SKRIPSI SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA

(1)

SKRIPSI

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK

ASAM 10-

N

_{-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL}

HELA

AHMAD FATIH JAUHARI

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

DEPARTEMEN KIMIA FARMASI

SURABAYA

(2)

SKRIPSI

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK

ASAM 10-

N

_{-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL}

HELA

AHMAD FATIH JAUHARI

051111078

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

DEPARTEMEN KIMIA FARMASI

SURABAYA

(3)

LEMBAR PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N -(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Airlangga untuk kepentingan akademik sebatas sesuai Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Surabaya, September 2015

(4)

SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini, Nama : Ahmad Fatih Jauhari

NIM : 051111078 Fakultas : Farmasi

menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis dengan judul :

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM 10-N -(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA

adalah benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri. Apabila dikemudian hari diketahui bahwa skripsi ini merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sangsi berupa pembatalan kelulusan dan atau pencabutan gelar yang saya peroleh.

Demikian surat pernyataan ini saya buat untuk digunakan sebagaimana mestinya.

Ahmad Fatih Jauhari

(5)

Lembar Pengesahan

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM

10-

N

_{-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA}

SKRIPSI

Dibuat untuk memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

2015 Oleh :

AHMAD FATIH JAUHARI NIM : 051111078 Skripsi ini telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama Pembimbing Serta

(6)

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan Rahmat-Nya kepada kita semua sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Sintesis dan uji aktivitas sitotoksik asam 10-N -(benzoil) folat pada sel hela” sebagai prasyarat untuk mencapai gelar sarjana farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Skripsi ini dapat selesai berkat bantuan berbagai pihak, oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih dan apresiasi sedalam-dalamnya kepada:

1. Prof. Dr. Fasich, Apt. selaku Rektor Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

2. Dr. Umi Athijah, MS., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

3. Prof. Dr. Siswandono, MS., Apt. selaku dosen pembimbing utama saya, yang tidak mengenal lelah membantu memberikan saran, arahan, nasehat, masukan dari awal penelitian dan memberikan semangat baru dalam menghadapi skripsi ini.

4. Dr. Suko Hardjono, MS., Apt. selaku selaku dosen wali saya, sekaligus pembimbing serta, yang tidak hentinya memberikan semangat dalam penyelesaian skripsi ini serta naeshat akademik dari awal masuk perkuliahan sampai kapanpun.

5. Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, Apt. dan Dra. Suzana, M.Si., Apt. serta Drs. Achmad Toto Poernomo, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan evaluasi saran, masukan dan nasehat dalam perbaikan naskah skripsi ini.

6. Laboratorium Kimia Medisinal, Analisis, Sintesis, TDC dan Laboratorium Parasitologi FK UGM beserta seluruh stafnya terutama Pak Tukijo, Pak Yanto yang sering membantu preparasi alat, Pak Sunar, Pak Kosairi, Bu Yayuk, Pak Iwan, Bu Juana, Mas Tegar, Mbak Helen .

(7)

vi

Nu’man Elfakhri dan Muhammad Alfan Nasrullah yang selalu menemani penulis di rumah.

8. Para Kyai dan guru-guru di Darul Ulum beserta ustadz dan santrinya yang bersedia memberikan ilmu, meluangkan waktu untuk bertukar pikiran dan mendoakan penulis.

9. Seluruh teman satu lab tim proyek asam folat yang dipromotori oleh Didy Yoga beserta anggota Erwin, Aldi, Faris dan Nindya yang tiada pernah putus semangat dalam menyelesaikan proyek ini.

10. Spesial terimakasih pada seluruh angkatan Farmasi Unair 2011 beserta komponennya dari kelas A hingga kelas D, teman-teman yang pernah menjadi komting kelas Hajir, Edy, Ananto, Raihan, Primadi, Aldi, Arie yang sudah menjalankan tugas dengan maksimal dan memperjuangkan angkatan hingga saat ini.

11. Segenap teman-teman Rep. PHP Management Ayu Ratnasari, Febrianti, Meira dan Nadiyah yang selalu menemani, memberikan motivasi dan inspirasi bagi penulis.

