veterinary Nedi'cine Journal
Volume 21 Nomor 1, Januari
2005
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga
Faculty
of
Veterinary Medicine, Airlangga University
Akreditasi Dirjen Dikti No. 23a/Dikti/Kep/2004
Me&a Kedokteran X e w a n
I
Vol. 21,
No.
1,
Januari
2005
1
Media Kedokteran Hewan.meTerbi
pertoma kali
tahun 1 98. .
Susunan Dewan Redaksi
Pelindung : Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
I
Ketua Penyunting : Prof. Dr.Hj.
Sri Subekti Bendryman S., DEA., Drh.Penyunting Ahli :
Q
Prof. Dr. Mohd Zamri Saaci, Ph.D., M s . , DVM. (UPM Malaysia)A r.
n- ''.,:,,.I
'.,
.:,:
;y:,,l:d T :-3, :,J:B~'~., ?:,.La L , ; , z ! s ~ ~ ~ - -d I
I
Q
Prof. Dr. Mohd Hair Bejo, Ph.D., DVM. (UPM Malaysia)I
Q
Prof. Dr. Dondin Sajuthi, Drh. (FKHIPB)
1
6
Prof. Roostita L. Balia, Ph.D., MSC., Drh. (Fapet Unpad)Q Dr. Wisnu Nurcahyo, Drh. (FKH UGM)
Q
Ir. Mulyoto Pangestu, M.Reprod.Sc., Ph.D. (Monash University)Q
Ir. Roni Rachman Nur, M.Rur.Sc., Ph.D. (Fapet IPB)6 Dr. Lies Parede Hernomoadi, M.Sc., Drh. palitvet)
Q
Dr. Aulanni'am, M.S., Drh. (MIPA Unibraw)Q
Widya Asmara, Ph.D., M.S., Drh. (FKH UGM)Q
Dr.I
Ketut Made Mahardika, Drh.(FKH
Unud)Q Dr. Sri Muharsini, Drh. (Balitvet)
Q
Dr. Dasrul, M.Si., Drh. (FKH Unsyiah)Penyunting Pelaksana :
@
Mas'ud Hariadi, PhD., MPhil., Drh. (FKH Unair)Q
Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh.(FISH
Unair)Q Dr. Diah Kusumawati G., SU., Drh. (FKH Unair)
Q
Thomas Valentinus Widiyatno, MSi., Drh. (FKH Unair)@ Iwan Willyanto, PhD., Drh. (FKH Unair)
Q Suwarno, MSi., Drh. (FKH Unair)
@
Imam Mustofa, MKes., Drh.Penyunting Penyelia :
O
Kusnoto, MSi., Drh. (FKH Unair)O
Epy Muhammad Luqman, MSi., Drh. (FKH Unair)Tata Usaha :
0
Berty Ferijanti, S.Sos.Alama
t:
Fakultas Kedokteran Hewan Universi tas Airlangga
Kampus
"C"
Unair, Mulyorejo Surabaya 60115
1Telp. (031) 5992785; 5993016; Fax. (031) 599301
5
e-~naii: vaiunair@telkurfi.net; i~h@unalr.ac.id; kusnoto~~@yanoo.com; kusnoto3k@unair.ac.id
Rekening:
Tahapan
BCA
-
No. 01-4018-9375 (Dr. Diah Kusumawati
G.)
Meda Kedokteran Hewan diterl~itkan oleh Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga,
Vol. 21, No. 1, Januari 2005
Vitrifikasi Ovarium Mencit Menggunakan Etilen Glikol dan DMSO sebagai
Krioprotektan dan Viabilitasnya Pasca Autotransplantasi
di Subkapsula Ginjal
Vitrification of Mouse Ovary Using Ethylene Glycol and DMSO as Cryoprotectant and Viability after Autografted under Kidney Capsule
1
I
'kusdlant0r0 Mohamadl', i t a Djuwita', Arief Boediono', Iman Supriatna2Lnepartemen Anatomi, 2Departemen Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran t lewan, lnstitut Pertanian Bogor; Jl. Agatis Kampus Darmaga, Bogor 16680 Indonesia 7'el./Fax.: +62-251421823
*Korespondensi: kusrn2063ya hoo.corn
I
I
A b s t r a c tI
I
(EG) a n d dimethyl sulfoxide (DMSO) a s cryoprotectant. Thirty t w o female I1I)Y mouse The aimof
this study was to examine viability of vitrified mouse ovary using ethylene glycol (8 weeks of age) were divided into four groups: control (fresh ovaries), 30% IXG, 30% IIMSO, a n d 1 5 % EG + 1 5 %1
I > M v kA,.difipA ..L.---L-&- L , - f i - - . - J - - I . - - -=.,+=:-:...
