Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas (Plucea indica L.)

KAJIAN AKTlVlTAS ANTlMlKROBA EKSTRAK

DAUN BELllNTAS

(Plucea indica

L.)

OLEH

ARDIANSYAH

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

ARDIANSYAH. Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas (Plucea indica L.). Dibimbing oleh LlLlS NURAIDA dan NURl ANDARWULAN.

Secara tradisional daun beluntas digunakan oleh masyarakat Aceh dan Madura sebagai obat untuk menghilangkan bau badan, obat turun panas, obat batuk, dan obat antidiare. Daun beluntas sering dikonsumsi oleh masyarakat sebagai lalapan.

Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi senyawa antimikroba dari daun beluntas menggunakan metode soxhlet dan refluk, pengujian aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap bakteri patogen, perusak, dan kapang, dan penentuan nilai MIC. Untuk menduga mekanisme aktivitas penghambatan dilakukan pengujian terhadap spora, sferoplas, dan protoplas. Pada tahap akhir dilakukan pengujian aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas dengan pengaruh garam, gula, nilai pH, dan pemanasan. Bakteri yang digunakan dalam pengujian aktivitas antimikroba adalah Bacillus subtilis, B. cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, dan P. fluorescs!ns, sedangkan kapang yang digunakan adalah Mucor rouxii, Penicillium sp., dan Aspegillus flavus.

SURAT PERNYATAAN

-

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :

KAJIAN AKTlVlTAS ANTIMIKROBA EKSTRAK DAUN BELUNTAS

(Plucea indica L.)

Adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informa!ji yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor, Agustus 2002

KAJIAN AKTlVlTAS ANTlMlKROBA EKSTRAK

DAUN BELUNTAS

(Plucea indica

L.)

ARDIANSYAH

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi llmu Pangan

PROGRAM PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Tesis : Kajian Aktivitas rilntimikroba Ekstrak Daun Beluntas (Plucea indica L.)

Nama : Ardiansyah

NRP : 99223

Program Studi : llmu Pangan

Menyetujui,

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc

Ketua Dr. Ir. ~ u h ~ n d a w u l a n , _{l ~ n g g o t a} MS

2. Ketua Program Studi llmu Pangan

d[&&-,

L

/

Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie. MS

Penulis dilahirkan di Sambas (Kalbar) pada tanggal 18 Oktober 1975 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah Michwan dan ibu Nurjanah.

Pendidikan Sekolah Dasar (SD) sampai Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di Sambas. Tahun 1993 penulis lulus dari SMAN Sambas dan masuk pada Program Diploma I1 Supervisor Jaminan Mutu Pangan (SJMP) FATETA IPB dan lulus tahun 1995. Pada tahun yang sama melanjutkan ke Program S1 pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi (TPG) Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Djuanda Bogor, lulus tahun 1998. Selama pendidikan Diploma, S1, dan S2 penulis aktif pada kegiatan kemahasiswaan, diantaranya Wakil Ketua Panitia Penerimaan Mahasiswa Program Diploma FATETA tahun 199411995 ; menjadi Staf Pengurus Senat Mahasiswa Fakultas Tel<nologi Pertanian Universitas Djuanda tahun 199511996 ; menjadi Ketua Himpunan Mahasiswa Teknologi Pangan dan Gizi tahun 199611997. dan menjadi Staf Pengurus Forum Mahasiswa llmu Pangan (FORMASIP) tahun 2000-2002. Setelah menyelesaikan S1 penulis bekerja pada Perusahaan AMDK di Jakarta samlpai tahun 1999.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panljatkan kehadirat Alloh SWT atas segala karunia dan berkah-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanake~n mulai bulan Mei 2001 sampai Maret 2002 ini di Pusat Studi Pangan dan Gizi (PSPG) IPB dan Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi (TPG) FATETA IPB adalah Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas (Plucea indica L.).

Penelitian ini merupakan salah satu penelitian lanjutan Sifat Antimikroba Beberapa Tanaman lndigenus Terhadap Bakteri Patogen dan Pembusuk serta Kapang, dimana sebagian dana penelitian penulis dapatkan dari Pusat Kajian Makanan Tradisional (PKMT) IPB t3ogor.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan ucapan terima kasih kepada Ibu Dr. Lilis Nuraida, selaku Ketua Komisi pembimbing yang telah membimbing dan mengarahkan penulis dalam memberikan ide-ide sejak penulisan proposal, dan atas kesabaran serta pengertian yang diberikan kepada penulis selama menjalani pendidikan S2 di IPN. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Nuri Andawulan selaku Anggota Komisii atas masukan, koreksi, dan ide-ide yang sangat berguna sekali buat penulis dalarrl menyelesaikan Tesis ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ratih Dewanti-Hariyadi atas kesedian sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan masukannya. Ucapan terimakasih yang tulus kepada Dr. Anton Apriyantono atas bimbingan, saran, fasilitas literatur yang diberikan kepada penulis selama~ pendidikan S2. Ucapan terima kasih penulis sampaikan yang tak terhingga darl mendalam kepada kedua orang tua yang telah membiayai pendidikan selama S2, serta atas doa, dan kasih sayang yang diberikan selama ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Program BPPS DlKTl atas beasiswa on going tahun ajaran 2001/2002. Kepada rekan satu penelitian tentang aktivitas antimikroba Catilr Prabowo Setiawan atas diskusi dan bantuan analisis datanya. Kepada Mbak E\ri, Kang Topik, Pak Sobirin, dan Pak Mul serta semua petugas lab PSPG dan TF'G IPB yang telah banyak membantu. Teman- teman kuliah IPN khususnya kepada Mbak Netty, Mbak Evan, Uni Evi, Fatim, Pak Bram, lbu Sul, dan Mbak Nina at:as persahabatan dan kebersamaan selama ini. Rekan-rekan satu lab PSPG (Tim BAL, Tim Antikapang, dan Tim Biofilm) selama peneltian ini berlangsung atas bantuan dan kebersamaannya. Terima kasih kepada Rinrin atas kesabaran, pengertian, dan kasih sayang yang diberikan kepada penulis selama ini. Kepada Adekku Apriyandi Michwan dan Agus Febrian Michwan yang selalu mengingatkan agar secepatnya menyelesaikan tulisan ini. Akhirnya terima kasih yang sangat tulus kepada siapapun yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak langsung d<alam studi dan penelitian penulis.

Semoga Karya llmiah ini berrnanfaat.

Bogor, Agustus 2002

DAFTAR

IS1

Halaman DAFTAR TABEL ...

DAFTAR GAMBAR ...

DAFTAR LAMPIRAN ...

PENDAHULUAN

...

TINJAUAN PUSTAKA

A . Tanaman Beluntas (Plucea iridica L) ...

B . Mekanisme Kerja Penghambatan Senyawa Antimikroba ...

C . Komponen Antimikroba Tanaman ...

D

.

Karakterisitik Bakteri Perusak; dan Bakteri Patogen Makanan

...

E

.

Kapang Perusak dan Patogevn Makanan ...

BAHAN DAN METODE

A . Bahan dan Alat Penelitian ...

B . Metode Penelitian ...

C . Metode Analisis ...

HASlL DAN PEMBAHASAN

A . Aktivitas Antimikroba Ekstrak Non Polar dan Polar ...

B

.

ldentifikasi Golongan Senyawa Aktif Dalam Ekstrak

...