12. Teman-teman kontrakan sehidup serumah Nana Setyawan, Zainul Amrullah, Khanzul, Rojikin, Arya Putra, Faris S, Faris K, Raihan, Aldi, Ustad Alfi, Mas Febi, Mas Riki, Mas Dhoan dan Mas Cipto dan komponen tambahan Rohman Hadi yang mengisi hari-hari selama ini dengan pengalaman baru.

13. Serta seluruh teman-teman, kakak dan adik kelas yang berada di BEM FF, ISMAFARSI, DKI dan UKMKI serta Mas Asset, Haqqum, Kresma Okky yang turut bersama berjuang, memberi bimbingan, masukan, pengalaman dan semangat baru pada penulis .

(8)

vii

Dengan segala keterbatasan, penulis belum dapat membalas kebaikan dari seluruh pihak yang terlibat baik secara langsung maupun tidak langsung, semoga Allah SWT yang membalas seluruh kebaikan kalian. Penulis menyadari dalam penyusunan skripsi ini banyak terdapat kekurangan, maka dari itu segala kritik dan saran yang membangun penulis harapkan dari berbagai pihak.

(9)

viii

RINGKASAN

SINTESIS DAN UJI AKTIVITAS SITOTOKSIK ASAM

10-

N

_{-(BENZOIL) FOLAT PADA SEL HELA}

Ahmad Fatih Jauhari

Terkait pengobatan kanker diketahui bahwa salah satunya adalah golongan anti metabolit folat. Asam folat dengan nama asam N - [ 4 - [ [ (10 – amino 1,4 – dihidro – 4 – oxo – 6 pteridinil) metil] amino] benzoil] L -glutamat dan metabolitnya (dikenal dengan folat) merupakan koenzim dari banyak transformasi biokimia esensial. Dalam rangka meningkatkan aktivitas biologis dari suatu struktur senyawa maka dilakukan modifikasi molekul atau struktur dari senyawa penuntun. Modifikasi asam folat menjadi antimetabolit folat diawali dengan membuat rancangan senyawa dimana asam folat ditambahkan gugus-gugus yang memiliki sifat lipofilik, elektronik, dan sterik tertentu. Kemudian dilakukan uji in silico , melakukan sintesis senyawa tersebut dengan metode reaksi subtitusi asil nukleofilik. Sintesis turunan asam folat pada gugus amin sekunder pernah dilakukan sebelumnya dengan subtituen trifluoroasetil. Senyawa hasil sintesis kemudian dilihat aktivitas biologisnya dengan menguji aktivitas sitotoksiknya secara in vitro pada sel HeLa dengan menggunakan metode MTT.

Tujuan penelitian ini untuk membandingkan aktivitas sitotoksik secara in silico dari senyawa asam 10-N-(benzoil)folat dengan metotreksat, memperoleh senyawa asam 10-N-(benzoil)folat melalui hasil reaksi antara asam folat dan benzoil klorida dan membandingkan aktivitas sitotoksiknya dengan metotreksat secara in vitro dengan metode MTT terhadap kultur sel HeLa.

(10)

ix

Sehingga energi ikatan antara senyawa dan dengan reseptor akan semakin interaktif, dan diprediksi aktivitasnya akan meningkat.

Hasil sintesis memperoleh cairan minyak kuning. Yang selanjutnya dicuci menggunakan benzen dan eter untuk menghilangkan sisa subtituen benzoil klorida yang tersisa. Lalu fase minyak di pisahkan menggunakan corong pisah dan diuapkan untuk mendapatkan senyawa asam 10-N -(benzoil)folat.

Uji kemurnian dilakukan metode KLT dengan 3 sistem eluen. Dari uji kemurnian senyawa asam 10-N-(benzoil)folat yang dieluasi dengan metanol: air (7:3), metanol : air (1 :1) yang dilakukan pada plat KLT RP dan acetonitril : air (3:1) pada plat KLT fase normal dihasilkan satu noda yang berbeda Rf nya dengan noda asam folat.

Uji konfirmasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri inframerah dan 1_{H-NMR. Dari hasil analisis dengan spektrofotometri}

inframerah tidak didapatkan data yang mendukung bahwa senyawa target adalah asam 10-N-(benzoil)folat. sedangkan dari hasil analisis dengan spektrofotometri 1_{H-NMR dapat disimpulkan ada 2 benzena yang}

menunjukkan senyawa yang diuji adalah asam 10-N-(benzoil)folat.