. - ~ I B W.-
C - L - I.---.
I - - --
.,.,,I,.* se%--, l-m.?.nA . . 5 ~ ~ I U
cryoprorectant were used as v~trification solution. Ovarics werc exposed with solution contained 10% a n d 30% cryoprotectant 5 minutes of each a t room temperature, loaded in 0.5 ml straws a n d vitrified in liquid nitrogen (-1960C). After warming in water a t 370 C, ovaries were autografted u n d e r the kidney capsule. Mouse were eximaned oestrous cycles daily a n d o n day-30, mouse were sacrificed a n d ovaries werc fixed for histology. Viability of ovaries were 70046, 13%, 0%, a n d 1 9 % i n control,
30% EG, 30% DMSO, and 15% EG
+
15%DMSO
groups, respectively. Oestrous cycles w e r e detected in loo%, 13%, 0%, and 13% mice in control, 30% EG, 30% DMSO, a n d 15% EG+
1 5 % DMSO groups, respectively. Histology examination of viable ovaries showed follicles development. This result showed that ovaries vitrified in solution contained 30% EG a n d 15% EG+
1 5 % DMSO a s cryoprotectant could be survived after autografted u n d e r the kidney capsule.I I
Key
words: ovary, cryopreservation, vitrification, graft, oestrous cycle, histologyPendahuluan
Pembekuan ovarium telah dimulai pada tahun 1950-an rnenggunakan gliseroI sebagai krioprotektan (Parkes dan Smith, 1953; Deanesly, 1957). Karena hasil yang masih rendah, maka penelitian mengenai pembekuan ovarium baru muncul kembali di awal tahun 1 W a n dengan dilaporkannya keberhasilan pembekuan ovarium pada rnencit rnenggunakan dirnetil sulfoksida (DMSO) (Harp et al. 1994). Sejak saat itu berbagai ovarium hewan telah berhasil dibekukan dengan metode konvensional, mulai dari ovarium mencit (Candy et al. 1993, tikus (Callejo et ul. 1999), kucing (Gosdcn el ul. 1994), domba (Salle el al. 1999), gajah (Gunasena et al. 1998), primata (Candy el
al. 1995), dan manusia (Gook et al. 2001).
v i t - i t ~ ; ; ,t.bgai sebuah meiode prnbekuan melalui proses prnadatan larutan tanpa prnbentu- kan kristal es sebagai akibat pningkatan viskositas dan penurunan suhu yang sangat cepat (Rall dan Fahy, 1985) telah luas digunakan pada ernbrio atau sel telur, akan tetapi pada ovarium belum banyak
dilakukan (Shaw el ul. 2000). Vitrifikasi ovarium telah dilaporkan oleh Sugimoto el al. (2000) dan Kagabu dan Umezu (2000) yang menunjukkan siklus estrus pada hewan rcsipien dan perkembangan folikel pada pngamatan histologi. Kedua peneliti tersebut merujuk metodc vibifikasi yang digunakan untuk pembekuan embrio (Rall dan Fahy 1985). Hasil yang diperoleh menunjukkan metode prnbekuan konvensional lebih baik dibanding vitrifikasi. Pada penelitian ini, ingin dicobakan penggunaan metode vitrifikasi yang biasa digunakan untuk pernbekuan sel telur dengan krioprotektan dasar etilen glikol (EG) (Djuwita et al.
2000, btohamad et 01. 2000). Selain itu dicobakan juga krioprotektan DMSO sebagai pembanding karena DblSO rnerupakan krioprotrktan yang serind d i ~ a k a i UR!-k pci:twkuan scl -21: ,:;ir.gcr. S;LA:J umum
serta pembckuan ovarium konvensional.