C . Penentuan Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas Terhadap

Sel Vegetatif Bakteri dan Kapang

...

D

.

Nilai MIC

...

E . Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas Terhadap Spora

...

F

.

Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas Terhadap Sferoplas

Dan Protoplas ...

.

.

...

G . Pengaruh Perlakuan Garam (NaCI) Terhadap Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas ...

H . Pengaruh Perlakuan Gula Terhadap Aktivitas Antimikroba Ekstrak

Daun Beluntas ...

.

.

.

.

...

I

.

Pengaruh Perlakuan pH Terhadap Aktivitas Antimikroba Ekstrak

Daun Beluntas ...

J . Pengaruh Perlakuan Suhu dan Lama Pemanasan Terhadap

...

Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas

...

KESIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR TABEL

Halaman 1 . Aktivitas antimikroba ekstrak tanaman ... 9 2 . Jenis-jenis kapang yang sering dijumpai pada komoditas pangan ...

18

3 . Hasil analisis kualitatif ekstrak claun beluntas ... 34

4

.

Kelompok utama fenolik pada tanaman

...

36 5

.

Nilai

MIC

ekstrak daun beluntas, daun salam. dan biji picung ... 43 6 . Nilai a, larutan garam berbagai konsentrasi ... 53

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1

.

Tanaman beluntas (Plucea indrca L.)

...

4 2 . Struktur dinding dan membran sel bakteri ... 7 3 . Komponen fenolik yang terdapat pada jaringan tanaman ... 11 4

.

Aktivitas antimikroba ekstrak polar daun beluntas terhadap sel vegetatif

..

34 5

.

Beberapa senyawa antimikroba dari tanaman M

.

scaber ... 37 6

.

Struktur kimia tanin ... 37 7

.

Struktur dasar alkaloid karbazoll

...

38 8 . Struktur dasar steroid

...

40 9

.

Aktivitas ekstrak polar non defatted daun beluntas terhadap sel vegetatif

dan kapang ... 41 10 . Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap spora dan

...

sel vegetatif 44

1 I . Struktur spora

...

46

12 . Aktivitas antimikroba ekstrak ds~un beluntas terhadap sferoplas dan

protoplas ... 47 13 . Mekanisme penghambatan bakteri oleh beberapa senyawa antimikroba .. 48 14

.

Pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas

...

51 15

.

Pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas ...

55

16 . Pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas

...

58 17 . Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas antimikroba ekstrak

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

...

1. Kurva pertumbuhan bakteri 73

2. Rekapitulasi data aktivitas antirnikroba ekstrak daun beluntas

non defatted ... 73

....

3. Rekapitulasi data aktivitas antirnikroba ekstrak daun beluntas defatted 73

...

4. Rekapitulasi data aktivitas antirnikroba ekstrak non defatted 74

5. Rekapitulasi data aktivitas antirnikroba ekstrak daun beluntas

non defatted terhadap kapang ... 74 6. Rekapitulasi data aktivitas antinnikroba ekstrak daun beluntas terhadap

protoplas dan sferoplas

...

74 7. Rekapitulasi data aktivitas antinnikroba ekstrak daun beluntas

terhadap sel utuh

...

74 8. Rekapitulasi data aktivitas antiniikroba ekstrak daun beluntas

...

terhadap spora 75

9. Rekapitulasi data aktivitas antiniikroba ekstrak daun beluntas

terhadap sel vegetatif ... 75 10. Rekapitulasi data aktivitas antiniikroba ekstrak daun beluntas berbagai

...

Konsentrasi untuk penentuan MllC 76

11. Rekapitulasi data pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas ... 77

12. Analisis sidik ragam hasil pengijjian pengaruh garam terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. cereus (sel vegetatif)

...

78 13. Analisis sidik ragam hasil pengi~jian pengaruh garam terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada 6. cereus (spora) ... 78 14. Hasil uji lanjut BNT pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada B. cereus (spora) ... 78 15. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh garam terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun belun1:as pada S. aureus

...

78 16. Hasil uji lanjut BNT pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba

17. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh garam terhadap aktivitas

...

antimikroba ekstrak daun belun~tas pada S. typhi

18. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (set vegetatif) ...

19. Hasil uji lanjut BNT pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada 6. subtilis (set vegetatif)

20. Analisis sidik ragam hasil penglujian pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (spora)

...

21. Hasil uji lanjut BNT pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (spora)

...

22. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun belun,tas pada E. coli ...

23. Hasil uji lanjut BNT pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada E. coli

24. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh garam terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada P. fluorescens ...

25. Rekapitulasi data pengaruh gulia terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas

26. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas

...

antimikroba ekstrak daun belun1:as pada B. cereus (sel vegetatif)

27. Hasil uji lanjut BNT pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada B. cereus (sel vegetatif)

28. Analisis sidik ragam hasil pengirjian pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun belun1:as pada B. ceres (spora) ...

29. Hasil uji lanjut BNT pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada 6. c:eres (spora)

...

30. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada S. aureus ...

31. Hasil uji lanjut BNT pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada S. aureus

...

1

...

33. Hasil uji lanjut BNT pengaruh g~ula terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada S. typhi

34. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas

...

antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (sel vegetatif) 35. Hasil uji lanjut BNT pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (sel vegetatif)

36. Analisis sidik ragam hasil peng~ujian pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (spora)

...

37. Hasil uji lanjut BNT pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada B. subtilis (spora)

38. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada E. coli ...

39. Hasil uji lanjut BNT pengaruh g'ula terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada E. coli

40. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada P. fluorescen ...

41. Hasil uji lanjut BNT pengaruh glula terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada P. fluorescens

...

42. Rekapitulasi data pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas ...

43. Analisis sidik ragam hasil pengiljian pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun be1unt:as pada B. cereus (sel vegetatif) ...

44. Hasil uji lanjut BNT pengaruh p l i terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada B. cereus (set vegetatif)

...

45. Analisis sidik ragam hasil pengi~jian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada

6.

ceres (spora) ...

46. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pti terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada B. c:eres (spora)

...

47. Analisis sidik ragam hasil peng~ujian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada S. aureus

...

48. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

49. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun belun~tas pada S. typhi ...

88

50. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada S. typhi 88

51. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas

...

antimikroba ekstrak daun beluntas pada 6. subtilis (sel vegetatif) 89 52. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

...

ekstrak daun beluntas pada

6.

subtilis (sel vegetatif) 89 53. Analisis sidik ragam hasil penglujian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada 0. subtilis (spora) ... 89 54. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun beluntas pada E. coli ... 90 55. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada E. coli ... 90 56. Analisis sidik ragam hasil peng~~jian pengaruh pH terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun belun3tas pada P. fluorescen ... 90 57. Hasil uji lanjut BNT pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba

ekstrak daun beluntas pada P. l'luorescens ... 90 58. Rekapitulasi data pengaruh pernanasan terhadap aktivitas

antimikroba ekstrak daun belurltas ... 91 59. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh suhu dan lama pemasan

terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada

... ...

6. cereus (sel vegetatif)

.

.

92

60. Analisis sidik ragam hasil pengujian pengaruh suhu dan lama pemasan terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada

B. cereus (spora) ... 92 61. Analisis sidik ragam hasil pengirjian pengaruh suhu dan lama pemasan

terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada S. aureus ... 92

62. Analisis sidik ragam hasil pengiljian pengaruh suhu dan lama pemasan terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas pada

...