Uji sitotoksik mendapatkan dari data absorbansi dan dikonversikan menjadi % sel hidup, menunjukkan bahwa baik perlakuan dengan senyawa asam 10-N-(benzoil)folat maupun dengan kontrol positif metotreksat tidak menyebabkan adanya kematian sel yang signifikan. Hal ini dapat disebabkan oleh penggunaan metode ataupun pengaruh bahan dan komposisi bahan pada pengujian aktivitas sitotoksik dari senyawa hasil sintesis dan kontrol positif yang tidak sesuai, sehingga hasil yang diperoleh tidak dapat mendeskripsikan aktivitas sitotoksik dari senyawa hasil sintesis maupun kontrol positif.

(11)

x

ABSTRACT

Synthesis and cytotoxic activity test of 10-N- (benzoyl) folic acid on HeLa cells

In Indonesia, each year approximately 15,000 new cases of cervical cancer and 7,500 of them lead to death. In cancer cells was found that excess folic acid needs. Have been many analog of folic acid (antifolate) is used as the analog cancer chemotherapy but still have considerable side effects. So it is necessary to modify the folic acid molecule to produce another analog that is expected to provide an optimal activity but have low toxicity. Folic acid modification begins with drafting a compound where folic acid is added the groups which have lipophilic properties, electronic and steric certain. Then tested in silico to predict bond strength analogous to receptors. Then do the synthesis of these compounds with acylation method and the its analog results tested the activity with in vitro assays in HeLa cells that compared to the positive control (methotrexate) with MTT assay method. Results from in silico test shows modified compounds have lower scores rerank (potent). Results compound from synthesis is 10-N- (benzoyl)folic acid with 60% yield and proved by TLC and 1_{H-NMR spectrophotometric test. Then results}

compound from synthesis tested with MTT assay test against HeLa cell culture that compared with methotrexate at a level of 5000 ppm until 10 ppm. The result from MTT assay test can not be analyzed because the method does not show the good hindrance between 10-N- (benzoyl) folic acid and methotrexate. This research resulted in 10-N- (benzoyl)folic acid as antifolate.

(12)

xi

2.2 Tinjauan tentang Antikanker ...10

2.2.1 Antimetabolit ...10

2.2.2. Obat Antikanker yang Menghambat Kerja Hormon ...10

2.2.3. Agen Pengalkilasi DNA ...11

2.3 Tinjauan tentang Uji In silico ...11

2.3.1 Definisi Molegro Virtual docking ...11

2.3.2 Keuntungan MVD ...12

2.4 Tinjauan tentang Reaksi Substitusi Asil Nukleofilik ...12

(13)

xii

2.5 Tinjauan tentang Analisis Senyawa ...14

2.5.1 Tinjauan tentang Kromatografi Lapis Tipis ...14

2.5.2 Tinjauan tentang Spektroskopi Absorbsi ...14

2.5.2.1 Prinsip Dasar Spektroskopi Absorbsi...14

2.5.2.2 Kromofor...15

2.5.2.3 Spektroskopi Inframerah...15

2.5.2.4 Spektroskopi H1_NMR...17

2.6 Tinjauan tentang Uji In vitro ...17

2.6.1 Tinjauan tentang Kultur Sel ...17

2.7 Tinjauan tentang MTT assay ...18

2.7.1 Pengertian ...18

2.7.2 Tujuan penggunaan ...18

2.8 Tinjauan Tentang Sel HeLa ...19

BAB III KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Kerangka Konseptual ...21

3.2 Skema Kerangka Konseptual ...24

3.3 Hipotesis ...25

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.2 Alat dan Bahan Penelitian ...27

4.2.1 Alat Penelitian ...27

4.2.2 Bahan Penelitian ...28

4.3 Uji In silico Turunan Asam Folat dengan Subtituen Benzoil Klorida 28 4.3.1 Pembuatan Struktur Asam 10-N-(Benzoil)Folat ...28