Kusdiantoro Mohamad dkk.; Vitrifikasi Ovarium Mencit Menggunakan Etilen Glikol dan DMSO sebagai
...
Metode Penelitian
Hewan Percobaan
Sebanyak 32 ekor mencit (hlus nzus~ulzcs ulbinrcs) betina strain DDY urnur dclapan minggu yang rnemiliki siklus estrus normal digunakan pada pnelitian ini. Mencit dipelihara dengan periode
1 . 7 9 : - m . 1 3 ; a m Jan A i h o r i n n k n n Ian
.
J Clr.. .-._.-. < , . - . .k i n u m ad lihtum.
Koleksi Ovarium
Ovariurn dikoleksi dengan cara ovariektorni rnelaIui bedah pungung seperti yang dilaporkan Moharnad et al. (2003). Ovarium yang telah dikoleksi dibersihkan dari sisa bursa ovari, dicuci dalam NaCl fisiologis, dibelah dua dan disimpan di atas balok es sampai saat dilakukan vitrifikasi. Pada kelornpok kontrol ovarium hasil ovariektorni langsung ditrans-
rllpnt--~;Lpn l i sr~hkan<~lla vinial.
Vitrifikasi Ovarium
Vitrifikasi ovarium dilakukan seperti metode vitrifikasi sel telur O u w i t a et al. 2000, Mohamad et u1. 2000) dengan sedikit modifikasi. Larutan untuk vitrifikasi adalah mod$ed phosphufe brcflered sulirle (rnPBS) yang mengandung serum fetus sapi (fetal
havine serum [FBS]) 20% dan krioprotektan.
Krioprotektan yang digunakan terdiri atas tiga macam yaitu etilen glikol (EG) 30%, dimetil sulfoksida (DhlSO) 30%, dan campuran EG 15% + DMSO 15%.
Ovarium dipaparkan secara berurutan dalam larutan mPBS + sukrosa 0,25 M; mPBS + sukrosa 0,5 M; mPBS + sukrosa 0,5 M + krioprotektan 10%; dan mPBS + sukrosa 0,5 M + krioprotektan 30% masing- masing selama lima menit. Lalu ovarium dikemas dalam-straw 0.5 ml, dipaparkan pada uap nitrogen cair selama 10 detik dan langsung dimasukkan ke dalam nitrogen cair. Ovarium dibiarkan di dalam nitrogen cair minimal selama 30 menit lalu dilakukan pnghangatan (manning). Straw diambil dari nitrogen cair, dibiarkan di udara selama 10 detik lalu dimasukkan ke dalam air dengan suhu 37°C sarnpai mencair. Segera straw dipotong, ovarium dikeluarkan dan dirnasukkan berturut-turut ke dalam larutan mPBS + sukrosa 0,5 M; rnPBS + sukrosa 0,25 M; dan rnPBS (3 kali) masing-masing selama lima rnenit. Selanjutnya ovarium ditransplantasikan ke subkapsu- lar ginjal pada rnencit yang sama (autotransplantasi).
Autotransplantasi Ovarium di Subkapsula Ginjal 'i'iiii-l-jP:arlfZISi ovariurn a1 czbkpsuia ginjai GI-
lakukan seprti yang telah dilaprkan oleh Mohamad ef al. (2004). Secara ringkas, ginjal dikeluarkan, p t o n g a n ovariurn disisipkan di bawah kapsula, lalu ginjal kembali dirnasukkan, dinding abdomen dan kulit dijahit, lalu diberi antihiotik untuk persembuhan.
Siklus Estrus
I'cnentuan fasc siklus dari hasil ulas vagina dllakukan mcnggunakan pcwamaan Gicmsa 10% seperti yang dilaporkan oleh Mohamad et al. (2003). Fase procstrus ditunjukkan oleh keberadaan sel-sel epitel superfisial berinti, fase estrus ditunjukkan oleh kcbcradaan sel-scl epitel superfisial yang mengalami --:tandukan (comlfied cells), lase metestrus dih-njl~k- -
kan oleh keheradaan sel-sel pertandukan dan *I-sel darah putih, dan lase diestrus ditunjukkan oleh keberadaan sel-sel darah putih.