P. fluorescens 92

63. Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap S. typhi

...

93 64. Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap spora dan sel

65. Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap speroflas dan

sel utuh S. typhi ... 94 66. Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap protoplas dan

PENDAHULUAN

A.

Latar

Belakang

Sejak lama manusia telah dihadapkan oleh kerusakan atau penurunan mutu bahan pangan terutama bahan pangan yang memiliki kandungan air dan nutrisi yang tinggi. Pengawret makanan digunakan untuk mencegah atau mengurangi kerusakan kimiawi dan biologi pangan. Pengawet untuk mencegah kerusakan biologi yang disebabkan mikroba disebut antimikroba.

Tanaman beluntas (Plucea indica L.) digunakan sebagai tanaman pagar dan pembatas antar guludan di perkebunan. Secara tradisional daunnya digunakan sebagai obat untuk menghilangkan bau badan, obat turun panas, obat batuk, dan obat antidiare yang digunakan oleh masyarakat Aceh dan Madura. Daun beluntas juga sering dikonsumsi oleh masyarakat sebagai lalapan (Winarno dan Sundari, 1996).

Penelitian awal yang dilakukan oleh Nuraida dan Dewanti-Hariyadi (2001 b), menunjukkan bahwa ekstrak polar daun beluntas dapat menghambat beberapa bakteri patogen dan bakteri psnyebab kerusakan bahan pangan. Kandungan minyak atsiri daun beluntas juga dapat menghambat bakteri penyebab diare (Winarno dan Sundari, 1996). Adanya aktivitas penghambatan terhadap bakteri diduga, disebabkan karena kandungan komponen aktif, diantaranya pluchine, asam kafeoilkunat, saponin, flavonoid, dan polifenol (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).

Adanya informasi secara tradisional dan penelitian awal menunjukkan bahwa daun beluntas mempun~yai potensi sebagai senyawa antimikroba, maka perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai kajian aktivitas antimikroba daun beluntas dalam bentuk ekstrak, sehingga akan memperkaya pemanfaatan sumber hayati yang ada di Indonesia.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari peneltian ini adalah :

2. Mendapatkan konsentrasii penghambatan minimum (MIC) dari ekstrak terpilih.

3. Mempelajari aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas terhadap berbagai struktur bakteri untuk menduga mekanisme senyawa antimikroba.

4. Mempelajari pengaruh perlakuan garam, gula, pH, dan pemanasan terhadap aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas.

C. Kegunaan Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan masukan dalam ha1 : 1. Pemanfaatan tanaman illdigenus dalam rangka peningkatan sumber

keanekaragam hayati Indoriesia.

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tanaman Beluntas (Plucea indica L.)

Beluntas merupakan ta~naman perdu tegak, berkayu, bercabang banyak, dengan tinggi bisa mencapai dua meter (Gambar 1.). Daun tunggal, bulat bentuk telur, ujung runcing, berbulu halus, daun muda berwarna hijau kekuningan dan setelah tua berwarna hijau pucat. Panjang daun 3,8-6,4 cm. Beluntas sering dipakai taliaman pagar dan pembatas antar guludan di perkebunan karena susunan percabangannya rapat (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).

A

B

Gambar 1. Tanaman belun~tas (Plucea indica L.) (A) ; Daun beluntas (0)

sangat baik untuk mengobati sakit kulit dan obat antidiare yang sering ditemukan pada masyarakat Aceh dan Madura (Winarno dan Sundari, 1996).

Penelitian yang telah dilakukan untuk mengetahui aktivitas antimikroba daun beluntas telah dilaporkatn oleh Nuraida dan Dewanti-Hariyadi (2001 b), yang menunjukkan bahwa ekstrak polar daun beluntas dapat menghambat bakteri Escherichia coli, Bacillus cereus, 6. subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., dan Pseudomonas fluorescens dengan penghambatan yang berbeda-beda. Sedangkan kandungan minyak atsiri yang terkandung dalam daun beluntas dapat menghambat bakteri penyebab diare (Winarno dan Sundari, 1996). Adanya penghambatan terhadap bakteri karena diduga daun beluntas mengandung komponen aktif, diantaranya pluchine, asam kafeoilkunat, saponin, flavonoid, dan polifenol (Syam~~uhidayat dan Hutapea, 1991).

6. Mekanisme Kerja Penghambatan Senyawa Antimikroba

Komponen antimikroba dapat menyebabkan kerusakan sel mikroba yang menyebabkan kematian. Kerusakan yang ditimbulkan komponen antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik (kerusakan yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi komponen dan kultur yang digunakan (Bloomfield,

1991).

esensial, dan (4) destruksi atau kerusakan fungsi material genetik (Branen dan Davidson, 1993).

1. Mengganggu pembentukan dinding set

Unit dasar dari dinding set bakteri disusun oleh peptidoglikan (mureik dan mukopeptida), fungsi dari peptidoglikan yang secara mekanis memberikan ketegaran patla sel bakteri, disamping sebagai dasar membran sitoplasma.

Nuraida

et

a/. (199!3a), menyebutkan bahwa bakteri gram negatif mempunyai ketahanan yalig lebih baik terhadap ekstrak polar daging biji picung dibandingkan dengan bakteri gram positif, ha1 ini disebabkan oleh perbedaan senyawa penyusun struktur dinding selnya. Pada Gambar 3 dapat dilihat perbedaan antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif 90 persen dinding selnya terdiri dari lapisan peptidoglikan, selebihnya (adalah asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya mengandung 5-10 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipopolisakarida, dan lipoprotein.

Adanya perbedaan struktur bakteri dalam bentuk sel vegetatif dan spora juga mempengaruhi ketahanannya terhadap senyawa antimikroba. Hal ini telah dibuktikan oleti Nuraida

et

a/. (1999a) dan Ultee

et

a/. (1998), yang membandingkan sel vegetatif dengan bentuk spora pada bakteri

6.

cereus.

Spora bakteri lebih tahan dibandingkan bentuk sel vegetatifnya, ha1

, . ... . ... _{Poplida pondsk}

-

J8mbat.n peptida

Dlnding sel

Dlndlng sel

Gambar 2. Struktur dinding dan membran sel bakteri. (A) Gram positif ;

(6)

Gram negatif ; (C) lapisan peptidoglikan (Cano dan Colome, 1 986).

Bereaksi dengan membran sel

Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma, yang dapat mengakibatkan kebocoran materi intraseluler, seperti fenol dapat mengakibatkan lisis sel dan menyebabkan denaturasi protein, menglhambat pembentukan protein sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada membran.

Reaksi komponen bioaktif dengan membran dapat mengubah permeabilitas membran sitoplasma sehingga mengakibatkan kebocoran zat nutrisi dalam sel, yang berakibat terhambatnya transport swbtrat (Smith et a/., 1 987).

3. Menginaktivasi enzim esensial

terpengaruh akan mengakibatkan produksi energi penyusun sel dan sintesis komponen secara struktural. Selanjutnya Fuller (1 991), menjelaskan bahwa senyawa fenol dapat bereaksi dengan enzim dehidrogenase sehingga berakibat hilangnya aktivitas enzim tersebut.

