ekstrak Phyllanthus niruri L [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
Ekstraksi dengan etanol 30% dan air
Kromatogram profil senyawa penciri Lampiran1 Diagram alir penelitian
Formulasi 3 ekstrak tunggal dengan nilai inhibisi tertinggi Simplisia kumis kucing,
pegagan, sambiloto, tempuyung
8 ekstrak pekat
Nilai inhibisi formulasi ekstrak
Nilai inhibisi ekstrak
Penentuan kadar senyawa penciri dengan KCKT
Uji Toksisitas terhadap larva udang
A. salina Penentuan
kadar air
Formula ekstrak dengan nilai inhibisi tertinggi
Nilai LC50
Analisis profil senyawa penciri dengan KLT
Kadar senyawa penciri pada formula ekstrak berpotensi Nilai kadar air
16
Lampiran 3 Rendemen sampel tanaman Ekstrak etanol 30%
Sampel Ulangan Bobot
sampel (g)
Sampel Ulangan Bobot
17 Lampiran 4 Uji aktivitas inhibisi ekstrak tunggal terhadap aktivitas angiotensin
converting enzyme
18
19 Lampiran 6 Nilai LC50 formula ekstrak berpotensi
Ulangan Persamaan regresi Nilai R2
Nilai LC50
(ppm)
Rerata LC50
(ppm)
1 y 343.07x − 1036.2 0.9578 1465.9451
1479.7698 2 y = 345.33x − 1041.3 0.9552 1445.9912
3 y = 297.48x − 897.16 0.9679 1527.3731 Contoh perhitungan :
y 343.07x − 1036.2
dengan y = persen kematian dan x = log konsentrasi ekstrak maka :
y = 343.07x − 1036.2 50 = 343.07x − 1036.2 1086.2 = 343.07x
x = 3.1661
log-1 = 1465.9451 ppm
sehingga didapat nilai LC50 gabungan ekstrak sebesar 1465.9451 ppm
Lampiran 7 Profil senyawa penciri formula ekstrak berpotensi
(a) Hasil elusi fase gerak asam asetat:metanol (9:1) v/v (a), kloroform:etil asetat (6:4) v/v (b), butanol:asam asetat:air (5:1:4) v/v (c), kloroform:metanol:air (13:5:0.8) v/v (d)
20
Lanjutan lampiran 7
(c) Profil KLT standar sinensetin (1), standar asiatikosida (2), formula ekstrak ulangan ke-1 (3), dan formula ekstrak ulangan ke-2 (4) di bawah sinar UV 254 nm setelah disemprot Liebermann-Burchard
(d) Profil KLT standar sinensetin (1), standar asiatikosida (2), formula ekstrak ulangan ke-1 (3), dan formula ekstrak ulangan ke-2 (4) di bawah sinar UV 366 nm setelah disemprot Liebermann-Burchard (b) Profil KLT standar sinensetin (1), standar asiatikosida (2), formula
21 Lanjutan lampiran 7
(e) Profil KLT standar asiatikosida (1) dan ekstrak etanol 30% pegagan (2) di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm sebelum disemprot Liebermann-Burchard
1 2 1 2
1 2 1 2 1 2
22
Lanjutan lampiran 7
Lampiran 8 Kromatogram asiatikosida dan sinensetin
q
(a) Kromatogram standar asiatikosida 100 mg/L (1) dan formulasi ekstrak dengan penambahan standar 100 mg/L (2)
1
2
1 2 3 1 2 3
23 Lanjutan lampiran 8
Larutan stok yang mengandung 0.29 gram formulasi ekstrak dalam 10 mL dibuat, kemudian 1 mL larutan stok dipipet dan diencerkan ke dalam labu takar 5 mL.
onsentrasi analat onsentrasi standar
Luas area sampel Luas area standar
a Luas area Luas area standar s
a Luas area sampel dengan penambahan standar Luas area standar Luas area standar s
a 4800936 45037684503768 12.5 mg L = 0.8248 mg L 5 4.1239 mg L
adar sinensetin
4.1239 mg
1000 mL 10 mL
290 mg 100% 0.01% b b
q q
q
(b) Kromatogram standar sinensetin 12.5 mg/L (1) dan formulasi ekstrak dengan penambahan standar 12.5 mg/L (2)
1
24
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Juli 1991 dari pasangan Drs Samsudin dan Dra Harsiti Saptaningsih. Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari Sekolah Menengah Atas Negeri 12 Jakarta dan melanjutkan studi di Departemen Kimia, FMIPA IPB melalui jalur SNMPTN tahun 2010.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Asas Kimia Analitik pada tahun ajaran 2014/2015 dan menjadi asisten praktikum Kimia Analitik Layanan tahun 2013/2014. Selain itu, penulis juga pernah melaksanakan praktik lapangan di Balai Besar Teknik Kesehatan Lingkungan dan Pengendalian Penyakit Jakarta (BBTKL PP) dan menulis laporan praktik lapang
dengan judul “Verifikasi Metode Fosfat dari ir Limbah Menggunakan