Histologi
Untuk memastikan apakah ovarium yang ditransplantasikan merniliki folikel yang berkernbang atau tidak, maka dihuat preparat histologi. Jaringan ovariurn yang dikoleksi difiksasi dalam larutan Bouin selarna 24 jsrn. Setelah itu jaringan didehidrasi dalam alkohol, dijemihkan dalam silo!, dan ditanam dalam
- .
t r o ~ a ~ r t n . ju....gart LAayat becard d. ,.i . + = n * * r x
.,
ketebalan 5 pm. lJreparat dideparafinisasi, direhidra- si, dan diwamai dengan hematoksilin-eosin (HE).
Perlakuan dan Pengamatan
Penelitian ini terdiri atas empat kelompok, yaitu: 1) kontrol (ovarium segar, tanpa pemaparan dan vitrifikasi), vitrifikasi ovarium dengan krioprotektan 2) EG 30%, 3) DMSO 30%, dan 4) campuran EG 15% + DMSO 15%. Sernua ovarium dari keempat kelornpok tersebut ditransplantasikan di subkapsula ginjal. Setelah transplantasi, mencit diperiksa siklus estrus setiap hari. Pada hari ke-30 pasca transplantasi, mencit dimatikan, ovarium diamati keberadaamya secara rnakroskopis, kemudi- a n difiksasi d a n dibuat preparat histologi. Konfirmasi viabilitas dildkukan dengan mengamati perkembangan folikel yang krdapat pada jaringan ovarium transplan.
Analisis Data
Data disajikan secara statistika deskriptif berupa nilai rataan dan simpangan deviasi.
Hasil dan Pembahasan
Viabilitas ovarium secara rnakroskopis diarnati herdasarkan wama d a n besamya ovarium yang dapat dibedakan dari wama permukaan ginjal. Ovarium yang turnbuh tcrlihat berwama putih susu dengan permukaan menonjol. Ovarium yang tidak tumbuh terlihat sebagai jaringan parut atau tanpa hckas di pcrrnukaan ginjal. Pada kelompo)c kontrol,
, i d , , i < "vdriu111 y a t l G 2 : : ..:~z;!.--t=:i!,.zz ~c.:-.~xz;r..
Media Kedokteran Hewan Vol. 21, No. 1, Januari 2005
DMSO 30% tidak terdapat ovarium yang tumbuh (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan vitrifikasi pada penelltian ini menurunkan tinglwt viabilitas ovarium pasca warming dan transplantasi.
Penurunan viabilitas dapat disebabkan olt?h beberap faktor. Pertama, konsentrasi krioprotektan yang digunakan tidak momadai untuk mencegah
. , .
.
pembentukan kr'
.
h l ~ L ~ z a - t ~ . c - ~, - ~ ~ ~ ~ ~selama vitrifikasi tidak terdapat indikasi terbentuk- nya kristal es ekstra seluler) dan melindungi ovarium dari kerusakan selarna proses pembekuan. Kristal es intra seluler secara mekanis dapat merusak organel sel, sehngga menyebabkan kematian sel (Gao Jan Critser 2000). Kedua, waktu pemaparan yang kurane lama sehingga krioprotektan yang masuk (penetrasi) ke dalam jaringan ovarium tidak mencukupi. Ketiga, penggunaan kemasan straw 0.5 rnl rneningkatkan volume larutan dan barier antara larutan dengan nitrc."' -a:. ,?A,:-".*
.
.. . .--. ' ' .n - - . - - i n
.