Beberapa kornponen bioaktif telah dilaporkan dapat menghambat aktivitas enzirn. Corner (1995), alisin pada konsentrasi 0,005 M dapat menghambat metabolisme enzim sulfhidril dan triosfosfat dehidrogenase. Minyak atsiri dari kayu manis, cengkeh, thyme, dan oregano dapat menghambat produksi etar~ol dan proses respirasi sel.

4. Menginaktivasi fungsi material genetik

Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA), akibatnya terganggunya trasfer informasi genetik, karena komponen ini menghambat aktivitas enzim RNA polimerase dan DNA polimerase, yang selanjut~nya akan rnenginaktivasi atau merusak materi genetik sehingga menggaliggu proses pembelahan sel untuk pembiakan (Kim et a/. , 1995).

C. Komponen Antimikroba Tanaman

Lada Atung Kopi Cengkeh Pinang Picung

2. Buah Mengkudu

Antarasa

Andaliman

Andalehat

Mobe

3. Rimpang Lengkuas

Jahe

Kunyit

Wortel

4. Batang

-

Oak Sikam Karet Sereh 5. Umbi Bawang putih Ekstrak khloroform Ekstrak methanol Ekstrak air Bubuk Bubuk Ekstrak air Ekstrak air Esktrak etanol Ekstrak etanol Ekstrak etanol Ekstrak etanol Ekstrak etanol Ekstrak etanol Ektrak air Minyak atsiri Ekstrak heksan Ekstrak air Bubuk Ekstrak etanol Ekstrak etanol dan polivinilpirolidon

Ekstrak methanol dan fraksi etil asetat

Ekstrak dan fraksi etil asetat

Asap cair dan redistilat total

Ekstrak etanol

Ekstrak air

S. aureus ; C. albicans

Total bakteri S. aureus ; E. coli L. monocytogenes S. aureus

S. aureus; E. coli ; S.

typhimurium ;P. fluorescens;

6. cereus

6. subtilis ; E. coli ; S. aureus ; P. auruginosa ; Salmonella

S. typhimurium ; V. cholerae ; S. aureus ; 6. cereus ; Pseudomonas

S. typhimurium ; V. cholerae ; S. aureus ; 6. cereus S. typhimurium ; V. cholerae ; S. aureus ; 6. cereus ; Pseudomonas

S. typhimunum ; V. cholerae ; S. aureus ; 6. cereus ; Pseudomonas

V. cholerae ; S. aureus ; L. monocytogenes

A. flavus ; R. oligosporus

S. aureus

E, coli ; Salmonella sp. ; V.

cholerae

6. subtilis ; E. coli ; E.

faecalis

Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides

E. coli ; P. aeruginosa ; 6.

stearothennophilus ; 6.

coagulas ; 6. brevis

E. coli ; B. cereus ; S.

aureus ; P. aeruginosa ; S. typhimurium

E. coli ; S. typhimurium ; S.

aureus

S. aureus ; 6. cereus ; B. subtilis ; Salmonella sp. ; E. coli ; Pseudomonas

S. aureus ; S. typhi ; E. coli ; L. monocytogenes

E. aerogenes ; S. cerevisiae ; C. albicans ; C. utilis ; A. parasiticus

Sutedja dan Agustina (1 994)

Moniharapon (1 991) Daglia et al. (1 994) Ting dan Deibel (1 992)

Masduki (1996) Nuraida et a/. (1999a)

Surono et a/. (2000)

Mulia (2000)

Mulia (2000)

Lindawaty (2000)

Lindawaty (2000)

Rahayu (1 999)

Lienni ( I 991)

Suwanto (1 983)

Babic et al. (1 994)

Serit et al. (1991)

Saragih (2001)

Karseno et a/. (2000)

Nuraida dan Dewanti- Hariyadi (2001 b)

Kumar dan Berwal (1 998)

1

Teh

I

Ekstrak methanol

Kemangi

1

Salam

I

Ekstrak etanol Ekstrak air Minyak atsiri

Sirih Ekstrak air dan eksitrak methanol

Poh- pohan

1

Streptococcus mutans tanaman (lanjutan)

Ekstrak etanol

V. cholerae

Mucor pirifonnis ; P. candidum

; P. expansum ; E. coli ; L. monocytogenes ; L. inocua ; S. typhimurium ; S. aureus S. aureus ; P. aeruginosa ; S. typhimurium ; E. coli ; L. monocytogenes

M. rouxii ; M. javanicus ; A. oryzae ; A. niger ; Penicillium sp. ; R. oryzae ; R. oligosporus

; S. aureus ; 5. cereus ; B.

subtlilis ; Salmonella sp. ; E. coli ; Pseudomonas sp. S. aureus ; 5. cereus ; 5.

subtlilis ; Salmonella sp. ; E. coli ; Pseudomonas sp.

M l k r o M . y a m

I

Sekanaka et a/.

(1 989)

I Toda et a/. (1 991)

Wan et al. (1 998)

W # k a

Sukarminah (1997)

Nuraida dan Dewanti- Hariyadi (2001 b)

Nuraida dan Dewanti- Hariyadi (2001 b)

Komponen yang larut dalam etanol dikelompokkan dalam golongan fenol, (Babic et a/., 1994). Harborrle (1987a), menyebutkan bahwa senyawa fenol cenderung mudah larut dalarn air karena umumnya senyawa ini berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat di dalam vakuola sel. Beberapa senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoid merupakan golongan terbesar. Beberapa struktur komponen fenol yang terdapat pada tumbuhan dapat dilihat pada Gambar 3.

FIa\tonc>ls

FIa\'011c's

ti0

Apigenin ti0 0

Luteolin

OH 0 R l '32 R 3

R, R2

Kaempferol H H H

Oc~ercet~n 0 H H ti

H H , Myricetin OH OH H

H Rutin H Oti rutinose

OH _{lsoquerc~trin OH H [i-D-glucose}

Flavano11c.s R,

H 0 H

0 H OCH,

Anthocyanidins R,

Fla\~anols (Catechins) R , Pelargonidin Cyanidin Delphinidin

(+) Catechin

OH Kuromanin

(-) Epigallocatechin

Chlorogenic acid

Phenolic acids

H H H

OH H H

OH OH H

OCH, H H

OCH, OCH, H

OH H glucose

0

R, R* '33

Cinnarnic acid H H H

3-Coumaric acid H OH H

Caffeic acid H OH OH

Ferulic acid H OH OCH,

Gambar 3. Komponen fenolik yang terdapat pada jaringan tanaman (Puupponen-Pimia et al., 2001)

adalah menambahkan pelar~ut pada bahan yang akan diekstrak dengan perbandingan tertentu, kemudian diaduk dengan pengaduk magnet, sedangkan cara Soxhlet pada prinsipnya adalah melarutkan bahan menggunakan alat Soxhlet, dimana suhunya diiatur tidak terlalu tinggi, agar komponen tidak mengalamai kerusakan (Hougt~ton dan Raman, 1998).

Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa komponen antimikroba dapat ditemukan pada minyak atsiri suatu tanarnan. Harborne (1987a) menyebutkan bahwa zat bioaktif yang terdapat pada minyak atsiri digolongkan ke dalam golongan terpenoid. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa, mulai dari komponen minyak atsiri, yaitc~ monoterpena dan seskuiterpena yang mudah menguap (Clo dan CI5), diterpena yang lebih sukar menguap (C20)1 sampai ke senyawa yang tidak menguap, yaitu triterpenoid dan sterol (CS0), serta pigmen karetonoid (C40) (Harborne, 1987a).