4.3.2 Docking Turunan Asam Folat dengan Subtituen Benzoil Klorida ...28

4.4 Sintesis Asam Folat dengan Subtituen Benzoil Klorida ...30

4.5 Analisa Kualitatif dan Konfirmasi Struktur ...30

(14)

xiii

4.5.2 Spektrofotomeri Inframerah ...31

4.5.3 Spektrofotometri 1_{HNMR ...31}

4.6 Uji Sitotoksik Senyawa Secara In vitro dengan Metode MTT ...31

4.6.1 Prosedur Pembuatan Media ...31

4.6.2 Prosedur Menumbuhkan Sel dari Tangki Nitrogen Cair .32 4.6.3 Prosedur Penggantian Media ...33

4.6.4 Prosedur Panen Sel ...33

4.6.5 Prosedur Perhitungan Sel ...34

4.6.6 Prosedur Subkultur Sel ...35

4.6.7 Prosedur Preparasi Sampel ...35

4.6.8 Prosedur Uji Sitotoksik Metode MTT ...36

BAB V HASIL PENGAMATAN 5.1 Uji In silico ...39

5.1.1 Pembuatan Struktur Senyawa ...39

5.1.2 Hasil Preparasi Protein ...39

5.1.3 Hasil Penentuan Lubang (Cavity) ...40

5.1.4 Hasil Perolehan Nilai Docking ...41

5.1.5 Hasil Interaksi Ligan dengan Asam Amino ...42

5.2 Hasil Sintesis Senyawa asam 10-N-(benzoil)folat...43

5.3 Uji Kualitatif Senyawa Hasil Sintesis ...43

5.3.1 Pemeriksaan Organoleptis ...43

5.3.2 Uji Kemurnian Senyawa Hasil Sintesis ...43

5.3.2.1 Uji Kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis ...43

5.4 Konfirmasi Struktur Senyawa Hasil Sintesis ...45

5.4.1 Analisis Spektrofotometri FT-IR ...45

5.4.2 Analisis Spektrofotometri 1_{H-NMR ...47}

5.5 Uji Aktivitas Sitotoksik secara In vitro dengan Metode MTT ...50

(15)

xiv

5.5.2 Pemanenan Sel HeLa ...50

5.5.3 Hasil Pengukuran Absorbansi Sel HeLa yang Masih Hidup Setelah Perlakuan metotreksat ...51

5.5.4 Hasil Pengukuran Absorbansi Sel HeLa yang Masih Hidup Setelah Perlakuan asam 10-N-(benzoil)folat ...51

5.5.5 Hasil Pengukuran Absorbansi Sel HeLa pada Kontrol Sel ...52

5.5.6 Hasil Pengukuran Absorbansi Kontrol Media ...52

5.5.7 Perhitungan IC50 Metotreksat ...52

5.5.8 Perhitungan IC50 asam 10-N-(benzoil)folat ...53

BAB VI. PEMBAHASAN ...55

BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN ...61

(16)

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel V.1 Nilai doking metotreksat terhadap reseptor 1DDS

... 41

Tabel V.2. Pemeriksaan organoleptis senyawa hasil sintesis

... 43

Tabel V.3. Rf noda kromatografi lapis tipis pada tiga eluen berbeda

44

Tabel V.4 Karakteristik spektrum inframerah senyawa asam folat

.. 46

Tabel V.5 Karakterisasi spektrum 1_{H-NMR senyawa asam folat}

_{.... 48}

Tabel V.6 Karakterisasi spektrum 1_{H-NMR senyawa hasil sintesis}

_{. 48}

Tabel V.7 Penimbangan dan pengambilan bahan

... 50

Tabel V.8. Hasil absorbansi perlakuan dengan senyawa metotreksat

51

Tabel V.9. Hasil absorbansi perlakuan dengan senyawa asam 10

-N-(benzoil)folat

... 51

Tabel V.10 Hasil absorbansi kontrol sel

... 52

Tabel V.11 Hasil absorbansi kontrol media

... 52

Tabel V.12 Tabel perhitungan % sel hidup pada perlakuan

metotreksat

... 53

Tabel V.13 Tabel perhitungan % sel hidup pada perlakuan asam 10

(17)

xvi

Gambar 1.3 Struktur asam 10-N-(trifluoroasetil)folat yang pernah disentesis. ... 5