. - 6 ,penurunan suhu saar VllrlrlKasl clan kecepatan pen- cairan kembali saat ujmrning. Kecepatan penurunan suhu dan pencairan kembali saat warming sangat mempengaruhi keberhasilan vitrifikasi. Pengurangan volume seperti pada teknik open pull straw ( O P S )
(Vajta ef nl. 1998) dan penghlimgan barier dari kemasan seperti pada solid surfnce vitrifcation (SSV) (Dinnyes et nl. 2000) telah berhasil meningkatkan keberhasilan vitrifikasi sel telur atau ernbrio. Penggu-
naan metode SSV pada ovarium telah dilaporkan
pada domba, dan sel telur yang dikoleksi dari ovarium beku tersebut rnampu rnencapai metafase I1
setelah kultur in vitro (Al-aghbari dan Menino 2002). Penggunean konsentrasi EG 30% dan waktu pemaparan 5 menit cukup memadai untuk vitrifikasi sel telur domba (Djuwita et nl. 2000), sel telur dan embrio mencit (Moharnad et nl. 2000). Meskipun demikian, pada pnelitian ini konsentrasi dan lama pernapaten yang sama tidakcukup untuk melindungi ovarium mencit pada saat proses vitrifikasi. Pengpnaan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 40 % telah dilaporkan sebelumnya pada vitrifikasi embrio mencit (Zhu et nl. 1993). Selain itu, p m a p a r a n yang lebih lama untuk jaringan ovarium telah dilaporkan oleh Sugimoto et a!. (2000) selarna 5 menit pada suhu kamar dan dilanjutkan 15 menit pada suhu air es. Masuknya krioprotektan EG atau DMSO ke dalam jaringan ovarium sebanyak 7040% dari konsentrasi larutan yang digunakan dicapai setelah p m a p a n selama 20-30 menit pada suhu 4°C atau 10-20 menit pada suhu 37°C (Newton et nl 1
ye)
!'an%-;-, 3MSCl sebagai krioprotektan
untuk vitrifikasi ovarium tidak menunjukkan hasil yang menggembirakan. Jika DMSO d i p n a k a n sendiri (konsentrasi 30%), maka tidak ada ovarium yang berhasil tumbuh, tvtapi jika digunakan hersma- sama dengan EG (konsentrasi masing-masing 15%)
maka scbagian ovarium herhasil bertahan hidup. Konwntrasi DMSO schesar 30% yang jauh lebih tinp,p,i j~ka diband~ngkan dengan 10% yang diguna- kan pada pmhckuan metode lambat, menunjukkan kemungkinan toksis~tas pada penggunaan DMSO sehagai krioprotektan pada proses vitrifikasi. Hal ini diperkuat dengan p n u r u n a n DM50 15% yang
. -
..,-.
,.. A.. uei3ar~~dar1 dengan EG 15% mampumenurunkan toks~sitas DMSO dan menghasilkan ovarium tumbuh.
EG [rumus kimia (CH2)2(OH)2] memiliki bobot molekul yang lebih kecil yaitu 62,07 dibandingkan dengan DMSO [rurnus kinua (CH3)2S04] yaitu 78,13 (Takeda, 1990). Dengan berat molekul yang lebih ktvil, EG dcngan mudah nwsuk dan keluar sel atau jaringan selarna proses equilibrasi dan pencairan kembali. Selain itu EG memiliki kemampuan mengikat air yang kuat, mencegah peningkatan
.
.- ... .
....-
;; - - ~ r r % ; . . A . , r l - . -. . .
-
,,. ... .- it. iadinyakristal es int;aseihler, sehingga mengurangi kerusakan
yang terjadi akibat proses vitrifikasi.
Pengamatan siklus estrus, semua mencit kontrol yang rnendapat autotransplantasi ovarium segar menunjukkan siklus estrus normal dengan waktu pehama kali siklus muncul rata-rata pada hari ke- 6.0rt1.3 pa- transplantasi dan siWus rata- rata 5 . 2 0.7 hari. Pada kelompok vitrifikasi, hanya I dari 8 (13%) ekor baik pada kelompok EG 30% maupun pada kelompok carnpuran EG 15% + DMSO 15% yang menunjukkan siklus estrus normal, yaitu masing-masing setelah hari ke-19 dart 16 &sca transplantasi dengan panjang siklus rata-rata 4.7 f 2.1 dan 7.3f 0.6 hari (Tabel 1). Sedangkan pada kelompok DMSO 30% tidak terdapat mencit yang menunjukkan siklus estrus normal.
Pengamatan histologi pada ovarium menunjuk- kan perkembangan folikel mencapai folikel antral
(de
GrnaJ) pada kelompok kontrol, EG 30%, dan EG15% +
DMSO 15% (Gambar lA, lB, dan ID). Sedangkan pada kelompok DMSO 30% tidak terdapat jaringan ovarium yang tumbuh maupun perkernbangan folikel (Gambar 1C).