Minyak atsiri terdapat di dalam sel kelenjar khusus pada permukaan daun dan dapat dipisahkan dengan menggunakan metode distilasi. Teknik destilasi terdiri dari tiga cara yang banyak dilakukan yaitu ; (1) destilasi air dimana bahan ditempatkan bersama air, (2) destilasi uap dan air, dimana bahan hanya

Karakteristik Bakteri Perusak dan Bakteri Patogen Makanan

1. Pseudomonas fluorescer~s

Bakteri Pseudomonas sp. adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang lurus atau koki, bersifat motil dengan flagella polar, merupakan genus terbesar yang terdapat pada bahan pangan segar. Mempunyai persen G dan C 58-70 persen. Baktleri ini berasal dari tanah dan air, terdistribusi luas pada bahan pangan sepert~i sayuran, daging, produk-produk peternakan, dan produk-produk perikanan.

Bakteri Pseudomonas fluorescens merupakan grup bakteri paling penting penyebab kerusakan dan kebusukan makanan yang didinginkan.

Umumnya bakteri ini berukuran kecil dengan lebar 0,5-1,O pm dan panjang

1,5-4,O pm (Jay, 1997).

P. fluorescens dapat memproduksi pigmen fluoresin yang bersifat fluoresen, larut dalam air, dan dapat memproduksi senyawa-senyawa yang menimbulkan bau busuk. Selain itu bakteri ini merupakan kelompok bakteri lipolitik, pertumbuhannya pada kondisi aerob berjalan cepat dan biasanya secara fisik dapat dilihat karena memproduksi lendir. Pseudomonas sp. tidak tahan terhadap panas dan keadaan kering, oleh karena itu mudah dibunuh dengan proses pemanasan dan pengeringan.

2. Salmonella sp.

menggunakan sitrat sebalgai sumber karbon, tidak dapat memfermentasi salisin, selulosa, dan laktosa (Jay, 1997). Salmonella sp. tumbuh dengan suhu 37 OC, meskipun daplat tumbuh pada suhu dibawah 10 OC, pH optimum pertumbuhan adalah 63-7,5, walaupun dapat tumbuh pada rentang pH 4 3 - 9,O. Mempunyai ketahanan panas tinggi pada pH 5 3 , a, rendah, dan makanan dengan lemak tinggi. Viabilitas Salmonella sp. menurun selama penyimpanan beku (Portillo, 2000).

Habitat alami Salmonella sp. adalah saluran pencernaan hewan (reptil dan burung), termasuk dailam saluran pencernaan manusia dan serangga. Karena terdapat di dalam saluran percernaan maka Salmonella sp. dapat dikeluarkan melalui feses sehingga dapat dipindahkan oleh serangga atau makhluk hidup lainnya. Selmonella sp. ditemukan di air, terutama air yang yang telah terrpolusi. Adanya kontaminasi air oleh serangga atau hewan yang telah terinfeksi Sa1n;ronella sp. jika kontak dengan makanan dapat meyebabkan keracunan makanan jika dikonsumsi manusia (Jay, 1997).

3. Escherichia coli

E. coli merupakan bakteri Gram negatif, tidak mempunyai kapsul, umumnya mempunyai fimtlriae, bersifat motil atau non motil dengan flagella peritrikat, berukuran lebar 1-1,5 pm dan panjang 2-6 pm, bersifat fakultatif anaerob, tunggal atau berpasangan, mempunyai suhu optimum pertumbuhan

37 OC, tetapi dapat tumbuh pada rentang suhu 15-45 OC. Nilai a, optimum adalah 0,96. Bakteri ir~i sangat sensitif terhadap panas dan dapat diinaktifkan pada suhu pasteurisasi atau selama pemasakan makanan (Willshaw et al., 2000 ; Supardi dan Sukamto, 1999).

E. coli merupakan bakteri flora normal di dalam saluran pencernaan

hewan dan manusia, sehingga mudah mencemari air. Kontaminasi bakteri ini pada makanan biasanya berasal dari kontaminasi air yang digunakan. Dosis yang dapat menimbulkan gejala infeksi E. coli pada makanan berkisar antara 1 0 ~ - 1 0 ~ sel. Bahan makanan yang sering terkontaminasi oleh E. coli antara lain daging, ayam, daging babi, ikan, dan makanan hasil laut lainnya, telur dan produk olahannya, sayuran, buah-buahan, sari buah, serta susu (Supardi dan Sukamto, 199!3).

Berdasarkan gejala dan karakteristik penyakit yang ditimbulkan, E. coli dikelompokkan menjadi lirna kelompok yaitu enteroagg~gative E. coli (Eagg EC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (El EC), enteropathogenic E. coli (EPEC), dan enterotoxigenic E. coli (ETEC) (Jay, 1 997).

(hemolytic-uremic) dan kerusakan syaraf (thrombotic thrombocytopaenic purpura) pada manusia terutama anak-anak dan usia lanjut (Griffin et al., 1988). Bakteri ini juga dapat berasal dari persediaan air baik air permukaan maupun air minum yang tcslah terkontaminasi (Griffin dan Tauxe, 1991). E. coli 0157:H7 dikertahui mempunyai ketahanan yang tinggi terhadap lingkungan asam (Arnold dlan Kasper, 1995) sehingga dapat ditemukan pada makanan dengan pH rendah seperti salami, yogurt (Morgan et al., 1993), jus ape1 dan cider ape1 (Besser et al., 1993).

4. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus termasuk famili Micrococcaceae, merupakan bakteri Gram positif, berbentuk kokus yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur. Kebanyakan galur S. aureus bersifat patogen dan memproduksi enterotoksin yang tahan panas. Beberapa galur, tertama yang bersifat patogen, memproduksi

koagulase, bersifat proteolitik, lipolitik, dan P-hemolitik. Bakteri ini sering terdapat pada pori-pori dar~ permukaan kulit, kelenjar keringat, dan saluran usus, serta dapat meyebabkan intoksikasi dan infeksi bisul, pneumonia, mastitis pada hewan (Fardiaz, 1983a).

Keracunan pangan stapilokokal disebabkan oleh Staphylococci (khususnya S. aureus) tumbuh di dalam bahan pangan dan membentuk enterotoksin sebagai produk metabolitnya. Gejala-gejala keracunan yang ditimbulkan adalah mual, niuntah, kram perut, dan diare. Gejala keracunan ini terjadi antara 1-8 jam (biasanya 2-4 jam) setelah mengkonsumsi bahan pangan yang telah terkontaminasi (Parker, 2000).

5. Bacillus cereus

6.

cereus merupakan bakteri patogen pembentuk spora yang umum ditemukan pada makanan, karena terjadi kontaminasi yang berasal dari tanah, debu, dan air. 6. cereus merupakan bakteri penyebab keracunan yang terjadi di Eropa sejak tahun 1906 (Jay, 1997). Bakteri ini berbentuk batang, bersifat aerob fakultatif, katalase positif dan bersifat Gram positif. Suhu minimum untuk pertumbuhan 4-5 OC, maksimum suhu 48-50 OC, dengan suhu optimal perturnbuhannya adalah 30-45 OC, serta dapat tumbuh pada pH 4,9-9,3 (Jay, 1997 ; Granum dan Baird-Parker, 2000).