Gambar 2.1 Siklus Sel dalam Tubuh (Bolsover, et al., 2004) ... 9

Gambar 2.2 Interaksi folat dengan reseptor ...10

Gambar 2.3 Substitusi Asil Nukleofilik ...13

Gambar 2.4 Mekanisme Reaksi Substitusi Asil Nukleofilik pada Asam Folat ...13

Gambar 2.5 Skema Spektra Absorbsi ...15

Gambar 2.6 Daerah inframerah dari spektra elektromagnetik ...15

Gambar 2.7 Absorbsi IR dari Beberapa Gugus Fungsi ...16

Gambar 3.1 Skema Kerangka Konseptual ...24

Gambar 4.1 Kerangka Operasional Penelitian ...26

Gambar 4.2 Gambar (a) adalah struktur reseptor dihydrofolate reductase 1DDS sedangkan Gambar (b) adalah gambar ligannya yang mengandung gugus farmakofor diaminopirimidin (Molegro Virtual docking) ...29

Gambar 4.3 Hemasitometer terdiri dari 4 kamar hitung. Setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak ...34

Gambar 5.1 Gambar (a) adalah struktur 2D asam 10-N-(benzoil)folat, gambar (b) adalah struktur 3D dari asam 10 -N-(benzoil)folat, gambar (c) adalah struktur 2D metotreksat, dan gambar (d) adalah struktur 3D metotreksat (chembiodraw) ...39

(18)

xvii

Gambar 5.3 Cavity pada reseptor DHFR 1DDS ...40

Gambar 5.4 Cavity 1 reseptor 1DDS terdapat gugus farmakofor dari ligan asal reseptor dan ligan senyawa yang akan

disintesis. ...41

Gambar 5.5 Gambar ikatan hidrogen (biru) senyawa metotreksat beserta jenis protein yang terikat pada saat proses doking. ...42

Gambar 5.6 Gambar ikatan hidrogen (biru) senyawa asam 10

-N-(benzoil)folat beserta jenis protein yang terikat pada saat proses doking. ...42

Gambar 5.7 Spektrum inframerah senyawa asam folat dalam pelet KBr ...45

Gambar 5.8 Spektrum inframerah senyawa hasil sintesis dalam pelet KBr ...46

Gambar 5.9 Spektrum 1_{H-NMR senyawa asam folat dalam pelarut}

DMSO. ...47

Gambar 5.10 Spektrum 1_{H-NMR asam 10}_-N-_{(benzoil)folat dalam pelarut}

(19)

xviii

DAFTAR SINGKATAN

2D 2 dimensi

3D 3 dimensi

DHFR Dihidrofolat Reduktase

DMSO Dimetilsulfoksida

DNA Deoxyribonucleic Acid

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FBS Fetal Bovine Serum

FT-IR Fourier Transform Infrared

1_H-NMR _{Proton Nuclear Magnetic Resonance}

HDAC Histon Deasetilase

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-10-il)-10-5-difeniltetrazolium bromida MTX Methotrexate

MVD Molegro Virtual Docker

PBS Phospat Buffer Saline

RNA Ribonucleic Acid

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

WHO World Health Organization

(20)

xix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

LAMPIRAN 1. Perhitungan bahan sintesis ...67

LAMPIRAN 2. Prosedur sintesis ...68

LAMPIRAN 3. Perhitungan Hasil Sintesis ...69

LAMPIRAN 4. Pengaturan Docking Score ...70

LAMPIRAN 5. Penentuan nilai pKa Asam Folat Menggunakan Maestro (Schrodinger) ...71

LAMPIRAN 6. Konfirmasi Struktur Senyawa Metotreksat dengan FT-IR .72 LAMPIRAN 7 .Konfirmasi Struktur Senyawa Hasil Sintesis dengan FT-IR ...74

LAMPIRAN 8. Konfirmasi Struktur Asam Folat dengan 1H-NMR dalam Pelarut DMSO ... 75

LAMPIRAN 9. Konfirmasi Struktur Senyawa Hasil Sintesis dengan Spektrum 1H-NMR dalam pelarut DMSO ...78

LAMPIRAN 10.Denah Platting Uji Sitotoksik dengan metode MTT Menggunakan Plate 96 Sumuran ...81

LAMPIRAN 11.Gambar Alat dan Bahan Uji Sitotoksik ...82