Ovarium yang berhasil tumbuh pada penelitian ini rnampu menghasilkan hormon estrogen yang dimanifestasikan pada aktivitas siklus estrus. Aktivi- tas siklus estrus lebih lambat muncul pada mencit yang mendapat transplantasi ovarium vitrifikasi (hari kc16 dan 19 pasca transplantasi) dibanding mencit yang mendapat transplantasi ovarium segar
6 n-c,.o ~ ~ ~ " c , - . l - , - b Q ~ : \ u- -:1 .
..
P
ke-Kusdiantoro Mohamad dkk.; V~trifikasi Ovariurn Mencit Menggunakan Etilen Glikol dan OMSO sebagai ...
dilaporkan oleh prnelili st!l>i\lumnya (Sztcin t.t a / .
1998), yang mcnunjukkan pcrkembangan lolikcl antral (tersier) pada hari kc-30 pasc.a Lransplanlasi. Hasil ini menunjukkan bahwa n~eskipun metluliki tingkat viahilitas yang rendah akan tetapi ovarium yang berhasil hidup setelah vitrifikasi pada penelitian
ini menunjukkan morfologi normal. Hasil i ~ u
. . * '
.
I - . : . I L . l ' 'mcnlbuka p '.'-* .:: . L t L u , . L ) k . c L . , F . L . ...
pasca vitrifikasi di masa mendatang.
Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulLm bal~wa ovarium mcncit yang dihckukan dengan metode
vitrifikasi n~cn);gunakan krioprotektan EC d m campuran EC-DMSO marnpu tumbuh setelah autotranspidnlasi di subkapsular ginjal. Meskipun viabilitas sctelah 30 h a i transplantasi menunjukkan hasil yang rcndah, akan tetapi folikel yang herhasil herkenhang n~cnunjukkan morfologi normal.
T T .
" ' - -
T:asih
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departcmen Pendidikan Nasional yang telah mendanai penelitian ini melalui Hihah Bersaing X dengan kontrak kerja no. 013/LIT/BPPK-SDM/IV/2002.
Gambar 1. Morfologi ovarium mencit pada hari ke-30 pasca transplantasi di subkapsular ginjal. A. Kontrol (ovarium =gar). BD. Setelah vitrifikasi dalam berbagai jcnis dan konsentrasi krioprotektan. B. EG 30%, C. DMSO 30%, D. EC 15% + DMSO 15%. F= fulikcl, G= jaringan ginjal. Pewarnaan HE, Garis skala A,B,C & D = 80pn1
Tabel 1. Viabilitas Ovarium Hasil Vilrifikasi Menggunakan Krioprotektan Etilen Glikol (EG) dan Din~etil Sulfoksida (DMSO) Setelah Autotransplantasi Ovari Subkapsular Ginjal
P.
r , .. .,. D - --
' Kontrol (tanpaKrioprotektan
-. ...--. ~. <,---- - . . . , , . . . ?
-
. --.
Jumlah mencit
Jumlah ovarium yang ditransplantasikan
Jumlah mencit dengan ovarium tumbuh
Jundah ovarium turqbuh (96)
Jumlah mencit bersiklus normal* (%)
Waktu estrus pertama muncul (hari ke-)" Panjang siklus estrus (hari)'
minimal 3 kali periode siklus estrus, ** pasca transplantasi
- ,
8
I 6
8
16 (100)
8 (100) 6,00 f. 1,31
5,20 f 0 , n
LU JU
8
16
2
203)
1 0 3 ) 19
4,67 f 2,08
- -
- . .. -
.:,,u1.w- 4- ," 8
16
0
o(0)
o(0)
I
--
,.,,- --..,*-, ,"
.
SMSC) 1;io 816
2
3 (19)
1(13) 16
[image:6.599.110.518.441.665.2]Vol. 21,
No.
1, Januari 2005I
Daftar Pustaka
Alaghbari, A M , and A.R Menino. 2CKX Survival of occytes recovered from vitrified sheep ovarian tissues. Arum. Reprod. Sa., 7l: 701-110.