Sebagian besar strain

6.

cereus adalah mesofilik dan dapat tumbuh pada makanan asam rendah pada suhu 15 OC dan maksimal sampai 55 OC. Umumnya makanan terkontaminasi oleh 6. cereus karena proses pendinginan yang lambat, pada makanan yang telah dimasak dalam waktu yang lama, serta pada suhul kondusif untuk pertumbuhan substansial (Gould dan Rusel, 1991).

septikemia dan meningitis dengan waktu inkubasi 1 / 2 4 jam (Granum dan Parker, 2000).

E. Kapang Perusak dan Patogen Makanan

Beberapa contoh kaparlg yang sering menyebabkan kerusakan pada produk pangan dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Jenis-jenis kapang yang sering dijumpai pada beberapa komoditas

Jenis

Harpadg

I

Susu bubuk Aspergillws glaucus, A. versicolor, Penicillium cycliporium,

I

1

P. oxalicum, P. stoloniferum, P. viridicatum, Scopulariopsis

I

Keju

bre vicaulis.

P. expan:sum, P. commune, A. candidus, Cladosporium

Telur

Manisan buah

herbarum,, Mucor racemosus, A. niger, A. flavus, P. oxalicum, P. puberulum

P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucasum

A. glaucus, Penicillium sp., Xeromyces bisporus, Mucor Biji coklat

Tabel 2 menunjukkan bahwa kerusakan pangan disebabkan oleh

-

sp., Rhizopus sp.

A. glaucu:~, A. fumarii, A. flavus, A. fumigatus, Penicillium Jus buah

pertumbuhan kapang Aspergillus sp. dan Penicillium sp. Hal ini disebabkan sp.

Byssochlamys fulva

karena kedua jenis kapang tersebut lebih cepat pertumbuhannya pada bahan Sumber : Syarief dan Halid (1993)

pangan dengan kandungan air rendah dan kandungan protein tinggi dibandingkan dengan kapang jcmis lainnya.

Kapang Aspergillus sp, tersebar luas di alam dan sering menyebabkan kerusakan pangan. Beberapa spesies digunakan dalam fermentasi makanan, jenis kapang ini dibedakan atas 18 grup Aspergillus yang terdiri dari 100 spesies (Fardiaz, 198913). Salah satu spesies yang penting adalah A. flavus, karena

I

(minimum), 43

OC

(maksimunn), dan 25-32

OC

(optimum). Laporan Pitt dan Hocking (1996), menunjukkan bahwa dari 1700 sampel (jagung, kacang, kedelai, gandum, rempah-rempah) di Asia Tenggara dari tahun 1991 -1 996 terkontaminasi besar oleh A. flisvus.

BAHAN DAN METODE

A. Bahan dan Alat Penelitian

Bahan-bahan yang diguriakan dalam penelitian ini adalah daun beluntas

(Plucea indica L.) yang diperloleh di daerah Loji Bogor. Kultur bakteri yang digunakan adalah B. subtilis, B. cereus, S. aureus, E. coli, S. typhi, P. fluorescens, Penicillium sp., dan Mucor rouxii yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Pusat Studi Pangan dan Gizi (PSPG) IPB dan Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi (TPG) FATETA IPB, serta A. flavus yang diperoleh dari SEAMEO BIOTROP Bogor. Bahan-bahan kimia yang digunakan diantaranya untuk pertumbuhan dan fermentasi adalah NB (Becton Dickenson), PDA (Oxoid), Bacto Agar (Difco dan Oxoid), NaCl (PA Merck), kristal KH2P04 (PA Merck), buffer tris-HCI (PA Merck), sukrosa (PA Merck), EDTA (PA Merck), enzim lisozim (Sigma), MgCI2 (PA Merck), gula (PT Bermis), Tween 80, dan bahan lain seperti kapas, aluminium foil, kertas saring Whatman 42, serta akuades. Pelarut yang digunak,an untuk ekstraksi adalah etanol dan heksan (PA Merck).

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat untuk produksi ekstrak seperti freeze dryer Neocool 110 V, unit ekstraksi berpendingin balik, labu bitwel sterling, labu sokhlet, penangas air (GLF), rotavapor (Buchi Waterbath R-3000). Alat untuk pengujian aktivitas antimikroba seperti cawan

petri, tabung reaksi berulir, mikro pipet 100 pl dan 1000 pI (eppendorf), tips

analitik (Chyo JP-160), spektrofotemeter (Shimadzu), vortek (Geniie-2), refrigerator (Fisher Scientific), otoklaf, oven sterilisasi, inkubator, mikroskop (Nikon YSrT dan Olympus BH-2), serta peralatan gelas yang lain.

B. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan beberapa tahap yang meliputi :

Persiapan daun beluntas

Tahap ini bertujuan untuk membuat tepung daun beluntas. Daun beluntas yang digunakan dalam penelitian ini adalah pucuk sampai tiga daun di bawah pucuk (p+3). Daun beluntas pertama-tama disortasi, dicuci, dan ditiriskan, kemudian dikeringbekukan menggunakan pengering beku. Setelah kering daun dihaluskan dan disaring dengan ukuran 40 mesh. Tepung disimpan dalam wadah plastik yang kedap udara, yang setiap saat dapat digunakan untuk tahap selanjutnya.

Penentuan fase pertumbuhan akhir (Late log phase)

Tahap ini bertujuan untuk menentukan late log phase bakteri. Bakteri yang digunakan adalah 6. srubtilis, 6. cereus, S. aureus, S. typhi, E. coli, dan P. fluorescens. Penentuannya dilakukan dengan cara sebagai berikut : satu ose dari agar miring biakan murni NA diinokulasikan ke dalam lima milliliter NB. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Kultur yang telah 24 jam diambil

diketahui late log phase terhadap setiap bakteri dilakukan penghitungan sel menggunakan alat hemasitometer

3. Metode ekstraksi

Tahap ini bertujuarl untuk mendapatkan ekstrak menggunakan beberapa metode ekstraksi dengan pelarut organik.

a. Ekstraksi non polar

Untuk mendapatkan ekstrak non polar sebanyak 150 gram tepung diekstrak menggunakan metode soxhlet menggunakan pelarut heksan selama 4x8 jam, sampai diperoleh filtrat dengan warna jernih (bening) (Houghton dan Raman, 1998). Selanjutnya filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya menggunakan rotavapor pada suhu 40 O C (rpm 75). Setelah itu untuk menytsmpurnakan hilangnya sisa pelarut, ekstrak yang diperoleh ditiup dengar1 gas nitrogen. Ekstrak disimpan dalam botol bewarna coklat berukuran 100 ml dan disimpan dalam refrigerator.

b. Ekstraksi polar

Selanjutnya filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya menggunakan rotavapor pada suhu 40 O C (rpm 75). Untuk

menyempurnakan hilar~gnya sisa pelarut, ekstrak yang diperoleh ditiup dengan gas nitrogen. Ekstrak disimpan dalam botol berwarna coklat berukuran 100 ml dan dlisimpan dalam refrigerator.

4. Persiapan ektrak

Tahap ini bertujuan untuk mengencerkan ekstrak pada konsentrasi tertentu untuk pengujian. Ekstrak non polar diencerkan dengan air steril yang berisi Tween 80 (0,51%), sedangkan pelarut ekstrak polar adalah air steril. Konsentrasi ekstrak yang diuji adalah 20 % untuk pengujian aktivitas awal dan 30 % untuk pengi~jian tahap selanjutnya. Ekstrak yang baru selalu disiapkan sebelum dilakukan pengujian aktivitas antimikroba ekstrak.

5. Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak non polar dan polar (defatted dan non defatted)

Tahap ini bertujuan u~ntuk mendapatkan ekstrak daun beluntas yang mempunyai aktivitas tertinggi terhadap bakteri uji. Ekstrak yang diuji adalah ekstrak non polar, ekstrak polar defatted, dan ekstrak polar non defatted. Bakteri uji yang di gunakan adalah B. cereus, S. aureus, S. typhi, E. coli, dan

P. fluorescens. Setelah diperolah aktivitas antimikroba yang tertinggi dilanjutkan untuk pengujian tahap selanjutnya.

6. ldentifikasi golongan komponen ekstrak secara kualitatif

golongan komponen yang terdapat di dalam ekstrak. Analisis dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, fenol hidrokuinon, saponin, dan tanin (Harborne, 1987a).

7. Pengujian aktivitas antirnikroba terhadap sel vegetatif bakteri dan kapang serta penentuan MIC

Tahap ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak polar defatted daun belu~ntas dan penentuan nilai minimum inhibitory concentration (MIC).

a. Pengujian aktivitas a~itimikroba terhadap sel vegetatif bakteri dan kapang

1. Persiapan kultur sel vegetatif bakteri dan kapang

2. Pengujian aktivitas antimikroba

Pengujian akltivitas antimikroba menggunakan metode difusi sumur dengan diameter 6 mm (Carson dan Riley, 1995).

b. Penentuan nilai MIC

Nilai MIC adalah konsentrasi terendah yang mampu mematikan semua mikroba yang dinokulasikan ke dalam medium. Konsentrasi ekstrak polar yang diuji adalah 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70% dengan mikroba uji 5. subtilis,

5.

cereus, S. aureus, S. fyphi, E. coli, dan P. fluorescens. Metode pengujian menggunakan metode difusi sumur. Penghitungan nilai MIC dilakukan berdasarkan metode Bloomfield (1991), yaitu dengan memplotkan antara In Mo (konsentrasi ekstrak) pada sumbu

X terhadap nilai kuadrat zona penghambatan (x*) pada sumbu Y. Perpotongan antara kurva linier dengan sumbu X merupakan nilai Mt (diperoleh dengan regresi linear). Besarnya nilai MIC ditetapkan sebagai % X Mt.

8. Pengujian aktivitas antimikroba terhadap spora

Tahap ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak polar daun beluntas terlhadap spora bakteri. Pengujian dilakukan menggunakan metode difusi sumur terhadap spora

5.

cereus dan B. subtilis.

Penyiapan kultur spolra dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :

konsentrasi spora mengg~~nakan metode hitungan cawan (Fardiaz, 1989~). Sebelum dilakukan pengujian dilakukan pemanasan spora pada suhu 80 OC selama lima menit, yang bertujuan untuk menginaktivasi sel vegetatif. Konsentrasi spora yang digunakan untuk pengujian adalah

l o 4

CFUIml.

9. Pengujian aktivitas antimikroba terhadap sferoplas dan protoplas

Tahap ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak polar daun beluntas terhadap speroplas dan sel utuh S. typhi, dan protoplas dan sel utuh B. cereus dan S. aureus. Pengujian dilakukan menggunakan metode difusi sumur.

a. Pembuatan kultur sferoplas

Pembuatan kultur sferoplas (S. typhi) dilakukan menurut metode William dan Gledhill (1991). S. typhi ditumbuhkan ke dalam media NA dengan goresan kuadran, kemudian diinkubasi selama 48 jam. Koloni yang terbentuk diambil dengan ose dan disuspensikan ke dalam buffer tris-HCI steril 10 mmol rang berisi EDTA 1 mmol, sukrosa 0,5 molll, dan

enzim lisozim sebanyak 50 pglml sampai mencapai absorbansi 1,O pada

b. Pembuatan kultur protoplas

Pembuatan kultur protoplas (S. aureus dan

6.

cereus) dillakukan menurut metode William dan Gledhill (1991). S. aureus dan

6.

cereus ditumbuhkan ke dalam media NA dengan goresan kuadran, kemudian diinkubasi selama 48 jam. Koloni yang terbentuk diambil dengan ose dan disuspensikan ke dalann buffer tris-HCI steril 10 mmol yang berisi MgCI2 0,01 molll, sukrosa 0,5 molll, dan enzim lisozim sebanyak 50 pglml

sampai mencapai absorbansi 1,O pada panjang gelombang 650 nm. Suspensi selanjutnya cliinkubasikan selama 30 menit sehingga hampir seluruh sel membentuk protoplas, yang diamati menggunakan mikroskop. Selanjutnya protoplas dipanen dengan sentrifugasi pada 6000 rpm selama 15 menit, pada suhu ruang dan diresuspensikan dalam 1 ml buffer tris-HCI steril 10 mmol tanpa enzim lisozim. Sel utuh sebagai

kontrol disuspensikan cllalam buffer tris-HCL steril 10 mmol. Pengujian aktivitas antimikroba menggunakan metode difusi sumur.

10. Pengujian pengaruh gararn terhadap aktivitas antimikroba ekstrak

11. Pengujian pengaruh gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak

Tahap ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan gula terhadap aktivitas antimikroba ekstrak polar daun beluntas. Pengaruh gula diberikan dengan konsentrnsi (10, 20, 30, 40, dan 50 persen). Larutan gula tersebut disterilisasi terlebih dahulu, sebelum digunakan sebagai medium ekstrak. Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 30 persen. Metode pengujian menggunakan metode difusi sumur.

12. Pengaruh pH terhadap aktivitas antimikroba ekstrak

Tahap ini bertujuan urituk mengetahui pengaruh perlakuan pH terhadap aktivitas antimikroba ekstrak polar daun beluntas. Ekstrak dilarutkan dalam larutan KH2P04 dengan berbagai nilai pH yang telah dipersiapkan terlebih dahulu. Metode persiapan larutan KH2P04 adalah sebagai berikut :

sebanyak 17 gram KH2PCI4 murni, dilarutkan terlebih dahulu dengan air aquades sebanyak 250 ml. Selanjutnya pH larutan ditepatkan pada nilai 7,2. Kemudian larutan ditera menggunakan labu ukur 500 ml. Kemudian nilai pH ditepatkan pada nilai 4, 5, 6, dan 7 menggunakan larutan HCI dan NaOH 1

M. Larutan KH2P04 disterilisasi terlebih dahulu, sebelum digunakan sebagai medium ekstrak. Konsentl-asi ekstrak yang digunakan adalah 30 persen. Metode pengujian menggunakan metode difusi sumur.

13. Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antimikroba ekstrak

Tahap ini bertujuan uintuk mengetahui pengaruh perlakuan suhu dan

persen dengan kombinasi suhu dan waktu. Pemanasan pada suhu 75

OC

selama 10, 20, dan 30 menit menggunakan penangas air. Pemanasan 100 dan 121 OC selama 10, 20, dan 30 menit menggunakan otoklaf. Selanjutnya ekstrak diuji menggunakan metode difusi sumur.