Callejo, J., MT. Jaurepi, C. Valls, M E Femandcz, S. Cabre, and J.M Lailla 1%. Heterotopic ovarian transplantation without a'.~. 2.. '"I" .'- ' . . - ' - . .,..,
I neic Lavis rats: six-month controi of estradiol a h
i
follicle-stimulating hormone concentrations after intraprritoneal and subcutaneous implants. Fertil. Steril., R: 51S517.Candy, CJ., MJ. Wood, and D.G. Whitlingham 1995. Follicular development in cryopreserved marme set ovarian tissue after transplantation H u m
I
Candy, C.J., MJ. Wood, and D.G. Whittinrhm Reprod., 1 0 23341338. 1997.I
Effect of cryoprotectants on the survival of folliclesI *
-
- --
-
L. f - ? m T:,llw o w . . .id. .!
:
*.r. d - --.,-
...19.
Deanesly, R 1957. Egg survival in immature rat ovaries grafted after f e t i n g and thawing. Proc R Soc.
Lond., 147B 4 1 2 4
Dinnyes, A., Y.
l
h
,
S. Jiang, X. Yang. 2000. High developmental rates of vitrified bovine q t e s following pthenogmetic activation in vitro, fertdimtion, and somatic cell nuclear transfer. Biol. Reprod., 63: 51S518.Quwita, L, A. M o n o , and Y. S u k r ~ 2000. Morphology and fertihation rate of vitrified ovine
oocytes matured in vitro. 7 4 International Congress
on A n i d R e p o d e StocWlolm, July 2-6.
AbstVoL 2202
Gao, D., J.K Cntser. 2000. Mechanisms of cryoinjury in living c e k ILAR J., 41: 187-1%.
Gook,D.k,B.A. McCdy, D.H. Edgar,md J.C. M c h n 2001. Development of anbal follicles in human cryopxemved ovarian tissue following x e n o g d ting. Hum. Reprod., 16: 417422
Gosden, RG., MI. Boulton, K Grant, and R Webb. 1%. Follicular development from ovarian x e n o p t s in SCID mice. J. Reprod. F e d . , 101: 61%23.
Gunasena, KT., J.RT. Lakey, P.M Vibes, M. Bush, C.
Raath, ES. Critser, L E McCann, and J.K Critser. 1998. Anbal follicles develop in xenogaftd c r y o p m e d african elephant (bxodonta a m m )
ovarian tissue. Anim Rep&. Sci., 53: 26275. Harp, R, J. hbach, J. Black, C Keldahl, and A. Karow.
4 - .
-
...-
m
*,=.
L, , ,&,", L--<:..
.,.;,:
.,i - . '.:-.Is!: ~:S"L,#. 1;*1 I I~S?'.*?.~ ~ o b i o i o g y , 31: ~ ~ ~ 3 4 3 .
Kagabu, S., and M Umezu. 2000. Transplantation of cryopmerved mouse, chinese hamster, rabbit, Japan- monkeyn and rat ovaries into rat mipients. Exp. Arum, 49: 17-21.
Mohamad, K, E. Rumiyati, F. Sari, N. Lyanah, d m I. quwita. 2000. Kriopmmasi oosit pronukleus dan m h r i o rncncit dcnp,an metodc vitrifikasi.
Abstrnk Seminm Nasional Rinlogi XVI. Bandung.
Moharnad, K, K. Budiarta, I K M Adnyane, I. Quwita, dan A. &>crliono. 2003. Sikhs estrus dan bobot uterus setelah autotransplanhi ovari secara
sd~>nuriul pada mencit yang diberi atau tanpa superovulasi. Hayati, 10: 100-105.
Mohamad, K, I.F. Ramadhian, I. Quwita, dan A. W i o n o . 2001. Pabandingan siklus estrus, bobot uterus, dan p r i d e bunting semu pada mencit yang mengalami autotransplantasi ovariurn di
subkutan dan subkapsular p;mjal. Hayati 11:76-82 Newton, H., J. Fisher, J.RP. h o l d , D.E Pep& M J .
Faddy, and RG. Gosden 1998. Permation of human ovarian tissue with cryoprotedive age,&
;
-
-
. . - C-- -,nr L- U..-. . . -- . . ---
w o a . , 13: 376380.