C. Metode analisis

1. ldentifikasi golongan kornponen secara kualitatif

a. Penentuan adanya alkaloid

Penentuan adanya alkaloid berdasarkan metode Harborne (1987a). Sebanyak satu gram ciontoh digiling halus bersama-sama pasir sambil dibasahi dengan 5 ml kloroform yang mengandung beberapa tetes ammonia

(2

3 tetes). Tambahkan lagi 5 ml kloroform yang mengandung beberapa tetes ammonia

(2

5 tetes), kemudian saring ke dalam tabung reaksi. Ekstrak kloroform dalam tabung rekasi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 MI kemudian dipisahkan lapisan asamnya ke dalam tabung reaksi lain. Spot diteteskan pada spot plate dan ditambahkan 3 pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner yang akan menimbulkan warna berturut- turut endapan mertah jingga, endapan putih, dan endapan coklat.

b. Penentuan adanya flawonoid dan senyawa fenolik

merah menandakan positif senyawa fenol hidrokuinon. Pada spot plate kedua ditambahkan II tetes H2SO4 pekat, timbulnya warna merah menandakan positif seriyawa flavonoid.

c. Penentuan adanya triterpenoid dan steroid

Penentuan adanya triterpenoid dan steroid berdasarkan metode Harborne (1987a). Sebanyak 1 gram contoh ditambahkan etanol dan dipanskan, lalu disaring. Filtrat diuapkan dan ditambahkan eter. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diteteskan pada spot plate lalu ditambah pereaksi LB (3 tetes asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4). Adanya triterpenoid ditandai dengan timbulnya warna merah atau ungu, sedangkan adanya steroid ditandai dengan timbulnya warna hijau.

d. Penentuan adanya flavonoid, saponin, dan tanin

disaring. Filtrat ditarnbahkan beberapa ml larutan FeCI3 1 persen. Timbulnya warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan tanin positif.

Pewarnaan endospora

Pewarnaan endospora berdasarkan metode Fardiaz (1 989c). Pertama- tama satu-dua ose kultur dipindahkan ke gelas obyek, kemudian difiksasi. Diteteskan pewarna hijau nialasit diatas kultur yang telah mengering, biarkan selama 20 menit tanpa pernanasan atau 5 menit dengan pemanasan di atas penangas air. Setiap kali pewarna mongering, diteteskan lagi pewarna hijau malasit. Kemudian dicuci (Jengan air mengalir selama 20-30 detik. Ditetesi kembali dengan larutan safranin selama 30 detik, kemudian bilas dengan air mengalir. Dikeringkan dengan kertas serap dan diamati dibawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak imersi. Sel vegetatif bakteri berwarna merah, sedangkan spora bekteri berwarna hijau.

3. Pengujian aktivitas antimikroba dengan metode sumur

Pengujian aktivitas antimikroba menggunakan metode difusi sumur dengan diameter 6 mm (Carson dan Riley, 1995). Dari persiapan kultur yang

telah dilakukan, dipindahkan secara aseptik sebanyak 2 pl ke dalam NA 20 ml untuk sel vegetatif dan 2 ml ke dalam 20 ml NA untuk spora. Sedangkan

untuk kultur spora kapang dipindahkan 200 pl ke dalam 20 ml PDA.

Selanjutnya media dibiarkarl membeku (kira-kira 20 menit), kemudian dibuat sumur dengan diameter 6 mm, setelah itu dimasukkan ekstrak sebanyak 60

Kemudian cawan diinkubasi padas suhu 37

OC

selama

24 jam. Zona

penghambatan diukur berdasarkan diameter areal bening (milimeter) disekitar sumur.

4. Pengukuran a, larutan gula dan garam

Pengukuran a, dilakukan terhadap larutan garam dan gula. Sampel diletakkan dalam a, meter Shibaura WA 360 yang telah dikalibrasi menggunalah larutan standar &So4 yang mempunyai aw 0,9700.

5. Pengukuran pH ekstrak

A. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Non Polar dan Polar

Pengujian aktivitas antimikroba terhadap ekstrak non polar dan ekstrak polar (defatted dan non defatted) daun beluntas terhadap sel vegetatif bertujuan untuk mengetahui potensi sifat antimikroba. Pengujian dilakukan dengan metode difusi sumur dan kertas cakram, dengan konsentrasi ekstrak yang diuji adalah 20 persen (wlv) dengan konsentrasi bakteri uji adalah

lo4

CFUIml.

Hasil yang diperoleh merlunjukkan bahwa dengan metode kertas cakram semua ekstrak yang diuji tidak menunjukkan aktivitas antimikroba. Hal ini kemungkinan disebabkan ekstrak yang menempel pada kertas saring jumlahnya terlalu kecil sehingga tidak marr~pu untuk berdifusi ke dalam media. Oleh karena itu untuk pengujian selanjutnya tjigunakan metode difusi sumur.

Pengujian ekstrak non polar dengan medium 0,5 persen Tween 80 terhadap bakteri dan kapang uji tidak menunjukkan aktivitas. Hal ini kemungkinan disebabkan komponen aktif yang terdapat di dalam daun beluntas tidak terekstrak dengan pelarut non polar (heksan). Ekstrak daun beluntas yang mempunyai aktivitas terhadap bakteri maupirn kapang adalah ekstrak polar (defatted dan non defatted), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.

Puupponen-Pimia et al. (200'1) menyebutkan bahwa komponen fenolik yang terkandung pada ekstrak berry mampu menghambat beberapa bakteri Gram negatif, diantaranya adalah Salmonella enterica SH-5014 dan E. coli CM871. Naidu (2000), mensitir pernyataan Aqeel et al. (1989), menyatakan bahwa komponen alkaloid yang terdapat pada tanaman Prosopis juliflora mempunyai kemampuan untuk rnenghambat 31 spesies bakteri, dua spesies Candida, lima spesies jamur penyebab sakit kulit, dan dua spesies virus. Lebih lanjut Naidu (2000), mensitir pernyataan Aguwa dan Lawal (1988), menyatakan bahwa pada daun Caliandra portoricensis mengandung tanin yang dapat menghambat aktivitas pertum bu han E. coli, S aureus, dan Streptococcus faecalis.

lstilah fenolik atau polifenol dapat didefinisikan secara kimia sebagai suatu substansi yang mempunyai satu cincin aromatik dan minimal satu (kebanyakan lebih dari satu) substitusi gugus hidroksi yang termasuk gugus fungsional. Pada Tabel 4 disajikan kelompok utama fenolik pada tanaman.

psoralen (Gambar 5-g), mempunyai aktivitas rendah terhadap bakteri dan

kapang (MIC 125-500 pg ml-I) ( Bisignano et a/., 2000).

E3enzokuinon 2,6-Dimetoksibenzokuionon Asam fenolik p-Hidroksibenzoat, salisilat Asetofenon 3-Asetil-6-

I

I

I

I

metoksibenzaldehida

I

lsoflavonoid Genistein Podo h llotoxin 30

.

(C6'C3- Biflavonoid Amentoflavon

9

10 13 14

.

c6-c3

.

C6-C4

.

C6-C1-C6

.

C6-C2-C6

N

Tanin adalah salah satu kelompok fenolik yang merupakan polimer linear

I

~ 6 h - 1

dari flavan-3-01 dan flavan-3,4-diol. Unit-unit tersebut dihubungkan bersama Asam fenilasetat Asam hidroksinamik F:enilpropena Kumarin I!;o