Parkes, A.S., and A. U. Smith. 1953. Regeneration of rat ovarian tissue grafted after exposure to low temperatures Proc R Soc. Lond., 140B: 4 5 5 4 7
MI, W.F., and G.M Fahy. 1985. Ice-free cryopreserva- tion of mouse embryos at -1%T by vitrification
Nature, 313: 573-575.
Salle, B., J. Lornage, B. Dernim, F. Vaudoyer, MT. Poirel, M Franck, RC Rudigoz, and J.F. Guerin 1999. Restoration of ovarian steroid seavtion and histo- logic assessment after freezing, thawing, and auto-
&
of hemi-0v-q in sheep. F e d Stail, 72 3637J. Shaw, J.M, A. Oranratnachai, and A.O. Trounson 2000.Fundamental cryobiology of mammahn oocytes
and ovarian tissue. Theriogenology, 53: 5 9 7 2 SuHmoto, M., S. Maeda, N. Manabe, and H. Myatnoto.
2000. Development of infantile rat ovaries a u t ~
transplanted after cryopreservation by vitrification Theriogenology, 9.10931103.
Sztein, J., H. Sweet, J. Farley, and L Mobraaten 1%. Cryopreservation and orthotopic transplantation of mouw ovaries: New approuch in gamete b&g. Biol. Reprod., 58: 1071-1074.
Takeda, T. 1990. Preparing cryoproterhnts. 111 Seidel, G.E (ed): Techruques for Freezing Mammalian Embryos. Colorado State University.
Vajta, G., P. Holm, M. Kuwayama, P.J.
Booth,
H. Jacobsen, T. Greve, and H. C a l l e n 1998. Open pulled straw (OPS) vitrihcation: a n& way to reduce cryoinjuries of bo\iiiz ova a d eirhlyos. Mol. Reprod. Dev., 51: 53%.Media Kedokteran Hewan Vol. 21, No. 1, Januari 2005
Vitrifikasi Ovarium Mencit Menggunakan Etilen Glikol dan DMSO sebagai
Krioprotektan dan Viabilitasnya Pasca Autotransplantasi di Subkapsula
Ginjal
Vitrification of Mouse Ovary Using Ethylene Glycol and DMSO as Cryoprotectant and Viability after Autografted under Kidney Capsule
Kusdiantoro Mohamad1*, ita Djuwita1, Arief Boediono1, Iman Supriatna2
'Departemen Anatomi, 2Departemen Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor; Jl. Agatis Kampus Darmaga, Bogor 16680 Indonesia Tel./Fax.:
+62-251-421823
*Korespondensi: kusm20@yahoo.com
Abstract
The aim of this study was to examine viability of vitrified mouse ovary using ethylene glycol (EG) and dimethyl sulfoxide (DMSO) as cryoprotectant. Thirty two female DDY mouse (8 weeks of age) were divided into four groups: control (fresh ovaries), 30% EG, 30% DMSO, and 15% EG + 15% HMm —lifJ.—» «»-• omo/ 'j-Vi.-.r1 Seru~\ «•"• -yc aliJ
cryoprotectant were used as vitrification solution. Ovaries were exposed with solution contained 10% and 30% cryoprotectant 5 minutes of each at room temperature, loaded in 0.5 ml straws and vitrified in liquid nitrogen (-196°C). After warming in water at 37° C, ovaries were autografted under the kidney capsule. Mouse were eximaned oestrous cycles daily and on day-30, mouse were sacrificed and ovaries were fixed for histology. Viability of ovaries were 100%, 13%, 0%, and 19 % in control, 30% EG, 30% DMSO, and 15% EG + 15% DMSO groups, respectively. Oestrous cycles were detected in 100%, 13%, 0%, and 13% mice in control, 30% EG, 30% DMSO, and 15% EG + 15% DMSO groups, respectively. Histology examination of viable ovaries showed follicles development. This result showed that ovaries vitrified in solution contained 30% EG and 15% EG + 15% DMSO as cryoprotectant could be survived after autografted under the kidney capsule.
Media
Kedokteran
Hewan
Vol.
21,
No.
1,
Januari
2005
